overlap_pcr原理解释

更新时间:2023-06-24 10:44:33 阅读: 评论:0

   
七点半的英语overlap pcr  重组PCR
      重组PCR的应用是非常广泛的,他的原理其实很简单:比如说有两个基因或者说一个启动子和一个基因,你要将他们连接到一起,我们首先想到的方法当然是借助于酶切的方法,但有时我们并不一定能构找到合适的酶切位点,或者说我们找到了酶切位点,但这种酶非常特殊或者又很贵,我们可能只用一次,这样购买酶就变成了一种浪费,难道没有别的办法了吗?当然有,那就是重组PCR技术。举个例子可能更容易说明。比如两个基因,一个命名为A,一个命名为B。A的序列为5-atgcatgctagctagaacgct acgctgactaccccctgatc-3,B的序列为5-atgctagtagctagccccc cccaggggataattttttaaaacg-3。首先我们要设计引物,假设引物的序列为:
A1:5-ATGCATGCTAGCTAGAACGCT-3
A2:5-ggggggctagctactagcat gatcagggggtagtcagcgt-3
总成语B1:5-acgctgactaccccctgatc atgctagtagctagcccccc-3
B2:5-cgttttaaaaaattatcccct-3
我们的目的是将基因A,B通过PCR的方法连接起来,我们可以仔细的观察上面的引物A2和B1,我们会发现这两条引物要比另外两条引物长很多,为什么会这样呢?这就是我们在设计引物的时候在A2的3端加入了20个B基因5端的序列,在B1的5端加入了20个A基因3端的序列。我们来看重组PCR的步骤:
(1)以A1,A2扩增A基因,B1,B2扩增B基因
(2)回收A,B基因
(3)以A,B为共同的模板,A1和B2为引物,扩增A+B,这样我们就利用重组PCR的方法将A+B拼接起来了。为什么会扩出A+B呢?因为我们在设计引物的时候使A,B有了20个互补的碱基,他们可以经过退火结合在一起,因此可以扩增出A+B.
第三步目前很多人的做法都不同,有的人是先加入模板A,B,dNTP,Buffer,水,然后进行3-5个循环的扩增,然后加入引物A1和B2以及TAQ酶,这样做的好处是可以得到特异的扩增,缺点是麻烦。另外一种方法是将引物,双模板,酶,dntp等所有的反应成分均一
起加入PCR管,进行反应,好处是节省时间,不太麻烦。
目前重组PCR的应用十分广泛,比如说在基因的定点突变,虽然说现在有很多的突变试剂盒,应用起来也很简单,但那是需要银子的;人工合成基因,其实人工合成基因最基本的技术(目前应用最为广泛的)就是利用重组PCR的方法;启动子与目的基因的串连;两个不同表达盒的连接,大家都知道我们在使用DNA调取或者说扩增基因的时候,往往需要将几个表达盒串连起来观察他们的表达效果,但由于绝大多数的DNA中都含有内含子,也就是说几个外显子并不是串连在一起的,而要想达到我们的目的,只要应用重组PCR技术就可以轻松完成。
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孙佺以下是重叠延伸PCR的原理及两基因的引物设计:
A基因:
上游(F1)与开放阅读框起始密码子附近的序列相对应,并在5 ’末端添加酶切位点和3个保护碱基;下游(R1)与B基因终止密码子附近的序列及A基因5’末端起始密码子附近的序列互补,并去除A基因交朋友的原则的终止密码子TAA
B基因:
跨境电商现状上游(F2)与A基因终止密码子附近的序列及B基因5 ’端起始密码子附近的序列相对应,同样去除A基因终止密码子TAA;下游(R2)与B基因的开放阅读框终止密码子序列要求造句互补,并在5’末端添加酶切位点和2个保护碱基。
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标签:基因   引物   密码子   序列   重组   酶切位点
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