重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计。可以有三种方法来设计引物，具体如下图所示。
引物F及R为基因两端特异引物，其中Fm及Rm为中间引物。其中引物Fm及Rm中间共享一段序列（至少10bp完全匹配，否则后续实验很难成功），突变点可以设计在Fm或Rm，也可以两条引物上都有突变点。突变点最好是位于引物的5’端，尽量避免出现在3’端。
2. 分别用引物F和Rm及Fm和R进行配对进行PCR。注意该步一定要用pfu酶，不要用Taq酶，因为Taq酶容易在PCR产物末端加A，从而可能会使产物移码突变。
3. 分别回收第2步所得两条PCR产物（一定要用胶回收，准确回收两条目的条带）。
4. 将第3步所得两份PCR产物进行混合使其互为模板及引物，加入dNTP及Pfu或Taq酶进行PCR。进行PCR约5-10轮即可。
5. 取第4步PCR产物做为模板，加入引物F及R进行PCR扩增出具有突变的全基因。建议可以优化退火温度，可以做个梯度PCR。
如果认为设计引物方面没有问题，那么再考虑其它条件。
关于重叠PCR：
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重叠PCR的应用是非常广泛的，他的原理其实很简单：比如说有两个基因或者说一个启
动子和一个基因，你要将他们连接到一起，我们首先想到的方法当然是借助 于酶切的方法，但有时我们并不一定能构找到合适的酶切位点，或者说我们找到了酶切位点，但这种酶非常特殊或者又很贵，我们可能只用一次，这样购买酶就变成 了一种浪费，难道没有别的办法了吗？当然有，那就是重组PCR技术。举个例子可能更容易说明。比如两个基因，一个命名为A，一个命名为B。A的序列为5- atgcatgctagctagaacgctacgctgactaccccctgatc-3，B的序列为5- atgctagtagctagccccccccaggggataattttttaaaacg-3。首先我们要设计引物，假设引物的序列为：
A1:5-ATGCATGCTAGCTAGAACGCT-3
A2:5-ggggggctagctactagcatgatcagggggtagtcagcgt-3
B1:5-acgctgactaccccctgatcatgctagtagctagcccccc-3
舍勒
B2:5-cgttttaaaaaattatcccct-3
我们的目的是将基因A,B通过PCR的方法连接起来，我们可以仔细的观察上面的引物A2和B1，我们会发现这两条引物要比另外两条引物长很多，为什么会这 样呢？这就是我们在设
计引物的时候在A2的3端加入了20个B基因5端的序列，在B1的5端加入了20个A基因3端的序列。我们来看重叠PCR的步骤：
（1）以A1,A2扩增A基因，B1，B2扩增B基因
（2）回收A，B基因
（3）以A，B为共同的模板，A1和B2为引物，扩增A+B，这样我们就利用重组PCR的方法将A+B拼接起来了。为什么会扩出A＋B呢？因为我们在设计引物的时候使A，B有了20个互补的碱基，他们可以经过退火结合在一起，因此可以扩增出A+B.
第三步目前很多人的做法都不同，有的人是先加入模板A，B，dNTP，Buffer，水，然后进行3－5个循环的扩增，然后在加入引物A1和B2以及 TAQ酶，这样做的好处是可以得到特异的扩增，缺点是麻烦。另外一种方法是将引物，双模板，酶，dntp等所有的反应成分均一起加入PCR管，进行反应， 好处是节省时间，不太麻烦。
目前重叠PCR的应用十分广泛，比如说在基因的定点突变，虽然说现在有很多的突变试剂盒，应用起来也很简单，但那是需要银子的；人工合成基因，其实人工合 成基因最基本的
技术（目前应用最为广泛的）就是利用重叠PCR的方法；启动子与目的基因的串连；两个不同表达盒的连接，大家都知道我们在使用DNA调取或 者说扩增基因的时候，往往需要将几个表达盒串连起来观察他们的表达效果，但由于绝大多数的DNA中都含有内含子，也就是说几个外显子并不是串连在一起的， 而要想达到我们的目的，只要应用重叠PCR技术就可以轻松完成。
overlap 能成功，要点是overlap的部分能保证有效的退火（形象地说，能牢固地“粘”在一块）。所以overlap的部分要有一定长度（一般有25bp的重叠 区应该够长），并且注意这部分的GC含量，以便使这部分（重叠的25bp）有一个合适的Tm值（例如65度），而且使用的PCR循环所用的退火温度应该低 于此温度——否则overlap的部分可能“粘”不到一起。
另外一点是要意识到overlap的前后两段核酸单链有可能形成一定的空间结构！尤其是PCR退火温度较低、降温速度较快时更增加这种情况的几率。 前后两段越长越容易形成某种空间结构。而这种空间结构可能会对overlap区的退火造成影响。 当然，overlap区本身
也有形成某种空间结构的可能（例如发夹结构），但这可以通过软件设计（如引物设计软件）来避免。
如果使用该技术还得不到全长片断，我认为首先要考虑overlap区没有成功退火。遇到这种情况建议使用TouchDown PCR试试。TouchDown PCR方法在分子克隆上有介绍。这种PCR使用一个较高的退火温度，循环几周（如三周）后降一度，然后在此温度上再循环几周，以此类推。通常最高和最低退 火温度间可相差十度。Touch Down PCR有利于解决空间结构影响overlap区退火的问题，增加扩增成功的机会。
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最近由于实验需要，做了两组pcr，连接了一个启动子，一个调控子，还有一个抗性基因，三天就搞定。
三个pcr片段分别为131bp, 650bp., 927bp
如果你扩增的片段特异性好，用PCR回收试剂盒回收，方便快捷。
如果有杂带，只能切胶回收了。下面从pcr引物设计，重叠pcr两个方面说一下。
1.重叠pcr引物设计
很简单，就是和你平常的引物设计一样。两个基因的引物都设计好了后，如：
A基因：5‘TTAAGACCCACTTTCACATT3’ 上游序列
5‘ TAGATTAGATAAAAGTAAAGTG3’ 下游序列
B基因
5‘ CATTAATTCCTAATTTTTGTTG3’ 上游序列
5‘ GATTTTTGTCGAACTATTC3’ 下游序列
把A基因的下游序列全加到B基因上游序列的5'端
把B基因的上游序列全加到A基因下游序列的5‘端
一种感觉
就万事OK了，别想着替你老板省钱，那是让你自己找罪受！
2、重叠pcr的做法
两个基因的pcr产物回收后
高中正20ul体系，各取1ul,其它的如加酶等一切照常，但先不加两端引物。
噬规者94度2min
94度30s
50度1min
72度1min 5个循环
72度10min
加两端引物：A基因的上游序列和B基因的下游序列
94度2min
94度30s
而已的意思
珠宝鉴定
58度1min
72度1min 18个循环
72度10min
工作信息延伸时间视你的基因长短来确定，一般普通taq酶1kb 1min, 高保真酶 1min ,800bp
over
还有一个很重要的问题是，你们扩基因的时候要用高保真酶，用普通TAP酶会在3‘末端加A，这样你重叠的时候会发生移码突变
关于Touchdown PCR
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PCR 优化的方法很多，TD-PCR代表了其中的一种。TD-PCR不应该仅仅被看作一种确定某一特定的PCR最优化循环条件的方法，而是应该看作一种潜在的一 步法达到优化扩增的
方法。在引物和模板特性未知的情况下，TD-PCR的应用是很有价值的。比如当引物是在氨基酸序列的基础上设计的，或对多基因家族的成 员进行扩增，或者尝试做与进化有关的PCR时，也就是说从一个物种中根据同源性用引物去扩增与另一个物种中同源的一个片断时经常出现这种情况。这种情况 下，引物和模板的错配可能是由于Tm值太低导致引物与模板在错误位点的结合所致。
热循环编程：
TD-PCR编程的目的是产生一系列 退火温度程序降低的循环。退火温度范围的跨度约15度，从此所估计的Tm值高出几度一直到Tm值以下10度左右分布。例如，对于引物- 模板间的Tm值计算为62度时，热循环的设置是从65—50之间，每一次循环比上一次的退火温度降低1度，随后在50度进行15个循环。
对于使用简并引物或者含有错配碱基的的引物进行的TD-PCR，程序运行的调整包括降低退火温度范围（例如从50度降至35度），而在最后15个循环中采 用50度或更高一些的退火温度（一旦扩增开始，引物会全部补充到新合成的复制子中，会有更高的Tm值，这时低的退火温度则不利于扩增）。
这种试验方法我也是接触不久，如果PCR时按常规方法调整后，依然得不到预想的结果，建议采用TD-PCR，希望能帮你扩增出特异的条带！
其实退火温度的设定是根据自己的情况可以调整的，比如说，60－50这段温度范围可以设5个温度值，60，58，56，54，52，50。前四个每个温度2个循环，最后一个再20－25个循环。我的温度设定一般是上五度和下五度。这是我的经验，不对之处请指正！
我今天在mj TPC-100的机子上编程，想一个温度两个循环，然后再往下依次降的，可是我的机子好像无法这样设啊。我就只能从65度到55度，每个循环低0.5度，明天P一下，不知道能否出结果。
这种方法不能再老了。
对于普通的PCR仪，可以一个循环一个循环的编程，尽管麻烦一点，但是还是可以实现的。前两天我按这种方法作了一次，也没有出现预期的结果，坚持不懈摸索条件，我想我们一点可以成功的！
偶不觉得这种方法属于新的方法，几年前偶就开始用这种方法了
请问，您用了TD-PCR之后，跑出来的条带比以前好了没。我这几天跑RT-PCR，总是出现两条杂带，尽管不断的提高退火温度，也没有什么改善。想用TD来试试，不知可否
RT-PCR 我就做过几次，效果不是很理想，其实他也不容易做，因为他比常规PCR更复杂，需要摸索的条件可能会更多。
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小猫鱼
就是退火温度逐渐降低的PCR，设PCR程序的时候，可以将退火设为每个循环-0.5度或更慢的降低。平时我们先用高温扩5~10个循环，再用低温扩增 15~25个循环，这样也是广义上的touchdown。原理就在于，温度的升高提高了PCR扩增的特异性，但也提高了引物结合的难度，降低了扩增的效 率，因此一开始先用高温扩增，保证扩增的严谨性，待目的基因的丰度上升后，降低扩增的温度，提高扩增的效率（此时非特异的位点由于丰度低，无法和特异位点 竞争）。
