英文缩略词表
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GSK-3β glycogen syntha kina-3 糖原合成酶激酶-3
CK1 cain kina 1 酪蛋白激酶1
APC adenomatous polyposis coli 腺瘤性结肠息肉病蛋白
LRP LDL-receptor-related protein 低密度脂蛋白受体相关蛋白TCF7L2 transcription factor 7-like 2 转录因子7类似物2
TCF/LEF T-cell factor/lymphoid enhancing factor T细胞因子/淋巴细胞增强因子DEPC diethyl pyrocarbonate 焦碳酸二乙酯
SDS sodium dodecylsulfate 十二烷基硫酸钠
沆瀣一气是什么意思PBS phosphate buffered solution 磷酸盐缓冲溶液
PMSF pheylmethy sulfony fluoride 苯甲基磺酰氟
IRS insulin receptor substrate 胰岛素受体底物
PI3K phosphoinositide3-kinas 磷脂酰肌醇-3-激酶
AKT/PKB protein kina B 蛋白激酶B和你一样原唱
MEK mitogen-activated protein kina kina 丝裂原活化的细胞外信号调节
交通局局长激酶
芦荟可以吃吗ERK extracellular regulated protein kinas 细胞外调节蛋白激酶
PPAR peroxisome proliferator-activated
过氧化物酶体增殖物激活受体receptor
SiRNA small interfering RNA 小干扰RNA
G6PDH gluco-6-phosphate dehydrogena 6-磷酸葡萄糖脱氢酶
mTOR mammalian target of rapamycin 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白
AS160 Akt substrate of 160kDa 160 kDa的Akt底物
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解酶
Grb growth factor receptor-bound protein 生长因子受体结合蛋白SOS son of ven-less 鸟苷酸交换因子
PKC protein kina C 蛋白激酶C
GLP-1 glucagon-like peptide 1 胰高血糖素样肽-1 CBP CREB binding protein CREB结合蛋白
RIP rat insulin promoter 大鼠胰岛素基因启动子
Wnt信号通路与胰岛素信号通路在INS-1细胞中的对话
华中科技大学同济医学院附属同济医院内分泌科
硕士研究生：余鹏
导师：袁刚 教授
摘 要
【目的】以INS-1胰岛细胞系为模型，探讨胰岛β细胞内wnt信号通路与胰岛素信号通路之间的相互作用。
【方法】在体外培养的INS-1细胞中，给予wnt3a干预激活wnt通路，检测不同时间点（0h、5h、24h、48h、72h）IRS2的表达，并利用染色质免疫共沉淀技术检测wnt 通路关键效应分子TCF7L2是否能与IRS2启动子结合，探索wnt3a影响IRS2表达的可能机制。同时用胰岛素激活胰岛素信号通路，观察wnt通路中效应分子LPR6、β-catenin、TCF7L2表达的变化，并用Akti、PD98059抑制胰岛素信号通路下游PI3K/Akt 及Raf/Ras/MEK/ERK支路中Akt、ERK的活性，观察基础及胰岛素激活状态下的胰岛素信号通路阻断对wnt通路的影响。
【结果】在INS-1细胞中，wnt3a干预可上调IRS-2的表达，其mRNA在干预后5h 达最大值，蛋白质在干预后24h达最大值；此效应的出现是由于wnt3a干预可促进TCF7L2结合到IRS2基因的启动子区域，作为正性转录调控因子上调IRS2的表达。同时在INS-1细胞中，给予外源性胰岛素干预后，LPR6(Ser1490号位点)磷酸化水平未发生变化，β-catenin、TCF7L2表达增加；抑制Akt、ERK的活性后，基础及胰岛素刺激状态下的GSK-3β (Ser9号位点)磷酸化水平降低伴随β-catenin表达降低。
【结论】在INS-1细胞内，wnt信号通路与胰岛素信号通路存在对话，wnt信号通路的激活可通过TCF7L2上调IRS2的表达；胰岛素信号通路的激活可上调β-catenin、TCF7L2的表达，且其对β-catenin表达的影响可能与GSK-3β的磷酸化水平改变相关。
【关键词】β细胞wnt信号通路胰岛素信号通路
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ABSTRACT
Objective:To investigate the relationship between wnt signaling pathway and insulin signaling pathway in pancreatic β cells by using INS-1 cells as a model.
Methods: We activated the wnt pathway in INS-1 cells by wnt3a, and detected the expression of IRS2 at 0, 5, 24, 48 and 72 hours after wnt3a treatment. Chromatin immune precipitation was ud to explore the interaction between TCF7L2 and IRS2. On the other hand, we ud insulin to activate the insulin pathway and detected the expression of LPR6,β-catenin, TCF7L2. We also obrved the expression of β-catenin in both the prence and the abnce of exogenous insulin when pre-treated INS-1 cells with Akti and PD98059 (which can inhibit the activity of Akt and ERK respectively).
Results: Stimulation of the wnt pathway in INS-1 cell by using wnt3a could lead to the up-regulation of IRS2 expression, IRS2 protein reached maximum level after 24 hours treatment, while the mRNA level of IRS2 peaked at 5 hours after treatment. This was becau wnt3a could promote TCF7L2 binding to the promoter of IRS2 and regulated its expression as a transcription activator. Insulin treatment didn’t alter the phosphorylation state of LRP6(Ser1490) but up-regulated the expression of β-catenin and TCF7L2. When pre-treated with Akti or PD98059, compared with the corresponding control, the expression of β-catenin was decread in both the prence and the abnce of exogenous insulin. Conclusions: A crosstalk between wnt signaling pathway and insulin signaling pathway existed in INS-1 cells. Activition of wnt pathway by wnt3a can lead to the up-regulation of IRS2 through TCF7L2. While activation of insulin pathway by exogenous insulin can lead to the up-regulation of β-catenin and TCF7L2, GSK-3β may mediate the insulin-mediated stimulation of β-catenin expresssion.
Key words：β cell wnt signaling insulin signaling
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正文
Wnt信号通路与胰岛素信号通路在INS-1细胞中的对话
引 言
2型糖尿病是以胰岛素抵抗、胰岛素分泌相对不足为特征的疾病，胰岛β细胞功能缺陷在2型糖尿病病理生理过程中占据重要地位，在外周组织胰岛素抵抗的情况下，当胰岛β细胞分泌的胰岛素不足以代偿时即发生糖尿病，在疾病进展过程中，由于胰岛β细胞受高工作负荷、糖毒性[1]、脂毒性[2]、氧化应激[3]、内质网应激[4]、线粒体功能障碍[5]等因素的影响，β细胞的数量和功能呈进行性减退，一项关于糖尿病的前瞻性研究（UK Prospective Diabetes Study，UKPDS 研究）表明在2型糖尿病患者中β细胞功能每年以5%的速度减退[6]，同时β细胞数量与患病年限成反比[7]。故探讨如何保护胰岛β细胞数量与功能对于阻止糖尿病病情进展及并发症的发生具有重要意义。
Wnt 通路在细胞增殖、细胞极性产生、细胞命运决定中均有重要作用[8]，经典的wnt通路由配体、受体、胞质调节蛋白、核内转录因子四部分组成。在没有wnt配体的状态下，胞质调节蛋白GSK-3β、 C
K1、 Axin、 APC和β-catenin 组成复合体，该复合体的形成导致β-catenin 的r 45位点被CK1α磷酸化，随之 r 37、r 33、thr 41位点被GSK-3β磷酸化[9]，这些位点的磷酸化可被泛素连接酶E3识别，进而导致β-catenin的泛素化降解。在wnt配体存在的状态下，wnt与受体Fz、LRP5/6形成复合体，Fz招募Dvl导致LRP5/6磷酸化活化，活化的LRP6会招募Axin，影响Axin/CK1/APC/GSK-3β复合体的形成，也可抑制GSK-3β对β-catenin的磷酸化降解，导致胞质中β-catenin不断聚集，进而转入核内与TCF/LEF元件结合，激活wnt下游基因的表达[10-12]。Wnt 通路与β细胞生物学及2型糖尿病的发生密切相关，在Min-6胰岛细胞系及小鼠原代胰岛细胞中，给予wnt3a刺激均能促进其增殖[13]。改变wnt通路关键组分β-catenin及TCF7L2的表达均能对β细胞及葡萄糖代谢稳态产生影响，在小鼠胰岛细胞中特异性敲除β-catenin可以导致胰岛及β细胞形态发生变化、胰岛素
