Strait Phamiacepticci Jonmai Vol33No52221
酸、木犀草苷含量测定〔J〕.河南科学P619P7(1)：53E9.〔14〕刘惠，杨姣，朱志飞，等•基于总量统计矩分析法的金银花、山银花HPLC指纹图谱评价〔J〕.中国实验方剂学杂志,2612,25
(01)：130R39.
〔15〕刘善新，苏酩•山东道地产区金银花的快速高分离度液相色谱指纹图谱研究〔〕•中华中医药杂志(原中国医药学报),2415, 36(7)：2557E566.
〔16〕朱姮，于金倩，刘倩，等•基于RRLC-QAD-PSNQ-POF-MS技术的山东金银花多指标定量指纹图谱分析〔〕4中国实验方剂学杂
志P617P3(19)：80E9.
〔17〕朱凤洁，杨健，袁媛，等•金银花种质资源化学指纹图谱及代谢扌
物相似性分析〔〕•中国中药杂志P618P3(1O)：2575E579•〔18〕韩永成，刘伟，陈宁，等•不同产地金银花药材的UPLC指纹图谱分析〔〕•中国实验方剂学杂志P614P6(O)：67E9.
〔19〕王春鹏，朱子微，李晋，等•金银花抗氧化活性整合指纹图谱的
建立及其在质量评价中应用〔〕•天津中医药大学学报P614P3
(5)：291E95.
基于UPLC-MS/MS的特征多肽识别技术鉴别中成药中的阿胶
鲁辉，吴杨，闵春艳，陈卫*(苏州市药品检验检测研究中心，江苏苏州219109)
母乳奶粉混合喂养摘要：目的建立基于超高效液相色谱-三重四级杆质谱(UPLC-MS/MS)的特征多肽识别技术检测中成药中阿胶成分的专属鉴别方法。方法将中成药供试品进行提取及胰蛋白酶酶解，以阿胶特有的特征多肽离子对iz539.8(双电荷)—410.4和iz539.8(双电荷)—923.8作为鉴别离子对，采用UPLC-MS/MS液质联用仪、BEH C7柱(56mmx2.1mm,1.7m〕)，以乙腈(A)E.1%甲酸(B)为流动相进行梯度洗脱，总运行时间为15min。同时对方法学进行考察，主要包括专属性、检出限、重复性等。结果阴性样品及其他常见胶类药材(龟甲胶、鹿角胶、黄明胶等)对阿胶的测定不产生干扰，方法检出限为含6.5%阿胶的供试品，10批市售的口服液类和颗粒类中成药中均检出阿胶的特征多肽离子对。结论方法专属性强、普适性好、灵敏度高、分析时间短，可用于口服液和颗粒类中成药中阿胶的鉴别。
关键词：特征多肽；中成药；阿胶；鉴别
中图分类号:R284文献标识码:A文章编号:1006-3765(2401)-95-9633-94
Qualitative Analysin of Don key-hide Gelatin in Chin e Traditi v nal Pativnt Medicines by UPLC-MS/MS Bad on Collagen MarSet Peptides Recog-nitivn Tech no l ogy
LU Hui,WU Yang,MU Chun-yan,CHEN WeC(Suzhou Instituta for Drag Contral,Suzhou219109,China)
ABSTRACT：OBJECTIVE Ac ultru-2eXomla7ce liquid ccmmdRumpPy9X111to tripia qudUmpIa mass spec-trometu(UPLC-MS/MS)methoP bah on marUar001716x1:100recopnition16097010X1was dyCopxS for qualitativv analysis of don7ey-2ina aelatin in Chine trakitional patient mehicices.METHODS A BEH C4column(56mm X2.1mm,1.2m〕)was uh and eluteh with gce/nit/i ant0.1%formic acid solution in arapiext moPa.The samples weu extracted ant anzymolysis treatment ud tupsic.The cCaracteristic momcclar peaks of donCey-bida platin m/z532.5(donUla-cCarua)—610.7ant m/z532.5(doiiUla-cCuua)—923.5were detecteh by UPLC-MS/MS with multiple reaction monimUng(MRM).The total elution time were17minctes.Meanwhile,the mChoPomay were stuU-Od.RESULTS The methoP yUiduRn data sPoweh that the donkey-bida yelatin was cot inteUereh with the cepativv yPmics ant other gelatins ssch as Rr/i sPell yelatin,dar-bom yelatin ant bovice-hida yPmic.The detection limit of the methoP were both0.2%donCyEida gelatin in t/v m at/c medicines.CONCLUSION The estakPs
Ped methoP was specific,preci ant reproPucibm.It can ba ud for the qualitativv analysis of donCey-bida gelatin in Chine trakitional patient medicines.
KEY WORDS：Coimg e x marUer peptides；Chi/e trakiboxal patiext mehici/es；Doxtey-hide gemUn；QuaUtative anapsis
作者简介：鲁辉，男(1980-)。毕业于苏州大学。学历：硕士。职称：副主任药师。主要从事药品检测与质量控制研究。
通讯作者：陈卫，男。学历：硕士。职称：副主任药师。主要从事保健食品、药品质量控制与评价研究。
基金项目：苏州市科技发展计划项目(民生科技-医疗卫生应用基础研究，编号：SYS2618160)
35
海峡药学2021年第33卷第5期
明正德皇帝阿胶为马科动物驴Equus asinus L.的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶，具有补血滋阴，润燥，止血等多种功效，主要用于血虚萎黄，眩晕心悸，肌痿无力，心烦不眠，虚风内动，肺燥咳嗽，
劳嗽咯血，吐血尿血，便血崩漏，妊娠胎漏〔〕。以阿胶为君药的中成药用于滋阴补血，调理身体，因其疗效良好，服用方便，深受医生和患者的钟爱，例如阿胶补血口服液、复方阿胶浆、阿胶养血颗粒等。近年来中成药的生产造成对阿胶药材需求的迅猛增加，其原料驴皮也愈加紧俏，价格连连攀升。监管发现在生产阿胶类中成药时出现少投料、不投料，以牛、猪等的皮熬制的胶类冒充阿胶，甚至以动物骨、旧皮革、鞍、靴、橡胶等制成的伪品胶进行投料〔•5，极大的损害了消费者的利益并危及人民群众的用药安全。
针对阿胶药材，鉴别手段从最初的理化性质研究，如蛋白质等电点及分子量分布的比较⑷，到成分如蛋白质〔〕、氨基酸5〕及微量元素等的含量测定5〕，再不断的深入到分子生物学方法鉴定领域⑻，这些都为阿胶的质量控制提供了依据。然而目前阿胶市场上的掺杂、掺假手段日益高明，相关检测也愈加困难。《中国药典＞2215年版对阿胶药材的鉴别采用液质联用技术，以质荷比（1。）539.8（双电荷）—612.4和（1 0）537.3（双电荷）—923.3作为阿胶药材的特征肽段离子对。该方法专属性强，灵敏度高，有效地控制了阿胶原药材的质量。
综上所述用英语怎么说然而针对以阿胶为君药的中成药,《中国药典》2015年版中大多没有针对阿胶成分进行专门的质量控制，亦或采用的鉴别手段专属性不强，不能有效检测阿胶成分。陈佳等⑼采用超高效液相色谱0三重四极杆质谱法建立了复方阿胶浆中阿胶的检测方法；龙国友等〔9〕采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱法建立了阿胶补血颗粒中阿胶的检测方法。上述方法可以对复方阿胶浆和阿胶补血颗粒中的阿胶
进行专属、有效的检测，然而方法运行时间较长（单次运行需要40mm、。同时阿胶类中成药剂型繁多且不同生产厂家原辅料、生产工艺不尽相同，这就导致了样品的基质复杂且干扰因素多。目前一直缺乏专属性好、灵敏度高、普适性强的方法来对不同种类中成药中阿胶成分进行检测。本研究尝试选用常见的中成药阿胶补血口服液和阿胶养血颗粒作为考察基质，基于特征多肽识别结合UPLC-MS/MS技术建立专属性强、普适性好、分析速度快的口服液及颗粒类中成药中阿胶的鉴别方法，进而补充和完善现有质量标准，为更好地控制阿胶类中成药的质量提供技术支撑。
1仪器与材料
1.1仪器Waters Acguitp型超高效液相色谱仪Revo TQO 三重四级杆质谱仪（美国Waters公司、；XS205DU型电子天平（Mettler Tole/c仪器有限公司、。
1.2材料乙腈（HPLC-MS级，赛默飞世尔科技有限公司），超纯水，碳酸氢铵（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），胰蛋白酶（Sigma公司，批号:SLBG6450V；中国食品药品检定研究院，批号：615000206）；阿胶（批号16107402303）5黄明胶（批号321695001301）、龟甲胶（批号321693001702）和鹿角胶（批号321694001702）对照药材均购自中国食品药品检定研究院；两种基质的分析用样品（阿胶补血口服液、阿胶养血颗粒）均由药店自购，两种基质的阴性样品由生产厂家提供。2实验部分材料作文题目
2.1液相色谱条件色谱柱为Acguitp UPLC BEH C*柱（6.3X54mm,（.9pm）；流动相为乙腈（A）O.3%甲酸溶液（B），梯度洗脱：2~3min,5%~11%A;14~13min,11%~ 80%A；13~13mid,80%A；13~1
3.03min,80%~5%A；
13.03~15min,5%A；流速为0.3mL•min-；柱温为34t；进样体积为5.0pL。
2.2质谱条件采用电喷雾正离子模式，多反应监测（MRM），选择阿胶特征多肽1。537.3（双电荷）—612.4和1。539.8（双电荷）—92
3.3作为检测离子对，喷雾电压3.5 kV，锥孔电压34V，脱溶剂温度354t，脱溶剂气体流量1400 L•miu_3。
2.3溶液的制备
6. 3.3对照药材溶液的制备：称取阿胶对照药材粉末0.3g，置50mL量瓶中，加1%碳酸氢铵溶液44mL，超声34min，放冷，加1%碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀,3200r•min-离心3min，取上清液340pL，置3.5mL具塞离心管中，加胰蛋白酶溶液（取胰蛋白酶，加1%碳酸氢铵溶液溶解，制成每-mL中含3mg的溶液，临用新配）30pL，摇匀,37t恒温酶解3h，即得。同法制备阴性样品溶液及其他胶
类对照药材溶液。
2.3.2供试品溶液的制备：取阿胶补血口服液2.0mL，阿胶养血颗粒2.0g，分别置54mL量瓶中，加1%碳酸氢铵溶液40mL，超声34min，放冷，加1%碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，3200I•mpT离心3min，取上清液340pL，置3.5 mL具塞离心管中，加胰蛋白酶溶液（取胰蛋白酶，加1%碳酸氢铵溶液溶解，制成每-mL中含3mg的溶液，临用新配）34 pL，摇匀,37t恒温酶解16h，即得。
3结果与讨论
3.1专属性分别取阿胶补血口服液阴性样品、阿胶养血颗粒阴性样品、龟甲胶对照药材、鹿角胶对照药材、黄明胶对照药材、阿胶对照药材、阿胶补血口服液、阿胶养血颗粒适量，按上述供试品溶液制备方法处理并同法制备试剂空白，以阿胶的特征肽段1。537.3（双电荷）—410.4和1。539.8（双电荷、—923.8作为检测离子对进行测定，结果阴性空白、龟甲胶、鹿角胶及黄明胶对照药材的提取离子流色谱图中，在与阿胶对照药材相应的位置上均无相应的色谱峰，而阿胶补血口服液及阿胶养血颗粒供试品中均检出与阿胶对照药材一致的色谱峰。由此判断阴性空白、其他常见胶类样品对阿胶成分的测定不构成干扰，表明方法的专属性较好（见图1A~H）。
3.2重复性按上述“2.3.2”项下方法分别制备阿胶补血口服液及阿胶养血颗粒供试品溶液各9份，以阿胶的特征肽段1。539.8（双电荷、—610.4和1。539.8（双电荷、—973.3作为检测离子对，进样测定。
结果阿胶补血口服液和阿胶养血颗粒样品中均检出阿胶特征肽MRM色谱峰。阿胶补血口服液MRM色谱峰面积的RSD（n=6）分别为2.7%和6.9%，结果见图2；阿胶养血颗粒MRM色谱峰面积的RSD（n
-36
Strait Phaunyceptical Jonmal Vol35No52221 =6）分别为3.5%和3.7%，结果（见图3）。
G H
书法评语图1不同胶类药材及中成药中阿胶特征肽段的提取离子流色谱图A.阿胶补血口服液阴性样品;B.阿胶养血颗粒阴性样品;C.龟甲胶对照药材;D鹿角胶对照药材;E.黄明胶对照药材;F.阿胶对照药材；G.阿胶补血口服液；H.阿胶养血颗粒;u iz539.8（双电荷）—410.4；b.iz539.8（双电荷）—923.8
图0阿胶补血口服液重复性试验阿胶特征肽段的
提取离子流色谱图
A.iz539.8（双电荷）—610.0；早日康复祝福语
B.iz532.8（双电荷）—923.8
图3阿胶养血颗粒重复性试验阿胶特征肽段的
提取离子流色谱图
A.iz532.8（双电荷）—410.4；
B.iz532.8（双电荷）—903.8
3.3供试品取样量优化分别量取阿胶补血口服液05 mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL和
4.0mL，分别称取阿胶养血颗粒02y、05g、1.0y、2.0y和4.0y，按上述“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，提取阿胶的特征肽段m/z 532.3（双电荷）—610.0和iz532.3（双电荷）—943.3检测离子对，结果发现阿胶补血口服液取样20mL、阿胶养血颗粒取样4.0/时，供试品溶液中两个通道的MRM色谱峰面积与07/阿胶对照药材所对应的峰面积相近，因此供试品取样量确定为口服液2.0mL、颗粒2.0/。
34方法检出限取阿胶对照药材适量，另取阿胶补血口服液阴性样品2mL、阿胶养血颗粒阴性样品2/，照“23.2”项下方法分别制得含4.7%2.5%2%阿胶的阿胶补血口服液和阿胶养血颗粒系列溶液，以阿胶的特征肽段iz532.8（双电荷）—612.0和iz539.3（双电荷）—923.5离子对进行检测，结果发现含05%阿胶的阿胶补血口服液阴性供试品溶液中MRM色谱峰的信噪比分别为3.5和3.6，含05%阿胶的阿胶养
血颗粒阴性供试品溶液中MRM色谱峰的信噪比分别为3.5和3.6，即方法的检出限为含4.5%阿胶的供试品。3.5供试品前处理的考察分别就实验中可能对结果产生影响的因素进行了考察，主要包括胰蛋白酶类型和酶解时间。
3. 5.7胰蛋白酶选择：照
4.3.6项方法制备供试品溶液，分别采用S/mc公司和中国食品药品检定研究院提供的胰蛋白酶对供试品进行酶解，考察酶解的效果。结果发现两种胰蛋白酶酶解后的供试品溶液中阿胶特征肽iz532.3（双电荷）—214.0和iz532.3（双电荷）—943.3检测离子对的提取离子流色谱峰面积基本一致，未见明显差异，因此，两种胰蛋白酶均可使用。考虑到经济性和易获得性，推荐使用中检院提供的胰蛋白酶。
3.5.6酶解时间：将供试品溶液置于温度37t的恒温干燥
-57
•
海峡药学2021年第33卷第5期
箱内，分别恒温酶解8、12、15、18和22h，进样测定，结果供试
品中1。537.3(双电荷)—610.4和1。539.8(双电荷、—
973j3离子对提取的离子流色谱峰面积在16h以后未见明显
变化，实验选择16h作为酶解时间。
3.6供试品测定以本研究建立的方法对市售的3批口服
液及颗粒类中成药进行检测，结果供试品中均检出阿胶的特
征肽MRM色谱峰(见表3)。
表1中成药中阿胶成分检测结果
样品名称批号是否检出阿胶特征
肽MRM色谱峰
生产厂家
阿胶补血口服液191113检出A
带着宝宝去旅行190931检出
262101检出B
196995检出C
192201检出D 阿胶养血颗粒26161105检出E
复方阿胶浆1608252检出F
1827621检出
阿胶补血颗粒1911617检出
驴胶补血颗粒271912767检出G
4结论
本研究基于特征多肽识别结合UPLC-MS/MS技术建立了专属性强、普适性好、分析速度快(单次运行15mm)的中成药中阿胶的鉴别方法。对市售的3批不同厂家及同一厂家不同批次的口服液及颗粒类中成药进行了检测，结果均检出阿胶的特征肽MRM色谱峰，表明方法可以用于口服液及颗粒类中成药中阿胶的鉴别。
参考文献
〔3国家药典委员会编・中国药典(2015年版一部)〔S〕北京：中国医药科技出版社,263,39.
〔2〕程显隆，李文杰，张小龙，等.UPLC-QT0F-MS结合主成分分析法用于龟甲胶、鹿角胶中添加牛皮源成分的检测研究〔〕・药物分析杂志,2612,32(6)：931O35.
〔〕张贵锋，刘涛，王前，等・中药阿胶的质量控制方法研究药物生物技术,2629,3(5)：256054.
〔4〕李锋，张振秋，任子和，等.七种动物胶类药材的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴别中药材,399,22(4)284.
索姆河战役〔〕汪冰，肖新月，程显隆，等.凝胶排阻色谱法研究阿胶中蛋白质及多肽相对分子质量分布规律〔J〕・药物分析杂志,2029,29(11)：3860891
〔6〕那丽丹，陈建丽，秦雪梅，等.基于1H-QMR代谢组学的阿胶化学成分差异性分析方法初探中草药,2615,46(17)：2573O579.〔7〕贾艾玲，王红梅，李玲玲•电感耦合等离子体质谱法检测阿胶中6种有害元素的含〔〕药物分析杂志,2014,32(5)：434O36.
〔〕吴亚君，王斌，刘鸣畅，等.阿胶中马和驴成分的实时荧光PCR检测〔〕.食品科学,263,35(8):8508.
〔9〕陈佳，程显隆，魏锋，等.超高效液相色谱-三重四极杆质谱法检测复方阿胶浆中阿胶〔〕.药物分析杂志,2615,35(2):328032.〔6〕龙国友，李明华，刘薇，等.超高效液相色谱-三重四极杆质谱法检测阿胶补血颗粒中的阿胶〔〕.药物分析杂志,263,36(5): 826029.
基于HPLC指纹图谱探讨当归-白芍不同比例配伍的差异性
王伟影，王发英，毛菊华，陈梦(丽水市质量检验检测研究院，浙江丽水323200)
摘要：目的建立当归-白芍药对不同比例的HPLC指纹图谱，探讨当归-白芍不同比例配伍在化学成分和溶出率上的差异性。方法采用HPLC法，采用Agib/t乙°0;SB-C)色谱柱(4.9mm X256mm,5p m)，柱温37t；乙腈C61%磷酸溶液为流动相，梯度洗脱，流速19mL-min-3；检测波长220am进行试验，对当归-白芍11个不同比例配伍的HPLC图谱采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行分析，并对各药对
典型的共有色谱峰面积与单提液相应的色谱峰面积的比值进行比较分析。结果确定3个共有峰，对共有峰进行归属，并进行相似度评价；配伍后白芍的溶出率均有不同程度的提高，以当归-白芍(5：2)时溶出率最佳；而当归的溶出率均有不同程度的降低，当归-白芍(1：1)时最接近单味当归，溶出率最佳。结论所建立的指纹图谱相关性强，能为当归-白芍药对的质量控制、成分归属和配伍理论提供科学依据。
关键词：当归-白芍药对;HPLC；指纹图谱；成分归属
中图分类号：R234文献标识码：A文章编号：16060765(2021)05063304
Study on the Differenee of Different Compatibility Proportion of Angelicae sinensis Radio-Radic paeoniae Alba Bad on HPLC Fingerprint
WANG Wei-ying,WANG Fa-ying,MAO Ju-hua,CHEN Meng(Lishui Institute fot Quality Inspection and
作者简介：王伟影，女。职称：副主任中药师。药物质量控制、检验检测技术及标准化研究。
基金项目：浙江省公共科技条件平台项目(2612E6038)、衢州市专家工作站(衢委人才〔2618〕4号文件)
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