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个人征婚固定化酶是２０世纪６０年代发展起来的一项新技术，固定化酶具有诸多优点，能广泛应用于各个领域，因而受到科研工作者的重视。酶的固定化成功与否主要依靠载体的特性。甲壳素和壳聚糖是天然的聚氨基葡萄糖，呈现出疏松的网状结构。甲壳素是迄今为止发现的天然碱性多糖之一［１］，它在大多数溶剂中不能溶解；壳聚糖是将甲壳素脱乙酰化到一
老师给考生送红包定程度得到的衍生物，其氨基的出现使它能在ｐＨ６．５以下的酸性溶液中溶解［２］。
近年来以甲壳素或壳聚糖作为固定化酶载体的研究比较多［３－４］，但是关于如何制备表面疏松多孔的壳聚糖微球却鲜见报道，尤其是利用电子显微镜观察其结构来确定多孔形成条件的报道国内少见。本试验以壳聚糖微球形态、表面及内部结构为参考指
收稿日期：２００６－１０－２０
＊通讯作者
基金项目：湖北省自然科学基金项目（２００５ＡＢＡ０９０）。作者简介：张弦（１９８２－），女，硕士研究生。
多孔壳聚糖微球的制备
张
弦１，李春美１＊，钟方旭２
（１．华中农业大学食品科技学院，武汉４３００７０；２．武汉工业学院生物与制药工程系，武汉４３００２３）
摘要：以不同黏均分子量的壳聚糖为材料，用扫描电子显微镜观察壳聚糖微球表面、内部结构及形态，并以其为主要参考指标，研究了壳聚糖黏均分子量、ＮａＯＨ浓度、乙酸乙酯比例、壳聚糖浓度、凝结时间等对壳聚糖形成多孔微球的影响，优化了制备多孔壳聚糖微球的工艺参数。结果表明：采用２．５％黏均分子量４４８．４ｋＤａ的壳聚糖为载体、３．０％的ＮａＯＨ为凝结液、乙酸乙酯与ＮａＯＨ溶液比例为１∶２０、在凝结液中处理３ｈ时，能制备得到较好的多孔壳聚糖微球。关键词：壳聚糖；多孔微球；黏均分子量中图分类号：ＴＳ２０１
文献标识码：Ａ表格求和公式
文章编号：１００５－９９８９（２００７）０５－００５０－０３
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｐｏｒｏｕｓｃｈｉｔｏｓａｎｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ
ＺＨＡＮＧＸｉａｎ１，ＬＩＣｈｕｎ－ｍｅｉ１＊，ＺＨＯＮＧＦａｎｇ－ｘｕ２
（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＨｕａｚｈｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ４３００７０；２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，
ＷｕｈａｎＰｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ４３００２３）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｆａｃｔｏｒｓａｆｆｅｃｔｉｎｇｔｈｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｃｈｉｔｏｓａｎｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，ｓｕｃｈａｓｖｉｓｃｏｓｉｔｙ－ａｖｅｒａｇｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔａｎｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｃｈｉｔｏｓａｎ，ｒａｔｉｏｏｆｅｔｈｙｌａｃｅｔａｔｅａｎｄＮａＯＨ，ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｉｎｇｔｉｍｅ，ｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄａｎｄｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｐｒｅｐａｒｉｎｇｐｏｒｏｕｓｃｈｉｔｏｓａｎｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓｗａｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄｕｓｉｎｇｔｈｅｓｕｒｆａｃｅ，ｉ
ｎｎｅｒｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎｓａｎｄｓｈａｐｅｏｆｃｈｉｔｏｓａｎｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅａｓｉｎｄｅｘ．
Ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｏｎｄｉ－
ｔｉｏｎｓｆｏｒｐｒｅｐａｒｉｎｇｐｏｒｏｕｓｃｈｉｔｏｓａｎｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ：ｔｈｅｃａｒｒｉｅｒｗａｓｃｈｉｔｏｓａｎｗｉｔｈｖｉｓｃｏｓｉｔｙ－ａｖｅｒ－ａｇｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｏｆ４４８．４ｋＤａａｎｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ２．５％，３．０％ＮａＯＨａｓｃｌｏｔｔｅｄｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｒａｔｉｏｏｆｅｔｈｙｌ
ａｃｅｔａｔｅａｎｄＮａＯＨｓｏｌｕｔｉｏｎｗａｓ５％，ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｉｎｇｆｏｒ３ｈ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｃｈｉｔｏｓａｎ；ｐｏｒｏｕｓｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ；ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ－ａｖｅｒａｇｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ
工艺技术
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DOI:10.13684/jki.spkj.2007.05.016
潘涂
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标，探讨了影响壳聚糖成球的因素，确定了制备疏松多孔、球形较好的壳聚糖微球的最佳条件，以便为制备性能良好的可作为固定化酶的载体壳聚糖微球提供理论依据。１材料与方法１．１
试验材料和仪器
３种壳聚糖：黏均分子量分别为９６１．２ｋＤａ、７８７．０ｋＤａ、４４８．４ｋＤａ，相对应的脱乙酰度分别为８６．６％、８９．５％和８７．９％，分别记为Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３，购自海南海得贝海洋生物工程有限公司；试验所用其他试剂均为分析纯；乌氏黏度计（Φ０．５～０．６ｍｍ）：上海晶菱玻璃有限公司；真空冷冻干燥机（ＦＤ－１Ｂ）：上海厦美生化科技发展有限公司；扫描电子显微镜（ＳＥＭ）：ＨｉｔａｃｈｉＳ－３０００Ｎ。１．２
试验方法
１．２．１壳聚糖黏均分子量及脱乙酰度的测定壳聚糖黏均分子量（ＭＶ）测定：采用乌氏黏度计法［５－６］；壳聚糖脱乙酰度（ＤＤ）测定：采用改进的酸碱滴定法［７］。１．２．２壳聚糖微球的制备１．２．２．１壳聚糖的选择
分别称取０．２５ｇ不同黏均分子
量的壳聚糖Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３于３个烧杯中，用１０ｍＬ１％的乙酸溶液溶解，配制成２．５％的壳聚糖胶体溶液，室温放置过夜使其充分溶解。取３０ｍＬ３．０％的ＮａＯＨ溶液，加入１．５ｍＬ的乙酸乙酯配制成凝结液，然后用注射器吸取５ｍＬ壳聚糖胶体溶液，逐滴加入到上述凝结液中，均匀用力以控制滴加速度，然后将其于室温下放置３ｈ，再用去离子水反复洗涤壳聚糖微球直至中性，一部分于４℃下冷藏备用，另一部分经冷冻干燥
后备用［８］。
１．２．２．２壳聚糖微球制备的单因素试验在上述试验的基础上，以Ｃ３为材料，保持其它因素不变的情况下，依次改变ＮａＯＨ浓度为２．０％、２．５％、３．０％，乙酸乙酯用量为１．５ｍＬ、２．５ｍＬ，壳聚糖浓度为２．０％、２．５％、３．０％，凝结时间为３ｈ、５ｈ、７ｈ进行单因素试验。１．２．３壳聚糖微球整体形态及结构观察
用ＳＥＭ观察
壳聚糖微球表面、内部结构及微球形态。湿壳聚糖经ＳＥＭ观察前要进行如下处理：先用０．１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ（ｐＨ７．２）清洗３次，每次２０ｍｉｎ；后用１％四氧化锇室温下固定２．５ｈ；固定后用０．１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ（ｐＨ７．２）清洗３次，每次３０ｍｉｎ；然后将材料分别经３０％、５０％、７０％、９０％、１００％（３次）乙醇逐级脱水，每次３０ｍｉｎ；再用乙酸异戊酯代换，乙酸异戊酯／乙醇１：１代换１次，１００％乙酸异戊酯代换１次，各３０ｍｉｎ；最后将样品放入ＣＯ２临界点干燥仪（ＨＣＰ－２型）中干燥；干燥后的微球经离子溅射仪（ＥｉｋｏＩＢ－５）镀金膜后ＳＥＭ观察拍照；经真空冷冻干燥的壳聚糖微球则直接经离子溅射仪镀金膜后ＳＥＭ观察，加速电压为２０ｋＶ。２结果与讨论
２．１
壳聚糖黏均分子量对壳聚糖成球的影响
观察Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３所成微球的ＳＥＭ照片（图１）发现：黏均分子量较小的Ｃ３所成的微球表面的疏松多孔结构较明显，而黏均分子量较大的Ｃ１和Ｃ２所成的微球表面致密，孔不仅少而且小。这主要是因为随着分子量的增加，壳聚糖分子变长，微球中壳聚糖分子之间相互结合更加紧密，导致其表面结构致密，多孔性降低，不利于酶进入壳聚糖微球进行固定化。
福字草书注：Ａ为９８１．２ＫＤａ，Ｂ为７８７．０ＫＤａ，Ｃ为４４８．４ＫＤａ。
图１不同黏均分子量的壳聚糖所成微球表面结构的ＳＥＭ照片（×４０００）
壳聚糖微球的表面结构及强度是影响其作为固定化酶载体的主要因素，黏均分子量较小的Ｃ３所成的微球虽然强度不好，但其表面疏松多孔，而且可以通过增大其浓度或用戊二醛交联等方法来增加其强度。所以以Ｃ３作为制备多孔壳聚糖微球的材料。２．２成球条件对壳聚糖成球的影响
２．２．１
ＮａＯＨ浓度对壳聚糖成球的影响图２表明，
ＮａＯＨ浓度对壳聚糖微球的整体形态和表面形态具有较大影响，２．０％（ｗ／ｖ）的ＮａＯＨ溶液所成微球表面形态
不规则（图２Ａ），球之间容易相互黏结，３．０％的ＮａＯＨ溶液中所成微球整体形态规则（图２Ｂ），强度较好；图２Ｃ、图２Ｄ也显示二者表面结构的明显差异，前者表面疏松多孔结构不明显，而后者表面出现明显的多孔结构。
这主要是因为壳聚糖在酸性条件下溶解、碱性条件下沉淀，在较低浓度的ＮａＯＨ溶液中，壳聚糖微
球在还未完全沉淀成球以前就已经塌陷，壳聚糖分子堆砌在一起，导致所成微球形态不好、强度较差，
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减字谱
图４
２．５％的Ｃ３于加入了１．５ｍＬ乙酸乙酯的３０ｍＬ３．０％ＮａＯＨ
溶液中处理３ｈ所成壳聚糖微球内部结构的ＳＥＭ照片（×４０００）
注：Ａ（×４０００）为２．０％的壳聚糖，Ｂ（×４０００）为２．５％的壳聚糖。
图３不同壳聚糖浓度下所成微球的表面结构形态的ＳＥＭ照片
表面厚度不均一，凸凹不平，不能形成良好的疏松多孔结构；当ＮａＯＨ浓度增加时，壳聚糖微球迅速成形，容易形成厚度均一、形态较好、强度高的微球，此时微球表面被撑起，呈现出壳聚糖自身的疏松多孔结构，因此采用３．０％的ＮａＯＨ浓度较合适。
２．２．２乙酸乙酯用量对壳聚糖成球的影响有文献报道在壳聚糖微球制备中，乙酸乙酯能增加所成微球的多孔性［１］，因此本试验考察了乙酸乙酯的致孔作用对壳聚糖成球的影响。试验结果表明：在３０ｍＬＮａＯＨ溶液中加入１．５ｍＬ乙酸乙酯时，所成壳聚糖微球形态较好。这可能是因为乙酯乙酯是非极性分子，具有较小的表面张力，当将其加入ＮａＯＨ溶液中时，可以降低其表面张力，使得壳聚糖胶体液滴易于成球的缘故。但是在本试验条件下制备的壳聚糖微球表面的疏松多孔结构并无很大差异，这主要是因为乙酸乙酯密度比水小且具有疏水性，不与ＮａＯＨ溶液混溶而浮在溶液表
面，当将壳聚糖液滴滴加到凝结液中时，壳聚糖微球在碱性条件下不断沉淀而沉入烧杯底部，致使乙酸乙酯不易与之发生作用，而不能插入微球表面增加其多孔性，因此在壳聚糖微球制备中，要发挥乙酸乙酯的致孔作用，则必须在制备过程中不断搅拌，让它在壳聚糖微球完全沉淀以前充分作用于壳聚糖微球。２．２．３
壳聚糖浓度对壳聚糖成球的影响
试验发现：
壳聚糖浓度为２．０％时，虽然微球表面疏松多孔，但是所成微球形态不好，有轻微拖尾；当壳聚糖浓度增大到３．０％时，球的强度逐渐增大，但拖尾较严重，球表面比较致密，而且孔也不大，不利于酶的固定化。这是因为随着壳聚糖浓度的增加，壳聚糖分子堆积更加紧密，壳聚糖厚度增加，从而导致壳聚糖微球表面孔隙减少。壳聚糖微球表面疏松多孔性与其表面强度是负相关的，综合考虑其多孔性及强度，采用２．５％的壳聚糖浓度较合适。图３是２．０％及２．５％Ｃ３
所成壳聚糖微球的表面结构的ＳＥＭ照片。
２．２．４凝结液中处理时间对壳聚糖成球的影响试验结果表明：将壳聚糖微球在３．０％的ＮａＯＨ溶液中分别放置３ｈ、５ｈ、７ｈ所成壳聚糖微球的表面结构、形态均无明显差异，因此将壳聚糖
滴加到凝结液中处理３ｈ是较合适的。这是因为超过３ｈ以后，壳聚糖胶体微滴已经在凝结液中凝结并稳定成形，壳聚糖微球变的不透明，再延长其在凝结液中的处理时间对成球效果意义不大。
２．２．５成球条件对壳聚糖微球内部结构的影响
试验发现：以上因素对壳聚糖内部结构影响不大，均如图４所示，图４是在本试验最佳条件下所成壳聚糖微球的表面结构的ＳＥＭ照片，最佳条件为２．５％的Ｃ３、乙酸乙酯加入比例为１∶２０、３．０％ＮａＯＨ、凝结时间为３ｈ。这可能是外部环境因素很难作用于壳聚糖微球内部，使得壳聚糖微球内部保持了壳聚糖本身所具有的疏松多孔结构的缘故。由此可见本试验中所制备壳聚糖微球内部结构疏松多孔，较适合作为固定化酶的载体。３
结论
通过本研究发现：ＮａＯＨ浓度、乙酸乙酯用量、壳聚糖黏均分子量等对壳聚糖成球影响较大，凝结液中的处理时间等对壳聚糖成球的影响较小。
本研究在制备壳聚糖微球的过程中，考虑了以上各种因素对壳聚糖成球的影响，用ＳＥＭ观察壳聚糖微球的表面及内部结构、整体形态，并以其作为参考指标，确定了制备具有较好表面、内部结构及较好球形的壳聚糖微球的方案。
经过试验得出以下结论：当采用分子量较小（本试验中为４４８．４ｋＤａ）的壳聚糖、２．５％的壳聚糖浓度、以１∶２０的比例加入乙酸乙酯的３．０％的ＮａＯＨ溶液为凝
图２
２．０％和３．０％的ＮａＯＨ溶液中所成壳聚糖微球的整体形
态（Ａ×５０、Ｂ×５０）及表面结构（Ｃ×４０００、Ｄ×４０００）的ＳＥＭ照片
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结液、在凝结液中处理３ｈ时，能制得具有疏松多孔表面结构和较好形态的壳聚糖微球。
本试验最佳条件下制备得到的壳聚糖微球，比表面积相对壳聚糖膜增加，表面及内部疏松多孔，使得其吸附酶的能力大大增强，而且微球强度较好，有利于后期固定化操作及重复使用，为制备壳聚糖微球作为固定化酶的载体提供了理论依据。目前关于影响壳聚糖微球多孔性的研究较少，关于采用不同分子量的壳聚糖混合物及其他制备疏松多孔壳聚糖微球方法均还有待尝试。
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收稿日期：２００６－１１－１８
＊通讯作者
基金项目：国家自然科学基金项目（２０３６６００２－２）；广西区教育厅资助项目（２００３－２２）；广西大学科研基金项目（Ｘ０５１００９）。作者简介：蒋林斌（１９６５－），男，广西桂林人，博士研究生，副教授，研究方向为天然产物的提取天然高分子功能材料的应用。
赵雅芝几岁γ辐射制备壳聚糖衍生物及其性能研究
蒋林斌１，３，郑德森１，魏远安１，３，姚评佳２，３＊，刘大胜１，３，何熙璞１
（１．广西大学化学化工学院，南宁５３０００４；２．广西大学生命科学院，南宁５３０００５；３．广西亚热带生物资源保护利用重点实验室，南宁５３０００５）
摘要：壳聚糖（Ｃｓ）与甲基丙烯酸（ＭＡＡ）在γ６０
Ｃｏ辐射源辐射下进行接枝共聚反应，制备了不同接枝率的
共聚物，并用红外光谱（ＩＲ）和Ｘ射线衍射仪（ＸＲＤ）进行了结构表征。以透明质酸（ＨＡ）、羧甲基壳聚糖
（ＣＭ－Ｃｓ）为参照物，在一定相对湿度下考察了Ｃｓ、接枝共聚物（Ｃｓ－ｇ－ＭＡＡ）的保湿吸湿性能。实验结果表明：接枝共聚物钠盐（Ｃｓ－ｇ－ＭＡＡ１）的吸湿保湿性能最优，且接枝率越高吸湿保湿性能越好，完全可以替代透明质酸，作为食品的保湿剂。
关键词：壳聚糖；接枝共聚物；辐照；吸湿性；保湿性中图分类号：ＴＱ０２８．８
文献标识码：Ａ
文章编号：１００５－９９８９（２００７）０５－００５３－０４
Ｓｔｕｄｙｏｎｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｃｈｉｔｏｓａｎｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ
ｕｎｄｅｒγ
－ｒａｙｒａｄｉａｔｉｏｎａｎｄｉｔｓｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
工艺技术
信号枪５３
