动物营养学报2019,31(5):2222⁃2231ChineseJournalofAnimalNutrition
㊀
doi:10.3969/j.issn.1006⁃267x.2019.05.029
饲粮蛋白质水平降低对成年大鼠生长性能㊁
氮平衡和骨骼肌蛋白质周转的影响
刘㊀璐㊀楚丽翠㊀曾祥芳㊀谯仕彦∗
(中国农业大学动物科技学院,动物营养学国家重点实验室,北京100193)
摘㊀要:本试验旨在研究饲粮蛋白质水平降低对成年大鼠生长性能㊁氮平衡和骨骼肌蛋白质周转的影响㊂试验选取35只初始体重为(238.6ʃ2.3)g的成年SD雄性大鼠,根据体重相近原则分为5组,每组7个重复,每个重复1只大鼠㊂5组大鼠分别饲喂含有20%(20%C,此为AIN⁃93G标准饲粮)㊁15%(15%C)㊁10%(10%C)㊁5%(5%C)和0酪蛋白(0C)的5种试验饲粮,并根据AIN⁃93G推荐量补充各种必需氨基酸㊂试验期12d,并在试验第6 11天收集
大鼠粪尿以测定氮平衡㊂在试验第12天早晨对大鼠空腹称重,并一次性腹腔注射L-苯丙氨酸(注射剂量为1.50μmol/gBW,其中含有0.60μmol/gBW的L⁃[ring⁃2H5]苯丙氨酸),腹腔注射30min后眼眶静脉采血,然后将大鼠处死,取后肢的腓肠肌和比目鱼肌㊂结果显示:1)当酪蛋白含量从20%降至15%并添加各种合成氨基酸后,成年大鼠的平均日增重上升了42.2%(P<0.05),但进一步降低酪蛋白含量并添加各种合成氨基酸后,大鼠的生长受到抑制,体重呈线性下降(P<0.05)㊂2)大鼠的干物质采食量在酪蛋白含量低于10%时显著下降(P<0.05),氮摄入量㊁氮排出量㊁氮沉积量以及氮沉积率也显著下降(P<0.05)㊂3)在腓肠肌中,与20%C组相比,10%C组㊁5%C组和0C组肌肉蛋白质合成速度分别下降了18.25%㊁33.65%和40.68%(P<0.05),蛋白质降解速度分别提高了17.54%㊁29.82%和35.09%(P<0.05);在比目鱼肌中,15%C组㊁10%C组㊁5%C组和0C组大鼠蛋白质合成速度均比20%C组显著下降(P<0.05),分别下降了9.00%㊁11.55%㊁29.15%和33.99%,5%C组和0C组蛋白质降解速度比20%C组显著增加(P<0.05),分别升高了27.66%和57.45%㊂由此可见,在按标准需要量逐级补充所有必需氨基酸的条件下,当成年大鼠饲粮酪蛋白含量低于10%时,大鼠生长受到抑制,体重下降,氮沉积量减少,骨骼肌蛋白质合成减少㊁降解增加㊂因此,在以酪蛋白为唯一氮源的情况下,成年大鼠饲粮中酪蛋白含量降低至15%较适宜㊂
关键词:蛋白质水平;成年大鼠;生长性能;氮平衡;蛋白质周转
中图分类号:S816㊀㊀㊀㊀文献标识码:A㊀㊀㊀㊀文章编号:1006⁃267X(2019)05⁃2222⁃10收稿日期:2018-11-05
基金项目:现代农业技术体系北京市生猪创新团队
作者简介:刘㊀璐(1995 ),女,河南商丘人,硕士研究生,研究方向为动物营养与饲料科学㊂E⁃mail:815629388@qq.com∗通信作者:谯仕彦,教授,博士生导师,E⁃mail:qiaoshiyan@cau.edu.cn
㊀㊀动物的营养状态会显著影响机体的生长,细胞的增殖㊁能量的储存以及肌肉的发育等生理过程都离不开营养物质的参与[1]㊂随着饲料资源日益短缺,如何提高畜禽蛋白质饲料的利用效率以节省饲料资源,逐渐成为国内外学者近些年来的
研究热点㊂降低饲粮蛋白质水平,不仅可以减少氮排放,同时还可以节约生产成本,但在以大鼠为模型的试验中关于低蛋白质饲粮对生长性能的影响诸多报道中结论各异㊂Swick等[2]研究了饲粮蛋白质水平(5%和15%酪蛋白)对成年大鼠
5期刘㊀璐等:饲粮蛋白质水平降低对成年大鼠生长性能㊁氮平衡和骨骼肌蛋白质周转的影响
(300g)生长速度的影响,发现大鼠对低蛋白质饲粮的采食量比高蛋白质饲粮高15%,但体增
初级职称评定条件
重下降了28%㊂Masanés等[3]扩大酪蛋白添加量的梯度(9.5%㊁20.0%和36.0%)后发现,饲粮酪蛋白含量降至9.5%时,得到了类似的生长性能结果㊂但Ward等[4]研究发现,生长大鼠采食15%和25%酪蛋白的饲粮,其生长速度和氮沉积量未见显著差异㊂另有Howarth[5]以断奶仔鼠为试验对象,研究不同饲粮酪蛋白含量对大鼠机体生长和肌肉生长的影响,结果发现,6%㊁12%和18%酪蛋白饲粮组大鼠的末重和腓肠肌重量显著低于24%酪蛋白饲粮组,当酪蛋白添加量降低至0时,甚至出现大鼠的末重和肌肉重比初始重量下降的现象㊂这些结果的差异可能是饲粮蛋白质降低水平与必需氨基酸的外源添加不同步所致㊂因此,本试验的目的在于,通过给成年大鼠饲喂酪蛋白含量分别为20%㊁15%㊁10%㊁5%和0的饲粮,并按AIN⁃93G标准需要量逐级补充所有必需氨基酸,研究饲喂低蛋白质水平但氨基酸平衡的饲粮对成年大鼠生长性能㊁氮平衡和骨骼肌蛋白质周转的影响,从而为低蛋白质饲粮在畜禽方面的应用提供数据参考㊂
1㊀材料与方法
1.1㊀试验动物与饲粮
㊀㊀本试验选取35只13周龄㊁体重为200 300g的成年SD雄性大鼠,购于北京实验动物中心㊂大鼠购回后,先进行为期5d的适应期,饲喂普通基础饲粮㊂试验开始后饲喂试验饲粮,5种试
验饲粮分别含有20%(20%C,此为AIN⁃93G标准饲粮)㊁15%(15%C)㊁10%(10%C)㊁5%(5%C)和0酪蛋白(0C),其他营养水平均满足AIN⁃93G营养需要量[6-7],并参照此需要量分别在各组中添加适宜种类和数量的合成氨基酸㊂5种试验饲粮组成及营养水平见表1㊂饲粮制粒在北京科奥协力饲料有限公司完成㊂
表1㊀试验饲粮组成及营养水平(饲喂基础)
Table1㊀Compositionandnutrientlevelsofexperimentaldiets(as⁃fedbasis)%
销售开场白
项目Items
酪蛋白含量Caseincontent/%
20151050
原料Ingredients
玉米淀粉Cornstarch53.8358.6162.1364.5366.97酪蛋白Casein20.0015.0010.005.00
蔗糖Sucrose9.009.009.007.506.50大豆油Soybeanoil7.007.007.007.007.00纤维素Cellulose5.005.005.006.507.50矿物质预混剂Mineralpremix1)3.503.503.503.503.50维生素预混剂Vitaminpremix2)1.001.001.001.001.00L-赖氨酸盐酸盐L⁃Lys㊃HCl0.280.721.16
L-精氨酸L⁃Arg0.120.290.44L-苏氨酸L⁃Thr0.050.240.440.63L-色氨酸L⁃Try0.020.040.090.150.21DL-蛋氨酸DL⁃Met0.400.550.700.851.00L-亮氨酸L⁃Leu0.220.671.10L-异亮氨酸L⁃Ile0.180.410.64L-缬氨酸L⁃Val0.160.460.76L-组氨酸L⁃His0.010.150.29L-苯丙氨酸L⁃Phe0.120.581.05氯化胆碱Cholinechloride0.250.250.250.250.25合计Total100.00100.00100.00100.00100.00营养水平Nutrientlevels3)
干物质DM0.850.880.870.900.90
3222
孕初期㊀
动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报31卷续表1
项目Items
酪蛋白含量Caseincontent/%
20151050
粗蛋白质CP17.2713.6110.298.246.17
总能GE/(MJ/kg)16.5716.6416.8816.3016.70
钙Ca1.321.311.311.321.33
总磷TP0.360.350.350.360.35
赖氨酸Lys1.401.040.920.910.90
精氨酸Arg0.610.470.440.430.44
苏氨酸Thr0.730.620.610.630.63
色氨酸Try0.240.200.190.210.19
蛋氨酸+半胱氨酸Met+Cys0.990.970.991.020.96
亮氨酸Leu1.741.291.091.071.08
异亮氨酸Ile0.890.650.620.630.59
缬氨酸Val1.170.880.740.750.76
组氨酸His0.540.410.290.270.28
苯丙氨酸Phe1.831.371.031.041.02
㊀㊀1)矿物质预混剂可为每千克饲粮提供Mineralpremixprovidedthefollowingperkgofdiets:Cu5mg,Fe50mg,Mn50mg,Zn50mg,I0.15mg,Se0.15mg,Ca13g,P0.36g,Mg0.5g,K3.6g,NaCl3.6g㊂
㊀㊀2)维生素预混剂可为每千克饲粮提供Vitaminpremixprovidedthefollowingperkgofdiets:VA4000IU,VD1000IU,VE150mg,VK1mg,硫胺素thiamine6mg,VB66mg,烟酸nicotinicacid30mg,叶酸folicacid2mg,D-泛酸钙D⁃calciumpantothenate16mg,VB120.25mg,生物素biotin0.2mg㊂
㊀㊀3)营养水平为实测值㊂Nutrientlevelswereallmeasuredvalues.
1.2㊀饲养管理
㊀㊀本试验在农业部饲料效价和安全评价监督检验测试中心(北京)鼠营养代谢室进行,试验鼠房为万级清洁实验室㊂大鼠饲喂在控温和控湿的房间内,温度为(20ʃ2)ħ,相对湿度为(45ʃ10)%㊂光照制度为昼夜光照交替12hʒ12h,大鼠单个饲喂在代谢笼(0.3mˑ0.3mˑ0.3m)内,粪和尿分开收集,自由采食和饮水㊂
1.3㊀试验设计和样品采集
㊀㊀选取35只体重为(238.6ʃ2.3)g的成年SD雄性大鼠,按体重相近的原则随机分为5
组(每组7个重复,每个重复1只大鼠),分别饲喂5种试验饲粮㊂试验期12d㊂在试验第1天和第12天早晨分别进行空腹称重,计算生长性能㊂
㊀㊀于试验第6天08:00开始收集粪尿,至第11天08:00结束,共5d㊂收集期间准确记录大鼠的采食量,每日将收集到的粪便称重,并储存于-20ħ冰箱待分析㊂收集期结束后,将所有粪便混匀后进行冷冻干燥㊁粉碎和分析㊂同时,收集期内将每日收集到的尿液用量筒测量体积,记录排尿量㊂按照尿量的5%(体积比)加入10%硫酸(98%的硫酸与水以体积比1ʒ9混合)固氮,将每日的尿液保存于4ħ冰箱,收集期结束后将所有尿液混匀并取样待测㊂
㊀㊀收集期结束后,在第12天08:00进行空腹称重㊂称重后,根据大鼠体重,大剂量一次性腹腔注射1.50μmol/gBWL-苯丙氨酸(用生理盐水溶解),其中含有0.60μmol/gBW的L⁃[ring⁃2H5]苯丙氨酸,腹腔注射在5 10s内完成㊂腹腔注射30min后,大鼠通过戊巴比妥钠麻醉,眼眶静脉采血于真空采血管,4ħ㊁2000r/min离心25min,分离血清,-70ħ冻存备用㊂采血后,将大鼠颈部脱臼处死,采集后肢的比目鱼肌和腓肠肌样品,放入液氮中冷冻,之后于-70ħ冻存备用㊂1.4㊀检测指标和方法
1.4.1㊀饲粮成分
㊀㊀饲粮干物质㊁粗蛋白质㊁钙和磷含量及总能的检测方法参照AOAC(2000)中方法㊂
㊀㊀饲粮氨基酸含量的检测:试验饲粮样品粉碎后分别在110ħ下经6mol/L盐酸水解24h和0ħ下经过甲酸氧化16h后再经盐酸水解24h,用氨基酸自动分析仪(L-8800型,日立公司,日
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5期刘㊀璐等:饲粮蛋白质水平降低对成年大鼠生长性能㊁氮平衡和骨骼肌蛋白质周转的影响
本)测定15种氨基酸和含硫氨基酸含量;试验饲粮样品粉碎后用4mol/L氢氧化钠在110ħ下水解22h后,使用高效液相色谱仪测定色氨酸含量㊂1.4.2㊀生长性能
㊀㊀在试验第1天和第12天早晨分别对大鼠进行空腹称重,并准确记录试验期大鼠的采食量,计算大鼠在整个试验期的干物质采食量㊁平均日增重和料重比㊂
美国小说1.4.3㊀氮平衡
㊀㊀粪样和尿样中氮的含量测定方法参照AOAC(2000),根据平均日采食量㊁日排粪量和日排尿量计算大鼠每日氮摄入量㊁氮排出量和氮沉积量,并计算氮沉积率㊂
氮沉积率=100ˑ氮沉积量/氮摄入量㊂1.4.4㊀血清中游离氨基酸浓度
㊀㊀移取0.5mL血清样品于5mL离心管中,加入1.5mL的10%磺基水杨酸和0.175mL锂稀释液,振荡混匀后,冰上静置20min,取上清液2mL于4ħ㊁50000r/min离心30min,取上清液用0.1μm滤膜过滤,装入上机小瓶中,上机,根据茚三酮柱后衍生测定血清游离氨基酸浓度㊂1.4.5㊀骨骼肌蛋白质合成速度
㊀㊀蛋白质合成速度测定方法参考毛湘冰等[8]的报道,具体过程如下:用研钵将骨骼肌样品磨碎后,用2mL2mol/L的三氯乙酸溶液将样品(0.08g)溶解,在冰上匀浆,之后4ħ㊁2000r/min离心20min㊂将上清液(含有游离态苯丙氨酸)倒出,过阳离子交换树脂柱㊂沉淀部分(含有结合态苯丙氨酸)则用2mL2mol/L的三氯乙酸溶液洗涤3次,再用3mL6mol/L的盐酸溶液在110ħ水解24h,冷却㊁过滤和蒸干后,用超纯水溶解,过阳离子交换树脂柱㊂阳离子交换树脂柱先用1mol/L盐酸洗涤,然后用超纯水洗至中性,游离和结合氨基酸用4mL4mol/L的氨水溶液洗脱,并在充氮环境中将收集的样品溶液蒸干㊂
㊀㊀样品中的游离态和结合态L⁃[ring⁃2H5]苯丙氨酸经七氟丁酸酐衍生后,使用气相色谱-质谱(GC⁃MS)仪测定苯丙氨酸的含量㊂其中,游离态苯丙氨酸测定在电子质荷比为91和96时的含量,而结合态苯丙氨酸测定电子质荷比为148和153时的含量,根据标准曲线,换算为百分摩尔丰度(mol%)㊂蛋白质合成速度以蛋白质相对合成率表示,蛋白质相对合成率定义为1d内蛋白质更新的百分率㊂蛋白质相对合成率的计算方法参照Garlick等[9],公式如下:㊂
FSR=
E
bound
ˑ1440ˑ100
E
freet
ˑt㊂
㊀㊀式中:FSR表示蛋白质相对合成率(%/d);E
昆山特色美食bound
表示结合态L⁃[ring⁃2H5]苯丙氨酸的同位素丰度(%);1440表示1d中的分钟数;Efreet表示在时间t时,游离态L⁃[ring⁃2H5]苯丙氨酸的同位素丰度(%);t表示从腹腔注射同位素后到处死取样的时间,本试验中为30min㊂
1.4.6㊀骨骼肌蛋白质降解速度
㊀㊀蛋白质降解速度测定方法参照Tawa等[10]的报道,具体方法如下:将骨骼肌样品称重后,放入2mL离心管中,内含95%氧气-5%二氧化碳混合气体饱和的预孵育液,于37ħ培养箱中孵育30min之后弃去预孵育液,加入2mL95%氧气-5%二氧化碳混合气体饱和的孵育液,于37ħ振荡孵育2h㊂孵育后,弃去肌肉,收集孵育液于新的离心管中,于-70ħ保存待测㊂
㊀㊀测定时,移取1mL孵育液于2mL离心管中,后续操作方法同血清游离氨基酸含量测定过程,测得孵育液中酪氨酸的含量㊂
㊀㊀通过肌肉湿重和孵育液中酪氨酸的总含量,计算出2h内单位重量骨骼肌释放入孵育液中酪氨酸的含量,用其来表示骨骼肌蛋白质降解速度,单位为nmol酪氨酸/(mg湿重㊃2h)㊂
1.5㊀统计分析
㊀㊀本试验测定结果以每只大鼠为统计单位,试验数据用平均值表示,采用SAS8.1版软件中单因素方差分析(one⁃wayANOVA)进行方差分析,差异显著时采用Duncan氏法进行多重比较检验,当P<0.05时确定为差异显著㊂
2㊀结㊀果
2.1㊀饲粮蛋白质水平降低对成年大鼠生长性能的影响
㊀㊀由表2可知,饲粮蛋白质水平降低能够显著影响成年大鼠的平均日增重(P<0.05)㊂当酪蛋白含量从20%分别降至15%并添加合成氨基酸后,成年大鼠的平均日增重上升42.2%(P<0.05),但酪蛋白含量进一步下降至10%时,平均日增重则大幅下降,下降了46.5%(P<0.05)㊂而当酪蛋白含量从20%分别下降至5%和0时,即使添加了各
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㊀
动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报31卷
种合成氨基酸满足了大鼠对氨基酸的需要,大鼠的生长仍然受到抑制,出现体重下降的现象,且蛋白质水平越低,体重下降越多㊂与20%C组相比,完全由合成氨基酸提供氮源的0C组末重减少了106.57g(减少了38.81%,P<0.05)㊂当酪蛋白含量降至15%以下时,大鼠的干物质采食量均出现显著下降(P<0.05)㊂
表2㊀饲粮蛋白质水平降低对成年大鼠生长性能的影响
Table2㊀Effectsofdecreasingdietaryproteinlevelongrowthperformanceofadultrats(n=7)
项目Items转院流程
酪蛋白含量Caseincontent/%
20151050
SEM
P值
P⁃value
始重InitialBW/g238.57238.57238.57238.57238.571.391.00
末重FinialBW/g274.57b289.71a257.86c200.14d168.00e7.94<0.01
平均日增重ADG/(g/d)3.27b4.65a1.75c-3.49d-6.42e1.04<0.01
干物质采食量DMintake/(g/d)17.52a16.75a15.09b8.45c6.39d0.72<0.01
㊀㊀同行数据肩注字母不相同者表示差异显著(P<0.05),无字母或相同字母者表示差异不显著(P>0.05)㊂下表同㊂
㊀㊀Inthesamerow,valueswithdifferentlettersuperscriptsmeansignificantdifference(P<0.05),whilewithnoletterorthesamelettersuperscriptsmeannosignificantdifference(P>0.05).Thesameasbelow.流鼻涕吃什么药
2.2㊀饲粮蛋白质水平降低对成年大鼠血清游离氨基酸浓度的影响
㊀㊀由表3可知,随着饲粮蛋白质水平的降低,精氨酸㊁异亮氨酸㊁亮氨酸㊁苏氨酸和缬氨酸这5种必需氨基酸的浓度也随之下降,且饲粮蛋白质水平对上述氨基酸的浓度存在显著影响(P<0.05),而其他必需氨基酸的浓度并非呈线性下降㊂
15%C组的组氨酸浓度高于20%C组,但差异未到达显著水平(P>0.05),之后随着饲粮蛋白质水平的降低,组氨酸浓度逐渐下降,0C组显著低于20%C组(P<0.05),下降了31.85%㊂15%C组与
10%C组赖氨酸浓度均高于20%C组,但差异未到达显著水平(P>0.05),5%C组与0C组赖氨酸浓度较20%C组分别下降了25.19%和20.07%,差异达到显著水平(P<0.05)㊂4个低蛋白质水平组的蛋氨酸浓度均高于20%C组,且15%C组和10%C组与20%C组的差异达到显著水平(P<0.05),分别增加了20.85%和26.68%㊂20%C组的色氨酸浓度最低,15%C组㊁10%C组㊁5%C组和0C组的色氨酸浓度分别较20%C组增加了26.13%㊁18.19%㊁46.82%和31.75%,差异均达到显著水平(P<0.05)㊂苯丙氨酸浓度各组之间未见显著差异(P>0.05)㊂在非必需氨基酸中,与20%C组相比,15%C组的天冬氨酸浓度显著升高了17.24%(P<
0.05),5%C组与0C组则分别下降了37.75%(P<0.05)和44.68%(P<0.05),10%C组与20%C组无显著差异(P>0.05)㊂与20%C组相比,10%C组㊁5%C组和0C组脯氨酸浓度显著下降(P<0.05),分别下降了34.68%㊁60.53%和67.87%,15%C组与20%C组无显著差异(P>0.05)㊂其他非必需氨基酸浓度各组之间未见显著差异(P>0.05)㊂
2.3㊀饲粮蛋白质水平降低对成年大鼠氮平衡的影响
㊀㊀由表4可知,与20%C组相比,15%C组㊁10%C组㊁5%C组和0C组大鼠的氮摄入量显著下降(P<0.05),分别下降了27.23%㊁49.87%㊁78.26%和87.69%,继而粪氮排出量和氮沉积量也显著下降(P<0.05),氮沉积量分别下降了29.87%㊁52.74%㊁88.81%和98.60%㊂随着饲粮蛋白质水平的下降,氮沉积率也随之下降,5%C组和0C组氮沉积率分别比20%C组减少了48.51%(P<0.05)和88.60%(P<0.05),15%C组与10%C组则与20%C组无显著差异(P>0.05)㊂2.4㊀饲粮蛋白质水平降低对成年大鼠骨骼肌蛋白质合成和降解的影响
㊀㊀从图1和图2中可以看出,饲粮蛋白质水平的降低会导致腓肠肌和比目鱼肌蛋白质合成速度下降,而蛋白质降解速度升高㊂在腓肠肌中,与20%C组相比,15%C组蛋白质合成和降解速度无显著差异(P>0.05),当饲粮酪蛋白含量从15%分别下降至10%㊁5%和0时,肌肉蛋白质合成速度分别下降了18.25%(P>0.05)㊁33.65%(P<0.05)和40.68%(P<0.05),而蛋白质降解速度分别提高
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正则图