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小星星数字简谱
２００２
Ａｌｃａｌａｓｅ碱性蛋白酶水解
甘薯蛋白的研究
吴广辉１，２，木泰华１，２＊，高愿军１
（１．郑州轻工业学院食品与生物工程学院，郑州４５０００２；
２．中国农业科学院农产品加工研究所，北京１０００９４）
摘要：通过测定水解度的方法，研究Ａｌｃａｌａｓｅ碱性蛋白酶对甘薯蛋白的水解效果，并探讨了ｐＨ、温度、酶用量、底物浓度、水解时间对该酶水解效果的影响。通过正交实验和极差分析确定最佳工艺条件为温度４５℃，开始的ｐＨ值８．０，底物浓度３％（ｗ／ｖ），酶与底物的浓度比４％（ｗ／ｖ），水解时间２４０ｍｉｎ。此外，Ａｌｃａｌａｓｅ水解甘薯蛋白可分成３个不同分子量的组分。
关键词：甘薯蛋白；Ａｌｃａｌａｓｅ碱性蛋白酶；水解度
中图分类号：ＴＳ２０１．２文献标志码：Ａ文章编号：１００５－９９８９（２００８）０７－００２２－０４
ＳｔｕｄｙｏｎｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆｓｗｅｅｔｐｏｔａｔｏｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈＡｌｃａｌａｓｅｐｒｏｔｅａｓｅ
ＷＵＧｕａｎｇ－ｈｕｉ１，２，ＭＵＴａｉ－ｈｕａ１，２＊，ＧＡＯＹｕａｎ－ｊｕｎ１
（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｏｄａｎｄＢｉｏｌｏｇｙＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＺｈｅｎｇｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＬｉｇｈｔＩｎｄｕｓｔｒｙ，
Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５０００２；２．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｇｒｏ－ＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００９４）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＥｆｆｅｃｔｏｆＡｌｃａｌａｓｅｐｒｏｔｅａｓｅｏｎｔｈｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆｓｗｅｅｔｐｏｔａｔｏｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｓｔｕｄｉｅｄｂｙｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ
收稿日期：２００７－１１－２０＊通讯作者
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３计划）项目（２００６ＡＡ１０Ｚ３３２）。
作者简介：吴广辉（１９８１—），男，河南太康人，硕士研究生，研究方向为食品化学与营养。
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ｉｔｓｄｅｇｒｅｅｏｆｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ（ＤＨ）．ＰａｒａｍｅｔｅｒｓｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｏｆｔｈｅＡｌｃａｌａｓｅｐｒｏｔｅａｓｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｅｆｆｅｃｔ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｐＨ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｓｕｂｓｔｒａｔｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｒａｔｉｏｏｆｅｎｚｙｍｅａｎｄｓｕｂｓｔｒａｔｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｔｉｍｅｗｅｒｅａｌｓｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｐａｒａｍｅｔｅｒｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｔｈｒｏｕｇｈｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｎｄｔｈｅｒａｎｇｅａｎａｌｙｓｉｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ：ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗａｓ４５℃，ｉｎｉｔｉａｌｐＨｗａｓ８．０，ｓｕｂｓｔｒａｔｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗａｓ３％（ｗ／ｖ），ｒａｔｉｏｏｆｅｎｚｙｍｅａｎｄｓｕｂｓｔｒａｔｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗａｓ４％（ｗ／ｖ）ａｎｄｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｔｉｍｅｗａｓ２４０ｍｉｎ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｏｆｓｗｅｅｔｐｏｔａｔｏｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｓｉｓｔｅｄｏｆｔｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｆｒａｃｔｉｏｎｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｓｗｅｅｔｐｏｔａｔｏｐｒｏｔｅｉｎ；Ａｌｃａｌａｓｅｐｒｏｔｅａｓｅ；ｄｅｇｒｅｅｏｆｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
甘薯蛋白含有丰富的氨基酸，其氨基酸组成模式符合ＷＨＯ／ＦＡＯ推荐标准，必需氨基酸含量较高，是一种重要的植物蛋白资源。甘薯蛋白的营养价值可与牛奶、肉类媲美。由于未变性的甘薯蛋白具有胰蛋白酶抑制剂活性，影响其消化吸收。如采用酶解的方法，使之生成小分子量的肽，会使其生物效价更高［１－２］。
Ａｌｃａｌａｓｅ碱性蛋白酶是由选育出的地衣芽孢杆菌生产而得，主要应用于水解各种蛋白质，是一种高效的细菌蛋白酶。该酶的主要有效成分枯草杆菌蛋白酶Ａ，它是一种内切蛋白酶，主要作用于含疏水性羧基的肽键［３］。Ａｄａｍｓｏｎ（１９９６）等发现，Ａｌｃａｌａｓｅ可以裂解Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ和Ｇｌｎ的羧端肽键，与胰蛋白酶释放的肽链段相比其肽链段更短且产率高［４］。而且Ａｌｃａｌａｓｅ碱性蛋白酶具有高度的操作安全性，符合ＦＡＯ／ＷＨＯ／ＪＥＣＦＡ／ＦＣＣ推荐的食品级酶制剂标准［５］。
本实验通过Ａｌｃａｌａｓｅ碱性蛋白酶酶解甘薯蛋白效果和影响因素的研究，确定最佳水解工艺条件，为工业化生产甘薯多肽提供理论依据。
１材料与方法
１．１材料与仪器
甘薯蛋白：实验室自制，其纯度为６２％；Ａｌｃａｌａｓｅ２．４Ｌ（２．４ＡＵ／ｇ）碱性内切蛋白酶（液态）：Ｎｏｖｏ公司；ＯＰＡ：Ｓｉｇｍａ公司；ＤＴＴ：ＩＮＡＬＣＯ公司。
ＬＸＹ－ⅡＢ型低速离心机：上海安亭科学仪器厂；电子恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；Ｕ－３０１０紫外可见分光光度计：日本东京日立株式会社；恒温水浴震动摇床：国华企业；ＭＥ９９－３型层析系统：上海沪西分析仪器有限公司。
１．２测定方法
正确的回奶方法水解度的测定方法采用ＯＰＡ法［６－８］，计算公式为：
水解度ＤＨ（％）＝（ｈ／ｈ
ｔｏｔ
）×１００
ｈ＝（丝氨酸－ＮＨ２－β）／α（ｍｅｑｖ／ｇ）
丝氨酸－ＮＨ
定期存款哪个银行利息最高２
＝［（Ａ样品－Ａ空白）／（Ａ标准－Ａ空白）］×０．９５１６ｍｅｑｖ／Ｌ×０．１×１００／（ｍ×ｗ）
式中：ｈ为酶水解所释放的游离氨基数；
ｈｔｏｔ为酸水解作用测得的原料总游离氨
基数；
甘薯蛋白为７．２８；
ｍ为样品质量，ｇ；
ｗ为样品中的蛋白质质量分数，％；
０．１为样品的体积，Ｌ；
甘薯蛋白的常数α、β分别为１．００和０．４０；
典型的Ａ标准值为０．８，空白Ａ值为０．０７。１．３甘薯蛋白的酶解工艺［５，９－１０］
按一定的底物浓度准确称取甘薯蛋白于水解反应器中，加入适量蒸馏水，轻微搅拌至底物均匀溶解于水中，９０℃下再加热１０ｍｉｎ，冷却到酶解反应温度后，用０．５ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ调节酸碱度至所需的ｐＨ值，准确量取蛋白酶后加入水解反应器，并慢慢搅拌。反应到预定时间，即停止加热搅拌，迅速升温到９０℃，加热１０ｍｉｎ钝化蛋白酶。
１．４ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５分离甘薯蛋白肽［１１］
将甘薯蛋白在温度４５℃、开始ｐＨ值８．０、底物浓度３％（ｗ／ｖ）、酶与底物浓度比４％（ｗ／ｖ）所得Ａｌｃａｌａｓｅ水解液（正交实验最优组合）上ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５柱（１．６ｃｍ×１００ｃｍ），以蒸馏水为洗脱液，洗脱速度为０．３５ｍＬ／ｍｉｎ。
孕妇能吃粽子吗１．５数据统计分析
单因素实验所得数据采用Ｅｘｃｅｌ处理，正交实验所得结果采用正交设计助手ＩＩＶ３．１软件极差分析。
２结果与分析
２．１Ａｌｃａｌａｓｅ碱性蛋白酶水解甘薯蛋白的单因素实验２．１．１酶与底物浓度比对水解度的影响
图１酶与底物浓度比对水解度的影响
图３
温度对水解度的影响
图２时间对水解度的影响
由图１可知，随着酶与底物浓度比的增加，水解度也随之增加，酶与底物的浓度比为５％时水解度为２３．１３％，该值比１％时的１６．２５％要高６．８８％。当酶与底物浓度比达到４％以后，曲线变化较为平缓。考虑到价格、成本等因素，确定５％作为反应最佳的酶与底物浓度比。
２．１．２时间对水解度的影响
随着水解时间的增加，甘薯蛋白被Ａｌｃａｌａｓｅ碱性蛋白酶水解的程度增大。由图２可知，甘薯蛋白的水解度在前２０ｍｉｎ增加较快，由０增至１８．７７％，２０
ｍｉｎ以后水解速度相对减慢，２４０ｍｉｎ为２６．３６％，之后未见有显著的变化。说明Ａｌｃａｌａｓｅ碱性蛋白酶对甘薯蛋白的水解能在较短的反应时间内达到较高水解度，这与Ａｌｃａｌａｓｅ碱性蛋白酶是一种非特异性肽键内切酶，其作用位点较多有关。２０ｍｉｎ之后水解速度减慢，可能水解过程中存在着逆反应有关。
２．１．３温度对水解度的影响
由图３可知，随着温度的增加，甘薯蛋白的水解度呈现先增加后减小的趋势，甘薯蛋白的水解度在５０℃时最高，为２１．２８％。温度超过５０℃后，甘薯蛋白的水解度开始降低，过高的温度会造成酶活性的降低甚至完全导致其失活。
２．１．４底物浓度对水解度的影响
随着底物浓度的增加甘薯蛋白水解度显著地降
低（见图４），可能是由于底物对酶有抑制作用所至，即两个或两个以上底物分子分别占据了酶的部分活性位点，致使它们都无法按正常的方式接受酶的催化作用，底物浓度越高，抑制效果越明显。当底物浓度达到６％时体系流动性变得很差。为了提高效率，在实际生产中宜选取较高底物浓度，综合考虑底物
浓度４％较合适。
２．１．５ｐＨ值对水解度的影响
由图５可知，随着水解开始和ｐＨ值的增加，水解度呈现先增加后减小的趋势，在ｐＨ值７．５时达到最大，为２６．２２％。因此，可以认为Ａｌｃａｌａｓｅ碱性蛋白酶水解甘薯蛋白的最适ｐＨ值为７．５。
２．２Ａｌｃａｌａｓｅ碱性蛋白酶水解甘薯蛋白正交实验
为了确定Ａｌｃａｌａｓｅ碱性蛋白酶水解甘薯蛋白最佳工艺条件，根据预备实验和有关资料，分别选择底物浓度为３％、４％、５％，酶与底物的浓度比Ｅ／
Ｓ为４％、５％、６％，ｐＨ７．０、７．５、８．０和温度４５、５０、５５℃进行４因素３水平的正交实验，因素水平见表１。
由表２可知，影响水解反应的主次关系为底物浓度＞ｐＨ值＞温度＞Ｅ／Ｓ。因为随着水解时间的延长水解度呈现缓慢增加的趋势，到２４０ｍｉｎ以后增加的速度很慢，综合考虑较合适的水解时间为２４０ｍｉｎ。结合极差分析的结果可以看出：本实验的较优条件为
Ａ３Ｂ１Ｃ１Ｄ１，即水解的开始ｐＨ值为８．０、温度为４５℃、底物浓度为３％、酶与底物的浓度比为４％、水解时间２４０ｍｉｎ。因为所得的最优组合不在实验设计中，通过验证水解度为２６．５２％。
注：反应条件为温度为５０℃，Ｅ／Ｓ＝５％，ｐＨ７．５，水解时间１２０ｍｉｎ。
图４底物浓度对水解度的影响
注：反应条件为温度为５０℃，Ｅ／Ｓ＝５％，底物浓度４％，水解时间
１２０ｍｉｎ。
图５ｐＨ值对水解度的影响
表１
正交实验因素水平表
水平
因素
ｐＨ值Ａ温度／℃Ｂ底物浓度／％ＣＥ／Ｓ／％Ｄ１７．０４５３４２７．５５０４５３
８．０
５５
５
６
图６
ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５对水解产物分离图谱表２
水解正交实验结果
实验号
因素
水解度／％
ＡＢＣＤ１１１１１２３．３３２１２２２１９．２６３１３３３１６．１７４２１２３２３．５８５２２３１１８．８４６２３１２２２．５９７３１３２２２．７２８３２１３２４．３８９３３２１２３．４８
Ｋ１５８．７７６９．６３７０．３０６５．６５Ｋ２６５．００６２．４７６６．３２６４．５７Ｋ３７０．５８６２．２５５７．７３６４．１３ｋ１１９．５９２３．２１２３．４３２１．８８ｋ２２１．６７２０．８２２２．１１２１．５２ｋ３
２３．５３２０．７５１９．２４２１．３８优水平
Ａ３Ｂ１Ｃ１Ｄ１Ｒ
３．９４
２．４６
４．１９
０．５１
主次顺序
ＣＡＢＤ
２．３甘薯蛋白水解产物的色谱分析
甘薯蛋白的正交实验最优组合所得水解产物经
过ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５分离主要得到３个不同分子量的组分（见图６）。这些组分的氨基酸排列以及组成还有待于今后进一步的分析。
３
结论
Ａｌｃａｌａｓｅ碱性蛋白酶水解甘薯蛋白的最佳工艺是开始ｐＨ值为８．０，温度为４５℃，底物浓度为３％（ｗ／
ｖ），酶与底物的浓度比为４％（ｗ／ｖ），水解时间２４０ｍｉｎ。在最佳工艺水平上Ａｌｃａｌａｓｅ碱性蛋白酶对甘薯蛋白有最佳的水解效果，其水解度最高达到２６．５２％，该水解产物主要被分离出３个不同分子量的组分。
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拳击基础训练
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Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，１００：１５３７－１５４３
日前，中国品牌研究院公布第二届２８８个中国行业标志性品牌名单，安琪酵母名列其中。
中国行业标志性品牌是指能够代表中国同行或在全球同行中较有影响力的品牌，在中国每个行业只评定出一个品牌作为中国行业标志性品牌，具有唯一性和排他性，是中国企业的最高品牌荣誉，也是中国对外展示形象的“国家名片”。
安琪酵母股份有限公司是从事酵母及酵母衍生物产品经营的国家重点高新技术企业、上市公司。公司酵母生产规模、市场占有率均居于国内同行之首，是全国６０个“
行业内最具成长力的自主品牌企业”之一，“
安琪”商标是中国驰名商标，２００７年被认定为“
中国名牌”。据悉，湖北省有五个品牌入选，宜昌仅有安琪酵母入选。（高天海）
安琪酵母被评为中国行业标志性品牌
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