动物医学进展,021,2(2):117121
ProgressinVeterinary Medicine
免疫层析技术研究及应用
刘畅，杨琳燕，王艺霞，张伟，李道稳，李留安，李存*
（天津农学院动物科学与动物医学学院/天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室，天津300392）
摘要：免疫层析技术（ICA）是一种将色谱原理和抗原抗体反应相结合的快速检测技术，在兽药残留检测、环境监测、疾病诊断等多个方面都有应用。为提高传统胶体金方法的灵敏度，荧光材料、磁性纳米颗粒等新型的标记材料逐渐应用到ICA中，生物素-亲和素系统、贵金属也有信号放大的作用，有助于降低检测限。定量分析仪器的应用促使ICA的结果判定方式发生改进，可以进一步满足定量检测的需要。标记材料的变化和分析仪器的应用推动ICA方法向高灵敏度和定量检测的方向发展。论文就ICA标记材料的变化和发展趋势以及该技术在兽药残留检测、食品安全、动物疾病诊断方面的应用进行概述。
关键词：免疫层析技术；标记材料；发展趋势；应用
中图分类号：S854.43；S852.43文献标识码:A文章编号：1007-5038（2021）02-0117-05
免疫层析技术（immunochromatographic analysis,ICA、始于20世纪后期，是一种将色谱层析和免疫技术相结合的快速检测技术［1］。由于检测周期短、成本低、对仪器设备和人员没有特殊要求，ICA 在即时检测（point-ofcare testing,POCT）方面发挥着不可替代的作用，发展前景广阔，其中最经典的一种标记检测技术是胶体金ICA2。随着纳米技术的发展和新材料的应用，ICA技术不断创新变革，将具有更广泛的应用范围和更广阔的开发前景。
1ICA技术简介
1.1ICA技术原理
以胶体金为例，ICA以胶体金标记抗原或抗体，层析过程中，胶体金标记物随样品溶液通过毛细作用在试纸条上移动，与测试线（test line,T线）上相应的受体结合，聚集后显红棕色［］。T线的颜色深浅反映了样品中待测物的含量。同时设质控线
收稿日期：2020-03-20
基金项目：国家自然科学基金项目（31372482）；天津市“131”创新型人才团队项目（20180318）
作者简介：刘畅（1995—），女，河北石家庄人，硕士，主要从事兽医药理学与毒理学研究。*通讯作者
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A New Broad-spectrum Incticide of Isoxazoline—Fluralaner
HUANG Ming-xin,XIE Yue,YANG Guang-you
(College of Veterinary Medicine Sichuan Agricultural UniversiLy,Chengdu, Sichuan,611130,China)
Abstract:Fluralaner is a new broad-spectrum veterinary drug belonging to isoxazoline incticides.This incticide isane f ectiveinhibitorofligand-gatedchloridechannelandL-glutamicacidinneuronsandhaslectivityforneu-rons of arthropods and mammals Fluralaner di f ers from other incticides in molecular structure，site of action，-lectivity and cross-resistance，with mammal safety and high incticidal activity In recent years，fluralaner has been successfu l yudagainstectoparasitesofdogsorcatsinclinic Thisarticlereviewedrearchprogressofthisdrug forprovidingthebasicinformationforitsapplicationinfuture
Key words fluralaner；ectoparasite；pesticide
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(control line,C线)，验证检测结果是否有效。
职称述职报告
根据待测分子的大小和结合方式,ICA可分为夹心法和竞争法⑵。夹心法是指待测抗原的不同表位分别与两种抗体结合，在试纸条上形成抗体1-抗原-抗体2夹心结构⑷，适用于大分子待测物。竞争法一般用于小分子,T线用待测抗原或抗原类似物处理，它与待测物竞争结合标记抗体，所以T线颜色强度与待测物的含量成反比5。
1.2ICA的发展趋势
1.2.1灵敏度提高高灵敏度、定量检测和多元检测是ICA技术的发展趋势［］。免疫标记材料是影响灵敏度的一个重要因素。胶体金是应用最早、应用最广泛的标记材料，但灵敏度偏低7。量子点(quantum dot,QD)［］、时间分辨荧光微球(time-re-solved fluorescent microsphere,TrFM)［］以及磁性微球(magnetic bead,MB)［10］等新型标记材料的出现使得ICA的灵敏度不断提高。Lu T等［11］以胶体金和qd作为信号标签，分别建立了两种检测n型志贺毒素的ICA方法，胶体金ICA的检测限为25 ng/mL,QD ICA方法为5ng/mL，灵敏度明显高于胶体金方法。
生物素-亲和素系统(biotin avidin system, BAS)［12］、贵金属［3、脂质体⑷等信号放大系统的应用也对ICA技术灵敏度的提高起到了积极作用。BAS亲和力极强，有信号放大作用，可与蛋白等生物分子结合而不破坏其活性。Serebrennikova K V 等［12］依靠BAS提高了胶体金ICA的灵敏度，其灵敏度比常规胶体金方法提高了4倍。Anfossi L 等8制备了CdSe QD，以金、银纳米粒子作为淬灭剂，建
立了检测玉米粉中伏马菌素的ICA方法。通过淬灭剂的作用，荧光信号随伏马菌素的含量成倍变化，检测限范围在1.56ng/mL〜6.25ng/mL之间，比普通方法低4倍。
1.2.2半定量、定量检测ICA的半定量、定量方法也在逐步发展。Serebrennikova K V等［14］同时用3个不同浓度的金标抗体包被试纸条T区，制成多范围梯度的ICA，可快速实现降钙素原的半定量测定。Zhang X等［15］分别将赭曲毒素A(ochratoxin,OTA)和玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)的结合抗原喷涂在NC膜上，建立胶体金ICA方法，借助便携式读卡器能够同时对玉米、小麦和饲料中的OTA.ZEN进行定量。HanMM等［16］构建了可同时检测牛奶中的黄曲霉毒素M1(Aflatoxin M1, AFM1)、三聚氰胺以及6种抗生素的胶体金检测卡，拍照后用Image J软件分析能够得到半定量结果。LiX M等［7开发了一个Android应用程序，可以快速定量玉米和饲料中ZEN的ICA分析结果，并且支持检测结果共享。荧光定量阅读器［18］、磁信号阅读［19］等仪器可用于量化检测结果，自动化程度高，结果客观、准确。
1.2.3层析材料的变化常用的ICA常用聚酯纤维、玻璃纤维、尼龙膜等作为固定材料，现在的固定材料以硝酸纤维素膜(nitrocellulo filter membrane,NC膜)居多。NC膜对生物大分子的吸附性强4，性质稳定，便于保存；亲水性好，样品溶液可以在膜上快速层析，从而实现快速检测。有些公司已经开发一体化材料，同时作为样品垫、结合垫、固定膜和吸水垫，推动免疫层析技术朝着更加简便的方向发展。
孕妇能用电热毯吗2ICA标记材料的分类
2.1胶体金
胶体金是用氯金酸溶液制成的稳定的胶体溶液。胶体金技术的原理是用胶体金为标记材料，随着抗原抗体反应的进行，胶体金在NC膜的T线集聚并显出红棕色3。具有操作简便、迅速，不依赖任何仪器的特点。然而，由于灵敏度不够理想，胶体金法一般用于对目标物的初筛检测。Serebrennikova KV等［4在传统胶体金方法的基础上进行改进，制得直径为100nm的纳米金花并将其用于ICA，方法的灵敏度提高了5倍。ZengYY等用生物素和链霉亲和素对金纳米颗粒进行双标记，构建了一种带有荧光背景阻断的新型胶体金ICA方法。该方法对于猪尿液中克仑特罗的检测限为0.03g g/L，灵敏度比传统的胶体金方法提高了60倍。
2.2荧光标记材料
荧光ICA是以荧光材料标记抗原或抗体，待测物与之结合后形成带有荧光标记的免疫复合物，通过测定免疫复合物的荧光含量即可推算待测物的浓度。荧光ICA方法的背景干扰小，灵敏度高；缺点是检测结果肉眼不可见，需要与相关仪器联用，而且荧光存在自然淬灭现象，保存成本较高［11］。
2.2.1量子点量子点(QD)主要由nB族〜巾A 族或皿A族〜VA族元素构成，是能够产生荧光的半导体纳米
颗粒。QD具有优良的标记特性和光化学稳定性，激发光谱宽、发射光谱窄，荧光强度高［2］，是一种很好的标记材料。Huang Z等针对猪尿液中的克仑特罗，在磁珠表面组装QD，在此基础上建立了一种灵敏度高、耐基质干扰的克仑特罗ICA检测方法。QD可单独作为一种标记材料,
刘畅等：免疫层析技术研究及应用119
与MNP材料同时使用能够简化制备过程，同时结果判定方式变得多样化。XieSL等［18］使用不同的CdSe/ZnS QD建立了一种能够同时检测鸡肉中金刚烷胺和氯霉素的定量ICA方法。分析结果与市售ELISA试剂盒检测结果相符，对于金刚烷胺和氯霉素的检测限分别为0.18ng/g和0.016ng/g。2.2.2时间分辨荧光微球时间分辨荧光微球(time-resolvedfluorescent microsphere，TrFM)由
稀土元素构成，表面有丰富的官能团可用来偶联抗体，Stokes位移大，荧光效率高［4］。Stokes位移是指荧光光谱较相应的吸收光谱红移，是最大荧光发射波长与最大吸收波长之间的差值。较大的Stokes位移能够增强荧光材料的抗干扰能力，提高信噪比，有助于提高检测的灵敏度［5］。LiX M 等9利用胶体金、乳胶微球和TrFM作为抗体标记示踪剂，分别建立了3种检测牛奶和猪肉中泰乐菌素和替米考星残留的ICA方法。其中以TrFM为标记物的方法灵敏度高、制备成本较低、抗体消耗量少，有希望用于现场检测和大批量样本筛选。
2.2.3上转换纳米颗粒上转换纳米颗粒(upcon-versional nanoparticles,UCNP)由稀土金属元素掺杂惰性
氧化物构成，在近红外光激发下表现出强荧光［6］，抗光漂白能力强，背景干扰小，发光寿命长，具有天然材料所不具备的优点。但UCNP 的量子产率很低，在实际应用中受限制［8］。李丹阳等使用磷酸化的黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1, AFB1)适配体包裹UCNPs，结合ICA方法快速定性并定量花生中的AFB1，检测限为2.4ng/mL，结果准确，具有潜在的实用价值。点睛的拼音
2.3磁性纳米颗粒
以Fe3O4为代表的磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles,MNP)是近些年发展起来的一种新型标记物。普通ICA通过T线的颜色强度反映待测物含量，但肉眼或读卡器只能观察记录NC膜表面约10p m厚度的颜色信号。如果以MNP为ICA 的标记材料，磁信号阅读器能够对整个NC膜上(约150p m厚)MNPs的磁场进行定量［5］；而且，一般生物样品中不含磁信号，背景信号低，因此灵敏度更高。MNP也促进了ICA由定性向定量发展，使检测过程更加快速、准确、高效。MuX H等［19］以MNP为标记材料，用磁敏传感器检测试纸条上相应位置的磁场强度，建立了一种检测蓖麻毒素的ICA方法，该方法克服了样品背景色的干扰，检测限为1ng/mL，能够满足水、土壤和食物等模拟样品的检测要求。Wang C等［9］建立了可准确测定血清中非结合雌三醇的MNP ICA方法，磁信号稳定，结果与TrFM ICA方法有较好的相关性。
3免疫层析技术的应用
3.1兽药残留检测
兽药残留问题与人体健康和环境安全息息相关，虽然我国对兽药的休药期和残留限量作了规定，但兽药的不规范使用、非法滥用现象依然存在。ICA技术对仪器的依赖性小，数分钟内即可观察检测结果，适合即时检验(point-ofcare testing, POCT)和大批量样本初筛。顾娟红等制备了金磁复合微粒，并以此为标记物实现对盐酸克伦特罗
和莱克多巴胺的定性、定量检测。对于二者的检测限分别为025ng/mL和05ng/mL，特异性良好金磁复合微粒兼有MNPs的磁性和纳米金的光学性质，检测结果既可以眼观，也可通过磁定量分析仪快速定量，灵敏度比传统的胶体金方法有所提高。郭会灿［1］采用QD ICA技术快速检测4种硝基咲喃类代谢物，对3-氨基2-恶唑烷酮、1-氨基2-乙内酰、氨基脲和5-甲基吗啉3-氨基2-坐烷基酮的检测限分别为0.4、0.4、0.5、0.5gg/L，交叉反应率在0.1%以下，能够满足常规检测的要求。兽药残留一般采用竞争性ICA检测，T线变浅或消失意味着样品呈阳性。相比于消色，显色无疑是一种更灵敏的方式,Sheng W等［2］以ZnCdSe/ZnS QDs作为荧光标记，金纳米粒子作为淬灭剂，建立了一种检测四环素类抗生素的ICA方法，在紫外灯照射下，T线的荧光强度与待测物含量成正比，该方法对于牛奶和动物肌肉组织中四环素类抗生素的检测限分别是20gg/L和40gg/kg。
3.2食品安全检测
玉米赤霉烯酮(ZEN)黄曲霉毒毒B1(AFB1)等霉菌毒素一般存在于霉变的农作物中，动物源性食品中也常有检出，采用ICA技术可以灵敏、快速的检出食品中的霉菌毒素和其他有害物质。何方洋等［33］建立了检测谷物中ZEN的胶体金ICA法，方法的检测限为100g g/kg，灵敏度为99%，特异性为94%。Yao X L等以MNP作为信号标签建立了一种用于检测食品中17—雌二醇(17-estradiol, E2)的新型ICA方法，对于牛奶、对虾、鱼类和鸡肉中17—雌二醇的最低检测限是0.4ng/mL。沙志聪等［7］采用QD标记的ICA检测谷物中的赭曲霉毒素A，该方法的特异性良好，结果准确，检测限为0.5g g/L。激素类药物有利于动物的生长和繁育，但食品中激素残留超标可能导致人体的激素代谢紊
120动物医学进展2021年第42卷第2期(总第332期)
乱或引起其他疾病。Yao X L等以游离的抗17 -雌二醇单克隆抗体作为检测抗体,MNP标记的山羊抗小鼠IgG作为间接信号探针，建立了一种用于检测食品中E2的新型ICA方法，对牛奶、对虾、鱼类和鸡肉中E2的最低检测限是0.4ng/mL，灵敏度是常规竞争性ICA方法的5倍。
3.3动物疾病诊断
病原微生物入侵动物机体后能够刺激机体产生抗体，利用该原理可以对抗原进行检测，诊断动物疾病。肖妍等[5]建立了一种检测奶样中布鲁氏菌抗体的免疫层析方法，敏感性9&0%，特异性96.0%，与其他常见病原无交叉反应，适用于大批量样本的筛选检测和奶牛场布鲁氏菌病的快速诊断。Ban H
等[6]建立了一种用于检测猪流行性腹泻病毒的胶体金ICA方法，检测限为0.47g g/mL(5.9X103 TCID50/mL)，与其他猪病病毒无交叉反应。
4小结
ICA检测过程简便、快速，在兽药残留、食品安全、环境监测以及动物疾病诊断等领域表现出独特优势。高灵敏度、定量和高通量检测是ICA方法的发展趋势。荧光材料、MNPs和脂质体等开始代替胶体金，新型材料的使用对于灵敏度的提高有积极作用。ICA结果的评价方式也随着检测需求而变化，既可以通过肉眼观察直接定性，也可以使用荧光定量仪、磁阅读器或相关软件准确定量。随着新型标记材料的发展和定量分析仪器的应用，ICA技术也会得到巨大的提升，在POCT方面发挥更重要的作用。
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ood safety and animal dia diagnosis were summarized. Keywords:lateralflowimmunoassay；labeling material；developmenttendency；application银鱼炒蛋的做法
