异丙酚通过激活ERK信号通路减少H2O2引起的L02肝细胞凋亡
异丙酚通过激活ERK信号通路减少H2O2引起的L02肝细胞凋亡
王浩薛张纲
复旦⼤学附属中⼭医院⿇醉科，上海200032
Propofol protected hepatic L02 cells from H2O2-induced apoptosis via activation of Extracellular Signal-Regulated Kinas (ERK) Pathway
WANG Hao, XUE Zhang-gang
Department of Anesthesiology, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai
200032, China
[摘要]：⽬的已有报道证明异丙酚在缺⾎再灌注损伤(ischemia/reperfusion I/R) 中对⼀些重要脏器具有保护作⽤，但是对肝细胞的作⽤报道甚少。此外，最近的研究显⽰ERK信号通路在氧化应激中发挥重要作⽤。因此我们⽤H2O2诱导肝细胞氧化损伤，观察异丙酚预处理对⼈L02细胞的影响并且进⼀步检测ERK
通路在其中的作⽤。⽅法L02细胞经异丙酚预处理后被H2O2诱导凋亡，⽤TUNEL 法及Caspa-3切割程度来检测细胞的凋亡。⽤蛋⽩质印迹技术检测ERK及MEK 的磷酸化情况。通过实时定量PCR技术检测Bcl-2, Bcl-x L, Bad，和Bax mRNA表达量变化。结果在H2O2诱导的凋亡过程中，经异丙酚预处理的L02细胞凋亡数量及Caspa-3切割量均明显减少。并且这种减少与异丙酚的剂量成正相关：当异丙酚剂量⽤⾄300 µM时，细胞的凋亡程度被降⾄最低。与此⼀致的是ERK 的磷酸化被显著的激活。单⽤不同浓度的异丙酚(10 - 300 µM) 处理细胞，检测到浓度依赖性的ERK及MEK磷酸化升⾼。不同时间点（0 - 4 h）收获经异丙酚处理的细胞，发现ERK及MEK在0.5⼩时内就可以被激活，随后逐渐降低，⾄4 h时，ERK及MEK的活性下降到峰值时的⼀半。⽤特异性的MEK抑制剂PD98059处理细胞完全抑制异丙酚诱导的ERK活性，并且加重了细胞的凋亡程度。异丙酚预处理减少了促凋亡基因Bad和Bax的mRNA表达，并且这种抑制作⽤可以被PD98059逆转。结论我们的研究提⽰异丙酚对H2O2诱导的⼈肝细
胞凋亡具有保护作⽤，并且这种保护作⽤⾄少部分是通过激活ERK信号通路进⽽抑制Bad和Bax的表达起作⽤的。
[关键词]：异丙酚；肝细胞；ERK；凋亡
[Abstract]：Objective Here we investigated the effect of propofol preconditioning on human hepatic L
02 cells under hydrogen peroxide (H2O2)-induced oxidative stress and attempted to find out whether ERK pathway is involved in this process. Methods Preconditioned or nonpreconditioned human hepatic L02cells were expod to H2O2 and the changes of apoptosis were evaluated by TUNEL assay and Caspa-3 cleavage. Activation of extracellular signal-regulated kina 1/2 (ERK1/2) and MAP Kina/ERK Kina 1/2 (MEK1/2) was measured by western blot. The mRNA expression of Bcl-2, Bcl-x L, Bad, and Bax was quantified by real-time PCR. Result s Propofol preconditioning reduced population of apoptotic cells and Caspa-3 cleavage induced by H2O2 in hepatic L02 cells. The minimal amount of cell death was relevant to 300 µM propofol pretreatment, accompanying with significant activation of ERK1/2. L02 cells treated with propofol (10 - 300 µM) alone, led to a do-dependent activation of ERK and MEK. Treated cells with 300 µM propofol for 0 - 4 h, ERK and MEK were activated within 0.5 h and eventually declined to less than 50% at 4 h. The addition of specific inhibitor, PD98059, completely abolished the activation of ERK and aggravated the extent of apoptosis. Propofol pretreatment decread the mRNA expression of pro-apoptotic genes, and this repression could be reverd by PD98059. Conclusion The findings prent a new molecular mechanism of propofol protection against H2O2-induced apoptosis in hepatocytes, which is at least partly mediated by activating MEK-ERK pathway, and further suppressing Bad and Bax expression.
[Key words]：Propofol; hepaocytes; ERK; Apoptosis
肝脏移植、组织切除术及出⾎性休克都会引起细胞氧化损伤并最终导致肝功能失调或衰竭[1, 2]。组织缺⾎再灌注中堆积的氧⾃由基是导致细胞死亡的主要因素[3, 4]。⽬前针对I/R损伤最有效的措施是预处理，如：缺⾎预处理、热休克及⼀些模仿这种作⽤的药物，都可以有效的提⾼移植术后的肝组织存活率[5, 6]。作为常⽤的静脉⿇醉药，异丙酚由于它的代谢⼏乎不受到肝功能失调的影响，因此常⽤于肝移植⼿术中。最近的⼀系列报道都提⽰异丙酚作为抗氧化剂对⼼、肺、脑具有保护作⽤[7, 8, 9]。但是对不同的组织细胞以及在不同的实验条件下，异丙酚的作⽤则并不完全⼀致。到⽬前为⽌，异丙酚对肝细胞在氧化应激条件下的作⽤尚不清楚，并且其作⽤的分⼦机制更是知之甚少。
氧化应激产物(Reactive oxygen species, ROS)包括过氧化氢(Hydrogen peroxide, H2O2)是由于在I/R异常代谢过程中堆积的产物。细胞内毒性H2O2的堆积常伴随着细胞内⼀些组分的快速修饰，如细胞内⾕胱⽢肽和ATP的削减、NAD+的下降、胞内钙离⼦的增多以及脂质的过氧化。这会引起细胞的凋亡和坏死。凋亡是⼀种主动的细胞程序性死亡过程，其主要特征是细胞皱缩、染⾊体固缩成团形成凋亡⼩体和活性Caspa-3的切割[10]。有丝分裂激酶蛋⽩家族(Mitogen-actived protein kinas, MAPKs) 被认为涉及细胞氧化应激的过程。在真核细胞⽣物中，MAPKs将细胞外的信号传递到细胞核[11, 12, 13]。ERK是
MAPKs 家族成员之⼀，很多实验证实它在氧化损伤中具有保护组织脏器的作⽤。ERK 磷酸化激活后与下游的转录因⼦及其他激酶相互作⽤，调节细胞内部的⽣理功能[14, 15, 16]。尽管ERK被报道参与缺⾎损伤的病理过程，但是在异丙酚对肝细胞的预处理中的效应未见报道。
在本研究中，我们检测了异丙酚预处理对于H2O2诱导肝细胞凋亡的作⽤，并且检测了异丙酚对ERK通路的影响。拒绝反义词
材料⽅法
细胞株及主要试剂L02⼈肝细胞购⾃中国科学院细胞⽣化所。RPMI-1640培养液及胎⽜⾎清购⾃GIBCO公司。抗⼈ERK及磷酸化ERK单克隆抗体，兔抗⼈Caspa-3、MEK1/2、磷酸化MEK1/2多克隆抗体均购⾃CST公司。ECL发光试剂购⾃Pierce 公司。异丙酚（得普利⿇）购⾃阿斯利康公司。TUNEL试剂盒购
⾃Roche公司。Real-Time PCR试剂盒购⾃TaKaRa公司。
细胞培养L02⼈肝细胞培养于37o C、5％CO2及饱和湿度的细胞培养箱中。细胞在含有10％的胎⽜⾎清的RPMI-1640培养液（含链霉素与青霉素）中贴壁⽣长。异丙酚及抑制剂预处理为了检测不同浓度异丙酚预处理的作⽤，将异丙酚溶解在DMSO 中，加⼊细胞培养液中的终浓度为0，50，100和300 µ
M。L02细胞接种到3.5 cm的培养⽫，当细胞贴壁⽣长1 d后，分别加⼊不同浓度的异丙酚预处理1 h，对照细胞则加⼊相同体积的DMSO，然后加⼊H2O2诱导细胞凋亡。作为溶剂的DMSO在各样品中的终浓度均低于0.3‰。预处理后的细胞，继续⽤200µM的H2O2共通孵育8h诱导凋亡[17]。为了测定异丙酚是否通过激活EKR信号通路发挥抗凋亡作⽤，在加⼊H2O2诱导凋亡前，L02细胞先⽤PD98059（特异性MEK抑制剂）处理1h，然后再异丙酚预处理。
原位细胞凋亡检测（TUNEL）⽤4％中性多聚甲醛室温固定⽣长于96孔板中的细胞1 h，0.1mol/L PBS洗涤2遍（每次5min）后加⼊含0.3%H2O2的甲醇中1 h，后⽤含0.1% Tween-20的PBS洗涤2遍，每个孔加⼊50 µl TUNEL反应液，37 h℃孵育1 h 后在荧光显微镜下观察拍照。
Western印迹技术收集细胞，PBS洗涤细胞两次，加细胞裂解液，超声破碎细胞，⽤Lowry法测定蛋⽩浓度。SDS-PAGE电泳分离细胞总蛋⽩，每孔上样量为50 µg，然后将胶上的蛋⽩通过电转移印迹到PVDF膜上。5 ％脱脂奶粉/TBS液封闭PVDF 膜，加ERK、MEK、Caspa-3或α-tubulin⼀抗结合，然后⽤HRP 标记的⼭⽺抗兔或抗⿏IgG⼆抗结合，最后⽤ECL试剂发光，X胶⽚曝光、显影、定影记录条带，将条带扫描后进⾏灰度分析。
Real-Time RT-PCR定量分析⽤Real-Time RT-PCR检测Bcl-2家族基因的表达⽔平（仪器型号为ABI Prism 7300）。⽤Trizol 试剂抽提细胞总RNA，取2µg RNA 逆转录制备cDNA。Real-Time PCR反应
体系包括2 µl的cDNA模板（1％的RT 产物）、10µl SYBR Green Mix（Takara）及10 µM终浓度的上、下游引物（序列见表1），加⼊H2O补⾜20 µl，扩增条件为95 ?C 5 s总变性以及95 ?C 5 s、60 ?C 31 s循环40次。⽬的基因的mRNA⽔平⽤Gapdh内参校正，并将对照组细胞的表达⽔平设定为1。所有样品每个基因的PCR反应均为3孔，实验重复⾄少3
次。
统计学处理采⽤SPSS11.5统计软件，最终数据采⽤“均数±标准差”表⽰，数据⽐较采⽤t检验，P < 0.05认为差异有统计学意义。
结果
异丙酚保护L02细胞对抗H2O2诱导的凋亡
⾸先，我们⽤TUNEL法测定发现异丙酚预处理过的细胞的凋亡细胞数量与对照细胞相⽐有不同程度的减少，并且与异丙酚的浓度呈正相关（见图1A）。对照细胞100％的凋亡，⽽⽤300 µM预处理的细胞只有32％发⽣凋亡（见图1B）。蛋⽩质印迹技术也证明300 µM的异丙酚显著的降低了Caspa-3的切割（见图1C-D）。因此，我们的体外实验提⽰异丙酚在肝细胞中的作⽤与在⼼、脑细胞中的作⽤⼀致，都是起了保护细胞抗凋亡的作⽤。
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异丙酚激活ERK信号通路
由于异丙酚调节细胞效应的分⼦机制研究的不多，⽽ERK信号通路被认为涉及氧化应激过程的抗凋亡作⽤。因此，我们想检测异丙酚是否与ERK信号通路存在联系。如图2A-B所⽰，200 µM的H2O2本⾝不能激活ERK的磷酸化，⽽加⼊300 µM的异丙酚明显上调了磷酸化的ERK，这说明ERK的激活完全依赖于异丙酚的作⽤。考虑到异丙酚可以激活ERK，我们进⼀步分析了异丙酚对ERK及其上游MEK激活的时间和剂量效应关系。分别⽤10，50，100，300 µM 的异丙酚处理细胞1 h，发现ERK的活性与异丙酚的浓度呈正相关（见图3A-C）。⽤300 µM的异丙酚处理细胞后分别在0、0.5、1、2和4 h收获细胞，发现在0.5 h内ERK就被激活，当到4 h时，ERK的活性降低到峰值时的50％（见图3D-F）。因此，我们的结果提⽰异丙酚在H2O2诱导的凋亡中可能通过激活ERK信号通路发挥保护细胞的作⽤。
阻断ERK的活性抑制了异丙酚的保护作⽤
为了证实异丙酚对ERK的活性调节作⽤，我们⽤50 µM PD98059（MEK的特异性抑制剂）孵育细胞1h，发现ERK的活性⼏乎完全被阻断（见图4A-B）。TUNEL染⾊和Caspa-3活性分析都发现使⽤抑制剂的细胞凋亡程度明显⾼于
犹字组词
未使⽤抑制剂的细胞（见图C-F）。因此，进⼀步证实异丙酚通过调节ERK信号通路发挥抗凋亡作⽤的。
异丙酚对Bad 和Bax表达的调节
由于Bcl-2家族基因与细胞的凋亡密切相关，我们检测了异丙酚作⽤下Bcl-2家族基因表达的变化是否依赖于ERK信号的调节。⽤Real-Time PCR的⽅法定量分析了Bad和Bax两个促凋亡基因及Bcl-x L和Bcl-2两个抗凋亡基因的mRNA变化。我们发现Bad 和Bax的表达明显减少，⽽Bcl-x L和Bcl-2的表达没有显著差异（见图5A-B）。⽤PD98059处理后，Bad和Bax的降低被⼤量抑制（见图5C），揭⽰Bad和Bax表达的调控受到异丙酚－ERK信号通路的影响。
讨论
本研究的⽬的主要是为了阐述异丙酚在氧化应激条件下对肝细胞的影响。这⾥所有的数据都强烈的提⽰异丙酚对L02⼈肝细胞具有保护作⽤，并且这种作⽤⾄少部分是通过激活MEK-ERK信号通路进⽽抑制特异性的促凋亡基因的表达起作⽤的。
为了证明异丙酚的抗凋亡作⽤，我们⽤过氧化氢作为凋亡诱导剂。在我们的实验中，200 µM的H2O2可以完全导致L02细胞凋亡。临床使⽤的异丙酚以脂肪乳剂作为溶剂，但有⽂献报道脂肪乳剂也具有⼀定的抗氧化作⽤[18]。因此为了排除溶剂的⼲扰，我们将异丙酚纯品溶解于DMSO，并将DMSO的终浓度控制在0.3%以下。我们发现50 µM的异丙酚开始发挥抗凋亡作⽤，当浓度增⾄100，300µM时效应更加明显。这说明⾼浓度的异丙酚在体外对肝细胞有保护作⽤，这也提⽰异丙酚适⽤于临床的肝
脏⼿术。
尽管有不少研究证明ERK具有抗I/R损伤的作⽤，但是最近有报道在中性粒细胞中，异丙酚抑制了FLMP诱导的ERK的磷酸化活性[19]。⽽我们的实验则证实异丙酚能显著刺激⼈肝细胞ERK的活性表达，并且ERK的激活完全依赖异丙酚的作⽤⽽不是H2O2引起的。据⽂献报道在⼼肌细胞中，低浓度的H2O2就可以上调ERK的活性[20]，⽽我们发现200 µM的H2O2并不能激活L02⼈肝细胞中的ERK。我们认为这种差异可能是不同的细胞类型造成的。在进⼀步的实验，
我们发现ERK的上调有⼀定的时间、浓度效应。⽤PD98059可以逆转异丙酚对肝细胞的保护作⽤，细胞的死亡数量明显回复。这说明ERK信号通路是异丙酚发挥作⽤的关键分⼦。
Bcl-2家族蛋⽩是与凋亡相关的重要分⼦，可以分为两部分的成员：抗凋亡基因如Bcl-2、Bcl-x L，促凋亡基因如Ba x和
Bad[21]。这两类基因的表达⽐例决定了细胞最终的命运是存活还是死亡。临床研究中，⼀些抗氧化药物，例如MnSOD 调节Bax和Bcl-2的⽐例[22]。基于以前报道ROS和MAPKs可以调节Bcl-2、Bcl-x L、Bad和Bax，我们检测异丙酚是否调节这些基因的表达。Real-Time PCR结果证实：异丙酚处理后，Bcl-2和Bcl-x L的mRNA表达⽔平并没有明显的改变，但是Bad和Bax 的mRNA⽔平明显降低。随之，抗凋亡和促凋亡基因的表达⽐例增加，进⽽减少了细胞⾊素c的释放。这些分⼦的表达⽔平变化进⼀步
雨前钓鱼解释了为什么异丙酚能够促进L02细胞存活。此外，有些研究表明Bcl-2是强有⼒的促存活因⼦，能够有效的对抗多种应激细胞凋亡[23]。已知多种蛋⽩激酶，包括MAPKs 能够磷酸化Bcl-2，从⽽激活它的抗凋亡功能。最近的研究也发现异丙酚可以通过影响Bcl-2和Bax的表达来减少TNF-alpha引起的细胞凋亡[24]。但是Muto等报道过表达Bcl-2促进缺⾎再灌注损伤引起的肝细胞凋亡[25]。然⽽，在我们的研究中，Bcl-2的表达没有明显改变。这样的差异可能是由于细胞类型及实验条件不同引起的。
我们的研究⾸次提供了证据：在氧化剂引起的凋亡中异丙酚对肝细胞具有保护作⽤。考虑到所有的这些数据都只是来⾃体外实验，我们的结果和⼀些动物实验以及临床实验的结果不⼀致。在有限的报道中，异丙酚在缺⾎再灌注引起的肝损伤中的作⽤有些⽭盾。Navapurkar等报道了在氧化应激的⼤⿏肝细胞中异丙酚具有抗凋亡作⽤，但最近Shimono等的研究却显⽰异丙酚对低氧引起的⼤⿏肝损伤没有任何显著作⽤[26, 27]。导致这些不⼀致的原因可能如下：1，为了有效的检测异丙酚作⽤机制，我们实验采⽤的浓度范围⽐较⼴，超出了临床使⽤剂量；2，L02细胞是体外培养的来⾃单⼀克隆的肝细胞，排除了他类型细胞的⼲扰，如Kupper细胞、中性粒细胞等会产⽣ROS、对抗氧化效应；3，考虑到异丙酚的药理结构是⾼度脂溶性具有酚基团[28]，易在脂质环境药效。⽽体外实验不能完全模拟体内环境，前者需要更⾼的浓度才能起效。
虽然我们的研究表明ERK磷酸化可以被异丙酚激活并且对于它的抗凋亡作⽤是必需的，我们并不能排除其他⼀些激酶也参与这个过程的可能，如PI-3K、PKB等[29, 30]。基于我们⽬前的研究，有必要进
⼀步检测在其他缺⾎再灌注模型中，如低渗应激、缺养/复氧或者机械过载等，是否异丙酚也能激活MEK-ERK 通路。此外，Acquviva等发现异丙酚可以通过改变HO-1的表达，是否参与其抗凋亡作⽤尚不清楚[31]。并且，对于ERK是否涉及异丙酚处理后的Bcl-2家族蛋⽩磷酸化也未知。所以有必要继续深⼊进⾏探索研究。
纵观本⽂，我们的结果揭⽰在H2O2引起的应激，异丙酚对肝细胞的保护作⽤可能部分的通过激活ERK通路以及下调Bax和Bad的表达起作⽤。因⽽，我们的研究提供了新的证据：异丙酚对肝细胞没有潜在的损害性，适⽤于肝移植及其他外科⼿术的⿇醉。
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B
