生物物理学报2011年7月第27卷第7期: ACTA BIOPHYSICA SINICA Vol.27No.7Jul.2011:569-587 569-587
85年属什么生肖
电压敏感染料成像技术及其
在神经科学中的应用
xxx日本护士廖文凯1，吴建永2，耿新玲3
1.首都医科大学基础医学院，北京100069；
2.Department of Physiology and Biophysics,Georgetown University Medical Center,Washington,DC;
3.首都医科大学生物医学工程学院，北京100069
收稿日期：2011-06-09；接受日期：2011-06-12
基金项目：美国国立卫生研究所基金(NS059034)、首都医科大学校自然基金(2011ZR06)
通讯作者：耿新玲，电话：(010)83911551，E-mail：gengxl@ccmu.edu
摘要：电压敏感染料成像（voltage nsitive dye imaging，VSDI）技术利用结合在神经细胞脂膜
上的染料，将膜电位转化为荧光或光吸收信号，并用光学成像方法对神经电活动进行多点测量。
VSDI在过去的50年内发展迅速，其良好的时空分辨率使它成为一种在介观（mesoscopic）时空
尺度上研究神经元群体电活动的实用技术。这项技术对探索大脑功能和研究神经系统疾病有着
重要的贡献。本文首先对该技术的发展历史做一简单介绍，接下来简述当今世界上这一领域的
主要研究内容，以及该技术的发展前景。
关键词：电压敏感染料；光学成像；时空模式；兴奋波；皮层
中图分类号：Q424
DOI：10.3724/SP.J.1260.2011.00569
引言泡酸菜
从初级的感觉信息处理、运动协调到高级的意识和思维活动，都需要脑内数以千万计
的神经元相互关联地活动并组成功能网络。这张网络错综复杂，只监视其中单一或少数神
经元的活动很难解释脑的功能，就像只看电视机屏幕上的少数像素不能理解剧情一样。所
以，研究神经元的群体活动对了解脑的功能有重要意义。统观各种神经电生理研究方法：
微电极和膜片钳等方法多被用来在微观尺度上记录少数几个神经元的电信号，脑电图、脑
磁图和功能核磁共振等技术常被用在宏观尺度上记录大规模的脑活动。而在这两类方法之
间的介观尺度(mesoscopic scale，即时间尺度为1～100ms、空间尺度为10～10000μm的
量级)上，应用电压敏感染料和光学成像(voltage nsitive dye and optical imaging，VSDI)
技术，可以获得很好的时空分辨率，使得我们可以在神经元群体、皮层功能柱等层次上，
研究脑的信息处理、记忆形成、功能可塑性及病理过程等，以进一步解释脑的功能[1]。
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图1电压敏感染料的信号及化学结构式(A)从乌贼巨轴突上记录到的动作电位。电信号(点线)和光信号(实线)完全吻合，说明染料信号的速度很快，并在生理范围内与膜电位成线性关系。同时，Y 轴的两个标尺在膜电位变化达约100mV 时，光信号只在静息光强度上增加千分之一左右[4]。(B)两种实用染料的化学结构式。上为吸收型染料RH482(又称NK3630)，主要用在脑片实验中。下为荧光型染料RH1691，主要用于整体动物实验(如图5)。这种染料是近年来合成的“蓝色”染料，因为其激发光波长与血红蛋白的吸收波长不同，故用于整体动物实验时，受脉搏波动的干扰较小[5]。在日本东京医科齿科大学Sato 博士的网站上(square.umin.ac.jp/optical/optical/dye.html )有更多染料的化学结构式
Fig.1Signals and chemical structures of VSD (A)Simultaneous voltage nsitive dye (dots)and intracellular (line)recordings from a squid giant axon.The axon is stained with an absorption dye.The two signals follow each other precily,providing the first evidence that dye signal is membrane potential dependent.Note that while the linearity and temporal respon of the dye signal are excellent,the amplitude of the dye signal is small,only about 0.1%change from the resting light level per 100mV changes in membrane potential (Reprint from Ross and others,1977,with permission from Springer)[4].
(B)Structural formula of commonly ud voltage-nsitive dyes.Top is RH482(aka NK3630),an absorption dye ud for imaging neuronal activity in brain slices.Bottom is RH1691,a fluorescent dye commonly ud for imaging cortex in vivo .It is one of newly developed "blue"dyes,which has small pulsation artifacts for imaging cortex in vivo [5].Structural formulae for more dyes can be found in square.umin.ac.jp/optical/optical/dye.html
(A)Dye signal of membrane potential
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(B)Voltage nsitive dyes Intracellular VSD 1ms
50mV
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5×10－4Redrawn from Ross et al .,1977Absorption dye RH482
Fluorescent dye RH1691
N
N
N N O C 3H 7C 3H 7
SO 3－SO 3－O －O －N N N S S HO
CH 3
Cl HO 3S
OCH 3nsitive dye ，VSD )应用于乌贼巨轴突的电生理研究中，以增加光学信号的强度。这种用
染料帮助产生的光信号相应地被称作“外源性光信号”。染料分子吸附在神经细胞膜的外表
面，而细胞脂膜的厚度只有3nm 左右，当神经细胞兴奋而产生动作电位时，虽然电压只有
0.1V 左右，相应的电场强度却可以达到3×107V/m ，足以影响吸附在细胞膜上的染料分子
的结构，或影响分子周围的微环境，使得染料分子对光的吸收光谱或荧光光谱产生变化。实验表明，染料分子对光的吸收谱或荧光谱的变化与膜电位的变化在很大范围内是线性的北京市小客车摇号查询
关系，并且能达到微秒级的响应速度，因此，电压敏感染料信号可以忠实地记录单个动作
电位[4](图1)。
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图2Cohen 研究组这张照片摄于上世纪80年代，那时他们已经把VSD 方法逐渐发展成一项实用的实验室工具。在上世纪70年代，他们筛选了上千种物质以寻找最合适的染料。钙敏感光学染料也是从他们的研究中发展起来的。Cohen 研究组隶属于耶鲁大学，但夏天在马萨诸塞州伍兹霍尔(Woods Hole ，MA )的海洋生物实验室，用乌贼巨轴突做筛选染料的实验。这张照片就是在伍兹霍尔拍摄的，从左到右分别是Kamino 的妻子和女儿、Grinvald 的妻子和儿子、Grinvald 、Cohen 、Kamino 、Kamino 的女儿、Brian Salzburg 和Bill Ross Fig.2Cohen's group The picture was taken in early 1980s.At that time ，the Cohen group were about to make VSD methods a uful tool.In the 1970s,the group screened hundreds of dyes to find the best one.Ca 2+imaging dye was a branch of their efforts.The group was bad at Yale University but they spent summer at Marine Biological Lab at Woods Hole,MA.The picture was taken at Woods Hole.From left,Kamino's wife and daughter,Grinvald's wife and son,Grinvald,Cohen,Kamino,Kamino's daughter,Brian Salzburg,Bill Ross
该染料既可以与神经元细胞膜稳定结
合，又能比较方便地透过神经细胞的
外围组织染到细胞。这些从早期工作
中找到的染料直到今天仍在使用。在
Cohen 小组的影响下，寻找染料的工
作由最先的发展电压敏感染料成像技
术延伸到发展钙离子敏感染料成像技
术，由发展神经活动的光记录延伸到
其他荧光探测分子的成像技术。这些
技术到今天都已经形成了独立的大领
域，对生命科学的贡献也远远超过了
电压敏感染料成像技术，而电压敏感
染料成像技术却始终是一个很小的研
究领域。到目前为止，在PubMed 中
搜索到的应用电压敏感染料成像技术
进行神经科学研究的相关论文只有
2000篇左右。在世界范围内，近十年
来使用此技术发表5篇以上论文的小
组也只有约20个(表1)。限制这个领
域发展的主要原因有两个：一是其光
信号太弱，由膜电位变化引起的染料
信号变化只有静息时背景光强的万分之一到百分之一；二是选择性差，化学染料对神经细
胞或胶质细胞没有选择，对神经细胞中的兴奋或抑制细胞也没有选择。相比之下，钙敏感
染料的信号是静息光强的0.1倍甚至几倍。而近年来高速发展的“光学遗传学”
(optogenetics )方法可以将病毒携带的钙敏感染料的基因[7]，精确地在一类特异的兴奋或抑制
细胞上选择性表达[8]；还可以携带光敏离子通道[9]，达到同时用光学方法选择性地刺激和记
录不同种类神经细胞的目的。看起来，传统的电压敏感染料似乎已经大大地落后了。但是
钙敏感染料的时间分辨率很低，只能达到百毫秒数量级，比一般神经电活动都要慢。因此，要研究神经活动的动态过程，传统电压敏感染料目前仍是最有效的工具。比如，在大脑皮
层上出现的螺旋波每秒要转十圈左右[10,11]，因此要求染料的时间分辨率至少要达到毫秒数量
级。由于篇幅所限，本文只介绍“快信号”电压敏感染料[12]技术及其在神经元群体活动
(population activity )方面的应用实例
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VSD 信号与光电二极管阵列记录技术
炸鸡排的做法VSD 的信号小并不是指光强度低，而是指信号只是背景光上的一个小变化，其相对幅
度只有10－5～10－2；另外，信号变化很快，像神经动作电位只有不到2ms ，皮层上的群体活
动也只能持续几十毫秒。这种又小又快的信号不可能被眼睛看到，也不可能被普通CCD 和
以是什么意思
CMOS 照相机记录到。为了记录VSD 信号，Cohen 小组在1970年左右发展了一种技术，让成像装置的每个像素拥有自己独立的两级放大器，这样就能忽略背景光的直流成分而只
以色列魏茨曼科学研究所(Weizmann Institute of Science)
Grinvald A,Hildesheim R 日本东京医科齿科大学(Tokyo Medical and Dental University)
Momo-Sato Y,Sato K 美国乔治城大学医学中心(Medical Center ，Georgetown University)
Wu JY 日本庆应义塾大学(Keio University)
Okada Y,Masamoto K 德国明斯特大学(Westf 覿lische Wilhelms-Universit 覿t M ünster)
Speckmann E-J 日本RIKEN 脑科学研究所(RIKEN Brain Science Institute)
Arata A,Kn 觟pfel T,Ichikawa M,Yamakawa K 美国康涅狄格大学卫生中心(Health Center ，University of Connecticut)
Loew LM,Antic SD 英国牛津大学(University of Oxford)
瑞士Ecole Polytechnique Federale de Lausanne (EPFL)
日本产业技术总合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science
and Technology)
美国宾夕法尼亚大学医学院(School of Medicine ，University of Pennsylvania)美国纽约大学医学院(School of Medicine ，New York University)东京药科大学(Tokyo University of Pharmacy and Life Science)美国阿拉巴马大学伯明翰分校(University of Alabama at Birmingham)德国马克斯普朗克生物化学研究所(Max Planck Institute for Biochemistry)美国威斯康星大学麦迪逊医学与公共健康学院(Madison School of Medicine and Public Health ，University of Wisconsin)美国加利福尼亚大学圣地亚哥分校(University of California ，San Diego)
Greenfield SA Petern C Takashima I Salzberg BM,Coulter DA
Llinas RR
Manabe T,Miyakawa H
Hablitz JJ
Fromherz P
Jackson MB
Kristan WB Jr 在PubMed 中搜索应用VSDI 进行神经科学研究的相关论文，按作者单位大致归类得出近十年来比较活跃(文章数≥5)的上述研究组
Searching "voltage nsitive dye imaging"in PubMed,active groups are defined as more than 5articles published in the past ten years
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图3Cohen 研究组早期使用的成像设备(A)上图是用来从显微镜的成像平面检测信号的装置。当时计算机尚未用于生物实验，故8道同时记录需要使用4台示波器来实现。下图左、右分别为光检测器的正面观和顶面观。
(B)Centronics 公司生产的128通道光电二极管阵列。这个阵列可以同时记录128通道的信号，但每个二极管上都需要布线，这妨碍了更多二极管的使用。这种光电二极管阵列一直到2004年还在使用[10]。(C)Centronics 公司生产的464通道光电二极管阵列。这个设计把464条信号输出线改到下面，这样光线就不会被引线挡住。但是，每个二极管的传出线是用导电胶粘在基片上的，由于胶容易断裂而导致很多坏的通道，这种设计只持续了很短的时间[13～15]，之后便被用光纤的光电二极管阵列(WuTech )所取代
Fig.3VSDI devices ud by the Cohen group in their early works (A)Top:a few photodetectors were ud to collect light from the image plane of the microscope.Bottom:front view (left)and top view (right)of the device,about 16diodes were ud.(B)The 128-channel diode array developed by Centronics.This array could allow 128channels of recording,but it needed the wires on top of each individual diode.The wires blocked some light,preventing more diodes to be ud.This array was ud until 2004[10].(C)The Centronics 464diode array.This design had improved the light efficiency by putting output wires on the bottom of the diode chip,so that the diodes were not blocked by wires.
However,conductive glue was ud to connect the diodes to their output wires which often broke,leading to many dead channels.This type of array only lasted for a short time [13～15]and was soon replaced by the fiber-optic array developed by WuTech Instruments
(A)(B)
(C)
倍，但所有像素只能通过一个或少数几个通道输出，整个系统只有一个到少数几个放大器，因此其信噪比远不如光电二极管阵列。图4所示为这种设计的一种商用装置，其型号为WuTech-469V 。这个系统使用469个单个光电二级管，并用一束光导纤维把成像平面上的光信号低损耗地馈给每个二极管，这样就避免了集成电路二极管阵列低效率、低可靠性和极高设计价格的缺陷。此装置还同时把464个放大器紧凑地装在同一个小盒子里，使之能稳定工作，互不干扰。这个系统是目前使用VSD 成像技术研究神经元群体活动的一种实用573
