［２１］ ＫＯＮＧＷ，ＹＡＮＧＨ，ＨＥＬ，ｅｔａｌ．ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１５５ｉｓｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙ
ｔｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒβ／ＳｍａｄｐａｔｈｗａｙａｎｄｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓｔｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｐｌａｓｔｉｃｉｔｙｂｙｔａｒｇｅｔｉｎｇＲｈｏＡ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌ ｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２００８，２８（２２）：６７７３－６７８４．
［２２］ 陈淑如，黄宇康，吴楚成，等．ｍｉＲ－１５５对乳腺癌细胞增殖、凋
亡及耐药蛋白表达的调控作用研究［Ｊ］．临床肿瘤学杂志，
２０１５，２０（０２）：１０８－１１１．
ＣＨＥＮＳＲ，ＨＵＡＮＧＹＫ，ＷＵＣＣ，ｅｔａｌ．ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｍｉＲ－１５５ｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｒｏ ｔｅｉｎｓｉｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ，２０１５，２０（０２）：１０８－１１１．
（编校：蔺癑）
ＡＬＤＨ１Ａ１增强乳腺癌细胞血管生成因子表达并促进共培养ＨＵＶＥＣ细胞小管形成和侵袭能力
赵洪玉，阿不都艾尼·图尔逊，范明江
ＡＬＤＨ１Ａ１ｅｎｈａｎｃｅｓｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｆａｃｔｏｒｉｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓａｎｄｐｒｏ
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ＳｕｒｇｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙｏｆＢｒｅａｓｔａｎｄＴｈｙｒｏｉｄ，ｔｈｅＦｉｒｓｔＰｅｏｐｌｅ＇ｓＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＫａｓｈｇａｒ，ＸｉｎｊｉａｎｇＫａｓｈｇａｒ８４４０００，Ｃｈｉｎａ．
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｍａｒｋｅｒａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ１Ａ１（ＡＬＤＨ１Ａ１）ｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｎｇｉｏｇｅｎｉｃｆａｃｔｏｒｓｉｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓａｎｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｔｕｂｕｌｅｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎ
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ＤＨ１Ａ１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｅｃｒｅａｓｅｉｎｔｕｂｕｌｅｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｖｅａｂｉｌｉｔｙｏｆｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｄＨＵＶＥＣｃｅｌｌｓ．Ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＡＬＤＨ１Ａ１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｐｒｏｍｏｔｅｄｔｕｂｕｌｅｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｏｆｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｄＨＵＶＥＣｃｅｌｌｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｉｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ，ＡＬＤＨ１Ａ１ｕｐ－ｒｅｇｕ ｌａｔｅｓｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｎｇｉｏｇｅｎｉｃｆａｃｔｏｒｓａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｓｔｈｅａｎｇｉｏｇｅｎｉｃｃａｐａｃｉｔｙｏｆｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｂｙａｃｔｉｖａｔｉｎｇＨＩＦ－１αａ
ｎｄｒｅｔｉｎｏｉｃａｃｉｄｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓ，ｔｈｅｒｅｂｙｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｔｕｍｏｒｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ．【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】ｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ，ａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ１Ａ１，ｒｅｔｉｎｏｉｃａｃｉｄ，ｈｙｐｏｘｉａｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ－１α，ｉｎｖａｓｉｏｎ，ａｎ ｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ
ＭｏｄｅｒｎＯｎｃｏｌｏｇｙ２０２１，２９（０４）：０５５２－０５５９
【收稿日期】 ２０２０－０４－２８
【基金项目】 新疆维吾尔族自治区科技支疆项目（编号：２０１７Ｅ０２６３）
【作者单位】 喀什地区第一人民医院乳腺甲状腺肿瘤外科，新疆 喀什 ８４４０００
【作者简介】 赵洪玉（１９８５－），男，青海西宁人，主治医师，主要从事乳腺甲状腺肿瘤及消化道肿瘤的临床研究。Ｅ－ｍａｉｌ：５９１０８８５８２＠ｑｑ．ｃｏｍ【通讯作者】 范明江（１９７３－），男，新疆奎屯人，副主任医师，主要从事乳腺及甲状腺疾病的临床研究。Ｅ－ｍａｉｌ：Ｍｉｎｇｊｉａｎｇ＿Ｆ１１＠１６３．ｃｏｍ
·２５５·赵洪玉，等 ＡＬＤＨ１Ａ１增强乳腺癌细胞血管生成因子表达并促进共培养ＨＵＶＥＣ细胞小管形成和侵袭能力
【摘要】 目的：探讨干细胞标志物醛脱氢酶１Ａ１（ＡＬＤＨ１Ａ１）对乳腺癌细胞血管生成因子表达的影响，以及对与乳腺癌细胞共培养的ＨＵＶＥＣ细胞小管形成和侵袭能力的影响。方法：采用免疫组化检测了乳腺癌组织和乳腺增生组织中Ａ
ＬＤＨ１Ａ１的表达。使用ＡＬＤＨ１Ａ１ｓｈＲＮＡ或过表达ＡＬＤＨ１Ａ１的ｐｃＤＮＡ３．１质粒转染乳腺癌细胞（ＭＣＦ－７和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１），通过ｑＲＴ－ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测敲低或过表达ＡＬＤＨ１Ａ１对乳腺癌细胞中血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）、缺氧
诱导因子－１α（ＨＩＦ－１α）和白细胞介素－１２（ＩＬ－１２）表达的影响。通过用１μｍｏｌ／Ｌ的外源性ＲＡ和ＲＡＲ阻断剂（ＡＧＮ１９３１０９）处理乳腺癌细胞４８ｈ来考察视黄酸信号通路是否参与ＡＬＤＨ１Ａ１对ＶＥＧＦ和ＨＩＦ－１α的调控过程。将乳腺癌细胞（ＭＣＦ－７和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）和ＨＵＶＥＣ细胞共培养来模拟肿瘤形成的微环境，并检测ＨＵＶＥＣ的小管形成能力和细胞侵袭能力。结果：乳腺癌组织的ＡＬＤＨ１Ａ１染色平均光密度显著高于乳腺增生组织，并且淋巴结转移的乳腺癌组织显著高于未淋巴结转移的乳腺癌组织（Ｐ＜０．０５）。敲低ＡＬＤＨ１Ａ１可显著降低ＭＣＦ－７和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞中ＶＥＧＦ和ＨＩＦ－１α蛋白表达，并上调ＩＬ－１２蛋白表达。然而，上调ＡＬＤＨ１Ａ１表达则可逆转上述变化。外源性ＲＡ处理可显著上调ＭＣＦ－７和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞中ＶＥＧＦ和ＨＩＦ－１α的表达，然而，ＲＡＲ阻断剂处理可抑制ＭＣＦ－７和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞中ＶＥＧＦ和ＨＩＦ－１α的上调。敲低乳腺癌细胞中ＡＬＤＨ１Ａ１的表达可导致共培养的ＨＵＶＥＣ细胞的小管形成能力和侵袭能力显著降低。而上调乳腺癌细胞中ＡＬＤＨ１Ａ１的表达则可显著促进共培养的ＨＵＶＥＣ细胞的小管形成能力和侵袭能力。结论：在乳腺癌细胞中，ＡＬＤＨ１Ａ１通过激活ＨＩＦ－１α和视黄酸信号通路来上调血管生成因子的表达并提高共培养的内皮细胞的血管生成能力，从而增加肿瘤的侵袭性。
【关键词】乳腺癌；醛脱氢酶１Ａ１；视黄酸；缺氧诱导因子－１α
；侵袭；血管生成【中图分类号】Ｒ７３７．９ 【文献标识码】Ａ ＤＯＩ：１０．３９６９／
ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－４９９２．２０２１．０４．００３【文章编号】１６７２－４９９２－（２０２１）０４－０５５２－０８
在肿瘤进展中，血管生成发挥重要作用，其可通过促进
肿瘤相关新生血管的形成来增加肿瘤的侵袭性［１－２］。血管
生成可使肿瘤细胞进入循环系统，从而促进肿瘤细胞转
移［３］
。促进基质和内皮细胞生长和迁移的因子可由内皮细胞、肿瘤细胞和癌症干细胞表达并分泌［
祝福老人的祝福语４］
。前人研究发现癌症干细胞可通过产生白细胞介素－８（ＩＬ－８）、血管内皮生长
因子（ＶＥＧＦ）等因子来调节肿瘤新生血管的形成［５］
。因此，
减弱癌症干细胞的侵袭性可通过抑制内皮细胞对血管生成因子的反应性以及肿瘤细胞中的促血管生成表型来实现。醛脱氢酶１Ａ１（ＡＬＤＨ１Ａ１）与癌症干细胞的分化、增殖和耐药
性密切相关，其是癌症干细胞的可靠标记物［６－７］。目前，尚
不清楚ＡＬＤＨ１Ａ１在介导乳腺癌干细胞中的血管生成表型和肿瘤新血管形成中的作用。此外，有报道指出，ＡＬＤＨ１Ａ１异构酶可将视黄醛氧化成视黄酸（
ＲＡ）。视黄酸通过视黄酸受体（ＲＡＲ）调节多种基因的表达，这些受体控制具有视黄酸反应元件（ＲＡＲＥ）的靶基因转录［８］
。还有研究报道了视黄酸
诱导基因的差异表达影响一些乳腺癌细胞系的生长和转移
性
［９］
。本研究以人乳腺癌细胞系ＭＣＦ－７和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１为实验材料，旨在考察ＡＬＤＨ１Ａ１是否调节乳腺癌细胞血管生成因子的表达，及其对肿瘤血管生成的可能影响机制。
１ 材料与方法１．１ 细胞培养
人乳腺癌细胞系ＭＣＦ－７和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１购自美国典型培养物保藏中心。Ｍ
ＣＦ－７细胞可表达孕激素受体（ＰＲ）和雌激素受体（ＥＲ）。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞为三阴性乳腺癌（ＴＮＢＣ）细胞，ＴＮＢＣ是乳腺癌的常见生物亚型，其病理特征是ＰＲ、ＥＲ阴性和原癌基因ＨＥＲ－２阴性。将ＭＣＦ－７细胞和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞培养在高糖ＤＭＥＭ培养基中，培养基中添加２ｍｍｏｌ／Ｌ谷氨酰胺、１０％胎牛血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬ青霉素和０．１ｍｇ／ｍＬ链霉素，培养条件为３７℃５％ＣＯ２
。培养基购自赛默飞世尔科技有限公司。人脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）由美国ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ公司提供，将其在内皮生长培养基（ＥＧＭ－２）中培养，培养基中含有ｈＥＧＦ、ｈＦＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｒ３－ＩＧＦ－１、抗坏血酸、氢化可的松、肝素、１０％ＦＢＳ、ＧＡ－１０００、１００Ｕ／ｍＬ青霉素、０．１ｍｇ／ｍＬ链霉素、２ｍｍｏｌ／Ｌ谷氨酰胺，培养条件为３７℃５％ＣＯ２。１．２ 乳腺癌细胞的转染
将ＭＣＦ－７和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞进行传代培养，选择３～５代之间的细胞进行实验。将细胞接种在６孔板上，并用含有乱序（ｓｈ－Ｃｏｎｔｒｏｌ）或两个ＡＬＤＨ１Ａ１ｓｈＲＮＡ（ｓｈ－ＡＬＤＨ１Ａ１）序列并表达嘌呤霉素（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）抗性基因的慢病毒颗粒转染（Ｓ
预备党员考察表ｉｇｍａ）。转染３６ｈ后，向细胞中加入２μｇ／ｍＬ的嘌呤霉素，然后进行３天筛选。将筛选细胞培养在含有１μｇ／ｍＬ的嘌呤霉素的完全ＤＭＥＭ培养基中（赛
经典英文文章默飞世尔科技有限公司）。另外，使用过表达ＡＬＤＨ１Ａ１的ｐｃＤＮＡ３．１质粒以及阴性对照质粒（空载质粒）转染细胞。ｐｃＤＮＡ３．１质粒产自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，过表达ＡＬＤＨ１Ａ１的ｐｃＤＮＡ３．１质粒委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
将Ｍ
ＣＦ－７和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞用外源性ＲＡ（１μｍｏｌ／Ｌ）处理４８ｈ，并且用ＲＡＲ阻断剂（ＡＧＮ１９３１０９，１μ
ｍｏｌ／Ｌ）处理细胞４８ｈ，主要用于考察视黄酸信号通路在血管生成中的作用。
１．３ ＲＮＡ提取和ｑＲＴ－ＰＣＲ
采用ｍｉｒＶａｎａｍｉＲＮＡ分离试剂盒（Ａｍｂｉｏｎ）提取ＭＣＦ－７和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞的总ＲＮＡ。使用ＲＮｅａｓｙＰｌｕｓ试剂盒（Ｑｉａｇｅｎ）按照制造商的说明制备总ＲＮＡ。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＲｅ ｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）用于逆转录１μｇＲＮＡ，使用ＱｕａｎｔｉＮｏｖａＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲＫｉｔ（Ｑｉａｇ
ｅｎ）在Ｒｏｔｏｒ－ＧｅｎｅＱ实时荧光定量ＰＣＲ分析仪（Ｑｉａｇｅｎ）中进行ｑＲＴ－ＰＣＲ。甘油醛３－磷酸脱氢酶（ＧＡＰＤＨ）作为内参基因。引物序列如下：ＡＬＤＨ１Ａ１正向：ＡＧＴＧＡＡＧＧＧＴＴＧＧＧＧＡＣＣＴＡＧＧＴＴＴＡ，反向：ＴＧＴＣＣＡＡＧＧＧＴＴＧＴＡＣＴＴＴＴＴ；ＶＥＧＦ正向：ＴＣＡＡＣＣＡＣ
·
３５５·现代肿瘤医学 ２０２１年０２月 第２９卷第０４期 ＭＯＤＥＲＮＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ｆｅｂ ２０２１，ＶＯＬ ２９，Ｎｏ ０４
玫瑰精油的功效
ＧＣＧＴＡＣＡＣＣＡＴＣＴＣ，反向：ＣＡＡＡＡＣＣＣＴＣＡＣＣＡＧＡＣＴＣＴＡＧＴ；ＨＩＦ－１α正向：
ＧＣＡＡＣＣＣＴＴＡＴＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＴＧ，反向：
ＧＧＴＧＴＣＧＧＧＴＡＧＴＣＴＴＴＡＴＴＧＧ；ＩＬ－１２正向：ＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＣＡＡＣＡＧＡＧＡＡＧＧ，反向：ＣＣＡＡＧＣＡＡＴＧＣＡＧＧＧＣＴＣＡＧＡＧＴＴ；ＧＡＰＤＨ正向：ＧＴＴＡＧＴＧＡＡＡＡＣＧＡＴＧＣＡＧＴＴＣＧＧＡ，反向：ＣＣＧＡＴＴＣＧＡＡＡＧＣＡＣＣＣＣＴＣＴＴＧＣＣＧＡ。ｍＲＮＡ的相对表
达量使用２
－ΔΔ
Ｃｔ方法计算。１．４ Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ
将细胞在ＲＩＰＡ缓冲液中裂解，然后细胞裂解物以１６０００×ｇ在４℃离心２０ｍｉｎ，收集上清液。使用ＢＣＡ蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度（美国ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司）。将等量的蛋白质在１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳并转移至ＰＶＤＦ膜，将膜在５％脱脂乳中室温下封闭３０ｍｉｎ，然后与ＡＬＤＨ１Ａ１（１∶１０００）、ＨＩＦ－１α（１∶２０００）、ＶＥＧＦ（１∶１０００）、ＩＬ－１２（１∶１５００）和β－ａｃｔｉｎ（１∶１０００）一抗孵育过夜，然后
与辣根过氧化物酶标记的二抗在室温下孵育２ｈ，抗体均购自ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司。通过增强型ＥＣＬ化学发光检测试剂盒显影（上海翊圣生物科技有限公司）。β－ａｃｔｉｎ作为内部对照。
１．５ 乳腺癌细胞与人脐静脉内皮细胞的共培养
分别将１×１０５
个ＭＣＦ－７或ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞接种
到Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上室，将１×１０５个ＨＵＶＥＣ细胞接种到下室，上
下室均加入１％ＦＢＳ的ＥＢＭ细胞培养液，然后将细胞在３７℃、５％ＣＯ２环境中过夜培养。第二天将上室ＭＣＦ－７或ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞转移到下室与ＨＵＶＥＣ细胞共培养，模拟肿瘤生长微环境。另外，将Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上室和下室分别单独接种Ｍ
ＣＦ－７或ＭＤＡ－ＭＢ－２３１和ＨＵＶＥＣ细胞进行对照，培养时间为７天。１．６ 小管形成测定
将与ＭＣＦ－７或ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞共培养和单独培养的ＨＵＶＥＣ细胞接种到９６孔板上（２×１０４
个细胞／孔）。使用倒置显微镜观察２４ｈ内每个孔中形成的小管。随机取三个视野来计算不同处理下的小管形成程度，参考对照组的小管形成程度来计算相对小管形成能力。１．７ 伤口愈合实验
将与ＭＣＦ－７或ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞共培养和单独培养的ＨＵＶＥＣ细胞（１×１０６
个细胞／ｍＬ）接种在２４孔板中，细胞达到９
０％融合后，用１０μＬ移液管尖端刮擦板的表面制造无细胞的划痕。用ＰＢＳ洗涤３次除去漂浮和分离的细胞，然后加入无血清培养基。在０和２４ｈ，使用显微镜获取图像。１．８ 细胞侵袭实验
使用６．５ｍｍ直径的聚碳酸酯纤维（８μｍ孔径）ＣｏｓｔａｒＴｒａｎｓｗｅｌｌ板进行细胞侵袭测定。过滤器的下表面涂覆１０μｇ明胶。下室中加入含有５％ＦＢＳ的新鲜Ｍ１９９培养液。然后将与ＭＣＦ－７或ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞共培养和单独培养的
ＨＵＶＥＣ细胞（１×１０６个细胞／ｍＬ）接种到过滤器的上表面。
将小室在常氧条件下孵育２４ｈ，去除过滤器上表面的非侵袭
细胞，倒置显微镜观察侵袭细胞数量，每孔随机取５个视野计算侵袭量，根据对照组的侵袭细胞数量来计算相对侵袭能力。
１．９ 乳腺癌标本及免疫组化染色
本研究收集了我院病理实验室保存的４０例乳腺癌患者的乳腺癌组织病理切片，其中２０例发生淋巴结转移，２０例未转移。另外收集了２
０例乳腺增生患者的乳腺组织切片。切片经抗原修复后，用含有５％山羊血清的ＰＢＳ封闭１ｈ。然
后与ＡＬＤＨ１Ａ１（１∶１０００）在４℃下孵育过夜，并用ＰＢＳ洗涤。然后，将切片与抗兔ＩｇＧ室温孵育２ｈ，并用３，３－二氨基联苯胺（
ＤＡＢ）染色。抗体均购自ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司。通过ＩｍａｇｅＰｒｏ分析结果并表示为平均光密度（ＭＯＤ）。１．１０ 统计学分析
本研究使用ＳＰＳＳ１８．０软件进行统计学处理，所有数据均表示为均数±标准差。组间差异通过单因素方差分析和ＬＳＤ检验进行比较，Ｐ＜０．０５表示组间差异有统计学意义。２ 结果
２．１ ＡＬＤＨ１Ａ１在乳腺癌组织和乳腺增生组织中的表达
什么的爬山虎
本研究采用免疫组化方法分别检测了４０例乳腺癌组织（包括２０例淋巴结转移和２０例未淋巴结转移）和２０例乳腺增生组织中的ＡＬＤＨ１Ａ１表达情况，结果显示（图１），ＡＬＤＨ１Ａ１主要在胞浆内阳性表达，乳腺癌组织的ＡＬＤＨ１Ａ１染色平均光密度显著高于乳腺增生组织，并且淋巴结转移的乳腺癌组织显著高于未淋巴结转移的乳腺癌组织（Ｐ＜０．０５
）。２．２ ＡＬＤＨ１Ａ１在乳腺癌细胞ＭＣＦ－７和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１中的表达
为了揭示敲低或过表达ＡＬＤＨ１Ａ１对乳腺癌细胞功能的影响，本研究使用ＡＬＤＨ１Ａ１ｓｈＲＮＡ或过表达ＡＬＤＨ１Ａ１的ｐｃＤＮＡ３．１质粒转染ＭＣＦ－７和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞，
研究显示，转染ｓｈ－ＡＬＤＨ１Ａ１显著降低了ＭＣＦ－７和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞的ＡＬＤＨ１Ａ１ｍＲＮＡ和蛋白表达。此外，使用过表达Ａ
ＬＤＨ１Ａ１的ｐｃＤＮＡ３．１质粒转染ＭＣＦ－７和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞显著上调了ＡＬＤＨ１Ａ１ｍＲＮＡ和蛋白表达（图２）。
２．３ ＡＬＤＨ１Ａ１对乳腺癌细胞ＭＣＦ－７和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１中血管生成相关因子表达的影响
前人研究显示，ＶＥＧＦ在乳腺肿瘤血管生成中发挥重要
作用，肿瘤细胞中ＶＥＧＦ的转录由ＨＩＦ－１α介导
［１０－１１］
，此外，其他研究者发现白细胞介素１２（ＩＬ－１２）是一种抗血管生
成因子［１２］
。本研究检测了敲低或过表达ＡＬＤＨ１Ａ１对
ＶＥＧＦ、ＨＩＦ－１α和ＩＬ－１２表达的影响。研究显示（图３），敲低ＡＬＤＨ１Ａ１导致ＭＣＦ－７和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞中ＶＥＧＦ和ＨＩＦ－１α蛋白表达显著降低，然而，敲低ＡＬＤＨ１Ａ１导致ＩＬ－１２蛋白显著升高。而上调ＡＬＤＨ１Ａ１的表达则可显著上调细胞中ＶＥＧＦ和ＨＩＦ－１α蛋白表达并抑制ＩＬ－１２蛋白表达。
·４５５·赵洪玉，等 ＡＬＤＨ１Ａ１增强乳腺癌细胞血管生成因子表达并促进共培养ＨＵＶＥＣ细胞小管形成和侵袭能力
图１ ＡＬＤＨ１Ａ１在乳腺癌组织和乳腺增生组织中的表达
Ａ：平均光密度；Ｂ：ＡＬＤＨ１Ａ１在不同组织中的表达（免疫组化染色×２００）。与乳腺增生组织比较， Ｐ＜０．０５；与未淋巴结转移的乳腺癌组织比较，＃Ｐ＜０．０５。
Ｆｉｇ．１ ＡＬＤＨ１Ａ１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅａｎｄｂｒｅａｓｔｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａｔｉｓｓｕｅ
Ａ：Ｍｅａｎｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ．Ｂ：ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＬＤＨ１Ａ１ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓ（ＩＨＣ×２００）．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｂｒｅａｓｔｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａｔｉｓｓｕｅ， Ｐ＜０．０５．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅｗｉｔｈｏｕｔｌｙｍｐｈｎｏｄｅｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，＃Ｐ＜０．０５
．
图２ 转染ｓｈＲＮＡ和过表达ＡＬＤＨ１Ａ１的ｐｃＤＮＡ３．１质粒后乳腺癌细胞（ＭＣＦ－７和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）中的ＡＬＤＨ１Ａ１ｍＲＮＡ和蛋白表达
Ａ：ｑＲＴ－ＰＣＲ检测ｍＲＮＡ的相对表达量；Ｂ：Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测蛋白的相对表达量；Ｃ：典型蛋白条带。与Ｃｏｎｔｒｏｌ比较， Ｐ＜０．０５。Ｆｉｇ．２ ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＬＤＨ１Ａ１ｉｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ（ＭＣＦ－７ａｎｄＭＤＡ－ＭＢ－２３１）ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｓｈＲＮＡａｎｄｐｃＤＮＡ３．１ｐｌａｓｍｉｄｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ
ＡＬＤＨ１Ａ１
Ａ：ｑＲＴ－ＰＣＲｄｅｔｅｃｔｓｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍＲＮＡ．Ｂ：Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｄｅｔｅｃｔｓｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃ：Ｔｙｐｉｃａｌｐｒｏｔｅｉｎｂａｎｄ．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＣｏｎｔｒｏｌ， Ｐ＜
０．０５．２．４ ＡＬＤＨ１Ａ１对ＭＣＦ－７和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞视黄酸信号通路的影响
据报道，ＡＬＤＨ１Ａ１具有将视黄醛氧化成视黄酸（ＲＡ）的功能
［１３］
。为了确定ＡＬＤＨ１Ａ１对ＶＥＧＦ和ＨＩＦ－１α的调节
过程是否由视黄酸信号通路介导，本研究将敲低或过表达ＡＬＤＨ１Ａ１的ＭＣＦ－７和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞用１μｍｏｌ／Ｌ外源性ＲＡ处理４８ｈ。此外，用１μｍｏｌ／Ｌ的ＲＡＲ阻断剂
（ＡＧＮ１９３１０９）处理细胞４８ｈ。研究显示（图４），无论是上调或下调ＡＬＤＨ１Ａ１，外源性ＲＡ处理均可显著上调ＭＣＦ－７和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞ＶＥＧＦ和ＨＩＦ－１α的表达，然而，ＲＡＲ阻断剂处理可抑制ＭＣＦ－７和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞ＶＥＧＦ和ＨＩＦ－１α的上调。说明ＡＬＤＨ１Ａ１通过视黄酸信号通路介导其对ＭＣＦ－７和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞中ＨＩＦ－１α和ＶＥＧＦ的调控作用。
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５５５·现代肿瘤医学 ２０２１年０２月 第２９卷第０４期 ＭＯＤＥＲＮＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ｆｅｂ ２０２１，ＶＯＬ ２９，Ｎｏ ０４
易烊千玺图片
ppt插入gif图３ 敲低或过表达ＡＬＤＨ１Ａ１对乳腺癌细胞中ＶＥＧＦ、ＨＩＦ－１α和Ｉ
Ｌ－１２表达的影响
Ａ：ＶＥＧＦ蛋白相对表达量；Ｂ：ＨＩＦ－１α蛋白相对表达量；Ｃ：ＩＬ－１２蛋白相对表达量；Ｄ：典型蛋白条带。与Ｃｏｎｔｒｏｌ比较， Ｐ＜
０．０５。Ｆｉｇ．３ ＥｆｆｅｃｔｏｆｋｎｏｃｋｄｏｗｎｏｒｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＬＤＨ１Ａ１ｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＶＥＧＦ，ＨＩＦ－１αａ
ｎｄＩＬ－１２ｉｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ Ａ：ＲｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＶＥＧＦｐｒｏｔｅｉｎ．Ｂ：ＲｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＨＩＦ－１αｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃ：ＲｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩＬ－１２ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｄ：Ｔｙｐｉｃａｌｐｒｏｔｅｉｎｂａｎｄ．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＣｏｎｔｒｏｌ， Ｐ＜
０．０５
小蝴蝶怎么画
．图４ 外源性视黄酸（ＲＡ）及ＲＡＲ阻断剂（ＲＡＲｂ）对乳腺癌细胞中ＶＥＧＦ和ＨＩＦ－１α表达的影响
Ａ：ＶＥＧＦ蛋白相对表达量；Ｂ：ＨＩＦ－１α蛋白相对表达量。与Ｃｏｎｔｒｏｌ比较， Ｐ＜０．０５；与ｓｈ－ＡＬＤＨ１Ａ１比较，＃Ｐ＜０．０５；与ｐｃＤＮＡ３．１－ＡＬＤＨ１Ａ１
比较，＆Ｐ＜０．０５。
Ｆｉｇ．４ Ｅｆｆｅｃｔｏｆｅｘｏｇｅｎｏｕｓｒｅｔｉｎｏｉｃａｃｉｄ（ＲＡ）ａｎｄＲＡＲｂｌｏｃｋｅｒ（ＲＡＲｂ）ｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＶＥＧＦａｎｄＨＩＦ－１αｉｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ Ａ：ＲｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＶＥＧＦｐｒｏｔｅｉｎ．Ｂ：ＲｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＨＩＦ－１αｐｒｏｔｅｉｎ．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＣｏｎｔｒｏｌ， Ｐ＜０．０５．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｓｈ－ＡＬＤＨ１Ａ１，＃Ｐ＜０．０５．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｐｃＤＮＡ３．１－ＡＬＤＨ１Ａ１，＆Ｐ＜０．０５．
２．５ ＡＬＤＨ１Ａ１对ＭＣＦ－７和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１共培养的ＨＵＶＥＣ细胞小管形成能力和侵袭能力的影响
本研究通过将乳腺癌细胞（ＭＣＦ－７和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）和ＨＵＶＥＣ细胞共培养来模拟肿瘤形成的微环境，并检测了与乳腺癌细胞共培养的ＨＵＶＥＣ的小管形成能力和细胞
侵袭能力。研究显示（图５），敲低乳腺癌细胞（ＭＣＦ－７和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）中ＡＬＤＨ１Ａ１的表达可显著降低共培养的ＨＵＶＥＣ细胞的小管形成能力。研究显示（图６），敲低ＡＬＤＨ１Ａ１显著抑制共培养的ＨＵＶＥＣ细胞的侵袭能力。然而，上调乳腺癌细胞（ＭＣＦ－７和ＭＤ
Ａ－ＭＢ－２３１）中
·６５５·赵洪玉，等 ＡＬＤＨ１Ａ１增强乳腺癌细胞血管生成因子表达并促进共培养ＨＵＶＥＣ细胞小管形成和侵袭能力
