基因重叠延伸法合成基因的PCR方法标准操作规程（编号：042）1、目的及适用范围
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重叠延伸 PCR 技术(gene splicing by overlap extension PCR，简称 SOE PCR)由于采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。此技术利用 PCR 技术能够在体外进行有效的基因重组，而且不需要内切酶消化和连接酶处理，可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计。重叠延伸PCR 在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有其广泛而独特的应用。
2、主要仪器及试剂
PCR仪、凝胶成像仪、琼脂糖凝胶电泳仪、Pfu酶、dNTPs、Pfu buffer、去离子水
3、操作步骤
3.1 以引物A/B进行PCR1，以引物C/D进行PCR2，引物B/C中引入了需要的限制性位点；3.2 混合二者PCR产物，混合以前最好回收一下；
3.3 进行PCR延伸反应，只有右面这个可以延伸；学生会复试
3.4 以延伸反应的产物为模板，以A/D为引物进行PCR，产物即为所需最终产物。
3.5 PCR体系：
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引物模板各1μL （根据引物多少加入多少）
（片段模板各1μL 相应的小引物也各加入1μL）
10x Pfu buffer 5μLlistened
如何制作3d动画Pfu 酶0.5μL
去离子水根据计算加入
成熟男人网名总体积50μL
3.6 PCR程序：93℃ 1min， 58℃ 30s，72℃ 30s，30 cycles，72℃ 10 min
3.7 合成示意图（见下图）
4、注意事项
SOE 寡核苷酸引物上有两个部分，即“引发” 部分和“重叠” 部分。引发部分在寡核苷酸引物的 3'端，起引物作用；而重叠部分在寡核苷酸引物的 5' 端，与重叠延伸中待融合的 DNA片段互
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