基于纳米技术的血红蛋白生物传感器快速测定
油炸食品的丙烯酰胺
费永乐，王丽然，李书国
（河北科技大学食品科学与工程系，河北省石家庄 050018）
摘要：丙烯酰胺是一种神经毒素，具有潜在致癌性。丙烯酰胺分子可以和血红蛋白结构中N-末端缬氨酸的α-NH2形成共价化合物引起电极钝化，其含量不同，钝化程度也不同。基于此原理，本研究将多壁碳纳米管/血红蛋白/壳聚糖修饰的生物传感器用于油炸食品中丙烯酰胺的检测。利用差分伏安脉冲法对油炸食品中丙烯酰胺进行定量分析并对条件优化，多壁碳纳米管修饰量为10 μg/cm2、支持电解质溶液为0.1 mol/L的PBS溶液（pH=7.4，含5×10-3 mol/L K4[Fe(CN)6]，0.1 mol/L NaCl），其中K4[Fe(CN)6]作为氧化还原探针，电位增量0.008 V、脉冲幅度0.05 V、脉冲宽度0.1 V、脉冲间隔0.1 s，丙烯酰胺线性检测范围3.0×10-8mol/L~3.0×10-7 mol/L，最低检测限（S/N=3）为1.2×10-8 mol/L。与高效液相色谱法相比，该法具有简便、快速、准确、样品预处理简单、无需衍生化等优点。
关键词：丙烯酰胺；快速检测；纳米生物传感器；食品安全
文章篇号：1673-9078(2015)2-268-273 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2015.2.042 Rapid Detection of
Acrylamide in Fried Food by Nanotechnology-bad
Hemoglobin Bionsor
FEI Y ong-le, W ANG Li-ran, LI Shu-guo
星期一英语怎么读(Hebei University of Science & Technology, Shijiazhuang 050018, China) Abstract:Acrylamide is a neurotoxin and a potential carcinogen. Hemoglobin (Hb) bionsor passivation can be achieved by the formation of a covalent compound by acrylamide with the -NH2group of the N-terminal valine of hemoglobin. Different concentrations of acrylamide produce different degrees of passivation. Bad on this principle, hemoglobin bionsors were prepared by immobilizing multi-wall carbon nanotubes (MWCNTs) and Hb in a chitosan film on the surface of glassy carbon electrodes and the were ud for the detection of acrylamide in fried food. The optimum analysis conditions for the detection of acrylamide in fried food by differential pul voltammetry (DPV) was determined as follows: pul increment 0.008 V, pul amplitude 0.05 V, pul width 0.1 V, pul interval 0.1 s. The oxidative-reductive detector consisted of 10 μg/cm2 MWCNTs and the supporting electrolytes were 0.1 mol/L PBS (pH 7.4), 0.1 mol/L NaCl and 5×10-3 mol/L potassium ferrocyanide. The linear range of respon was from 3.0×10-8 mol/L to 3.0×10-7mol/L and the detection limit was estimated as 1.2×10-
8 mol/L, taking into account a signal-to-noi ratio of 3. The developed method is practical in the determination of acrylamide in fried foods, with the advantages of simplicity, rapidity, nsitivity, and accuracy over the standard high-pressure liquid chromatography method.
Key words: acrylamide; rapid detection; nanoarray bionsor; food safety
研究表明丙烯酰胺（acrylamide，Acr）是一种神经毒素，具有潜在致癌性。自2002年瑞典国家食品局和斯德哥尔摩大学的科学家首次公布薯片、油条、麻花等含淀粉碳水化合物的食物经长时间高温油炸，检测出不同含量的丙烯酰胺以来，食品中丙烯酰胺的监收稿日期：2014-07-03
基金项目：国家自然科学基金面上项目(20876165)；河北省教育厅科技项目（2009329）
作者简介：费永乐（1989-），女，硕士研究生，研究方向：食品科学与安全通讯作者：李书国（1969-），男，博士，教授，研究方向为粮油食品科学与安全技术控引起各方的普遍关注[1~2]，各国科技工作者对食品中丙烯酰胺检测技术方法、减控方法[3~4]等进行了深入探讨和研究，取得不同程度的进展，分析方法中以质谱—色谱法最为普遍，该方法虽然精确度高，但前处理比较复杂，所需药品多，耗时长、设备较为昂贵。
生物传感器技术具有简单快速、灵敏度高、检测费用低、可实现在线检测、现场检测等优点，所以近
年来国外学者对该法在Acr的定量分析方面进行了研究，并认为该法是替代色谱法的重要方法。Silva[5]等人运用电位生物传感器和离子选择电极，以酰胺酶的酶活作为检测丙烯酰胺含量的指标，测定食品中的丙
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烯酰胺。Stobiecka[6]等人将血红蛋白（Hb）和表面活性剂双十二烷基二甲基溴化铵（dimethyldioctadecyl- ammonium bromide，DDAB）形成的脂质体DDAB-Hb 涂布在碳糊电极表面形成膜，利用循环伏安法准确测定出薯片中丙烯酰胺含量。
多壁碳纳米管（MWCNTs）是一种新型纳米材料，碳纳米管修饰的生物传感器的电子转移速率显著提高，同时对一些生物分子表现出良好的电催化行为[7]，如Hb、辣根过氧化酶、葡萄糖氧化酶等[8]。壳聚糖（chitosan）可通过自身的氨基和羟基与其他分子发生共价结合而被修饰。本文旨在制备多壁碳纳米管/血红蛋白/壳聚糖修饰玻碳电极（GCE）的纳米生物传感器（MWCNTs-Hb-CHIT生物传感器），以亚铁氰化钾为氧化还原探针表征该纳米生物传感器的特性，建立了一种快速检测食品中丙烯酰胺的方法。
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
血红蛋白（Hb，牛血液），购于Sigma公司，多壁碳纳米管（直径8~15 nm，长度50 μm，纯度大于95%）购于广东纳米材料港有限公司；亚铁氰化钾、丙烯酰胺（纯度＞99.9%）、氯化钠、蚁酸（分析纯）、丙酮（分析纯）、醋酸（分析纯），天津永大化学试剂开发中心；磷酸缓冲液（由磷酸氢二钠、磷酸二氢钠按比例配得）、浓硫酸、98%浓硝酸、戊二醛、壳聚糖，天津博迪化工股份有限公司；甲醇（色谱纯），北京天华化学试剂开发公司；实验用水均为二次蒸馏超纯水；麻花、方便面、饼干和薯片等购于本地超市。
1.2 仪器和设备原料
LK98 B II型微机电化学分析系统，天津兰力科化学电子高技术有限公司；三电极系统（3 mm玻碳圆盘电极为工作电极、铂丝电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极）、电解杯，上海CHI仪器公司；FA2204型电子分析天平，上海著海仪器有限公司；KQ2200型超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；TGL-10B 高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；高效液相色谱仪（岛津LC-10A，250 mm×4.6 mm，5 μm，配紫外可见检测器），日本岛津公司；TU1810系列紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；反相C18萃取小柱（200 mg/3 mL），江苏天翔新型建材有限公司。
1.3 MWCNTs-Hb-CHIT生物传感器的制备1.3.1 玻碳电极的预处理
用二次蒸馏超纯水洗净玻碳电极表面，在含有Al2O3粉末的Microcloth上抛光成镜面，在1:1（V/V）的
硝酸、无水乙醇，二次蒸馏水中分别超声洗涤30 s 以除去微量的Al2O3和可能的污染物，于空气中干燥。修饰前先置于0.5 mol/L的H2SO4溶液中用循环伏安法扫描进行活化处理，扫描范围-1~1 V，速率为50 mV/s，活化后用蒸馏水冲洗干净，氮气吹干备用。1.3.2 MWCNTs的活化
取100 mg MWCNTs置于100 mL浓硫酸和浓硝酸混合液中（浓H2SO4：浓HNO3=3:7，V/V），超声振荡7 h，于80 ℃水浴进行冷凝回流2 h，冷却至室温后过滤，分别用蒸馏水、丙酮洗至中性，于空气中干燥。
1.3.3 MWCNTs/Hb/CHIT生物传感器的制备
称取0.10 g壳聚糖溶于100 mL体积分数1%的醋酸溶液，超声20 min后用磁力搅拌器搅拌3 h，用氨水调节其pH至7.4，加热至65 ℃，加0.2 mL戊二醛，离心半个小时，收集浮在上面的絮状物，用稀醋酸洗涤，将复合物重新溶于壳聚糖醋酸溶液得到溶液A。取5 mg Hb溶于1mL浓度为0.1 mol/L磷酸缓冲溶液PBS（pH=7.4，含0.1 mol/L的NaCl）中，配成5 mg/mL 的Hb溶液备用记为溶液“B”。取10 μL的A溶液与10μL的B溶液混合，准确取6 μL混合液滴涂在GCE 表面，将电极放置在4 ℃下24 h使溶剂挥发形成修饰膜，MWCNTs-Hb-CHIT生物传感器制备完成，在0~4 ℃保存备用。
1.4 油炸食品样品中Acr的提取
以市售油条、方便面、饼干、2种不同种类麻花为样品，称取10 g均质的粉碎后的样品于50 mL离心管中，加入20 mL 0.1%的蚁酸水溶液，震荡摇匀，8000 r/min离心15 min，收集第1次的上清液，然后在沉淀中再加入20 mL 0.1%的蚁酸水溶液，如上操作，连续收集2次上清液，然后在上清液中加入10 mL的正己烷，再离心20 min，收集液体。用注射器避开油层吸取上清液中间清液5 mL，过0.45 μm的PVDF滤膜，再取2 mL滤液通过预先活化的C18固相萃取小柱，待样液全部通过后用l mL水冲洗，弃去滤液，最后用2 mL洗脱液（10%甲醇+90%水+0.1%蚁酸）洗脱，弃去最初的0.5 mL滤液[9]，收集剩余的滤液备用。
1.5 Acr含量的测定
1.5.1 MWCNTs-Hb-CHIT生物传感器测定Acr含量
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以MWCNTs/Hb/CHIT生物传感器为工作电极、Ag/AgCl为参比电极、铂丝电极为对电极，向电解杯中加入一定量浓度为0.1 mol/L的PBS溶液（pH=7.4，含5×10-3 mol/L K4[Fe(CN)6]，0.1 mol/L NaCl）电解质溶液，然后加入一定体积的Acr标液或提取液，使其总体积为5 mL，通氮除氧15 min，在1.0~-0.5 V电位范围内进行差分脉冲伏安扫描，其中电位增量0.008 V、脉冲幅度0.05 V、脉冲宽度0.1 V、脉冲间隔0.1 s、
等待时间2.0 s，根据峰电流值绘制标准曲线测定Acr
的含量。
1.5.2 高效液相色谱法（HPLC）测定Acr含
量
HPLC分析条件：流动相选甲醇：水=5:95（V/V）；
流速为0.50 mL/min；柱温为25 ℃；检测波长为200
nm；进样量为20 μL；保留时间为9.84 min。样品浓
度计算：以峰面积值—丙烯酰胺浓度绘制标准曲线，
根据标准曲线方程，计算样品中丙烯酰胺的浓度。
2 结果与讨论
2.1 MWCNTs-Hb-CHIT生物传感器电化学表
征
图1 不同修饰的传感器在电解质溶液中循环伏安图
Fig.1 Cyclic voltammograms of d ifferently mod ified bionsors
in supporting electrolyte
注：a：GCE，b：Hb/GCE，c：MWCNTs/Hb/GCE，d:MWCNTs
/Hb/CHIT/GCE；支持电解质：0.1 mol/L的PBS溶液（pH=7.4，
含5×10-3 mol/L K4[Fe(CN)6]，0.1 mol/L NaCl）。
不同修饰电极在0.1 mol/L的PBS溶液（pH=7.4，
含5×10-3 mol/L K4 [Fe(CN)6]，0.1 mol/L NaCl）中进行
循环伏安扫描，其循环伏安图如图1。从图中可以看
到，玻碳电极（a）上出现一对氧化还原峰，而在
食欲Hb/GCE（b）上看不到血红蛋白的电化学行为，这是
因为血红蛋白本身的结构阻碍了K4[Fe(CN)6]扩散到
电极表面上。血红蛋白是动物骨骼肌的一种氧化还原
蛋白质，由四个聚合肽链组成，在红细胞中每一个肽
链含有一个能贮藏和转移氧的血红素，而且分子中含
有一个电活性的铁血红素辅基[10]，它是研究含血红素
蛋白质电子转移的理想分子。很多研究者试图将血红
蛋白固定在电极表面进行直接电化学研究，但是由于
Hb庞大的三维蛋白质结构，导致其强烈地吸附在电极
表面而产生电极钝化，结果使Hb的电活性中心难以
接近电极表面而无法实现蛋白质与电极表面直接电子
传递[11,12]，使其很难在裸电极表面发生直接电化学，
因此必须借助电子媒介体的参与来帮助加强Hb的电
子转移。
图2 MWCNTs-Hb-CHIT生物传感器在不同扫速下的循环伏安图
Fig.2 Cyclic voltammogram of MWCNTs-Hb-CHIT bionsor
at different scanning sp eeds
注：插图为峰电流与扫描速率平方根的线性关系图；（a）
0.03 V/s（b）0.05 V/s（c）0.08 V/s（d）0.1 V/s（e）0.15 V/s；
支持电解质：0.1 mol/L的PBS（pH=7.4，含5×10-3 mol/L
K4[Fe(CN)6]，0.1 mol/L NaCl）。
多壁碳纳米管具有优良的电子传递性能，能促进
一些重要蛋白质（如Hb）的电子转移反应。壳聚糖具
有易成膜型，生物兼容性，在修饰液中添加少量的壳
聚糖溶胶有助于防止成膜时的脆裂，增强纳米材料修
饰电极的稳定性[13]，几种不同修饰的生物传感器分别
在电解液中进行循环伏安扫描，其循环伏安图如图1
所示。从图中可看出Hb/GCE（b），Hb/MWCNTs/GCE
（c），MWCNTs/ Hb/CHIT/ GCE（d）的循环伏安图
峰电流依次增大，表明MWCNTs为Hb与电极提供了
一个良好的界面，能有效地提高电子转移的速率，同
时提高修饰电极的生物兼容性，因此
MWCNTs/Hb/GCE（c）生物传感器与Hb/GCE（b）
相比，其循环伏安图表现出了显著的氧化还原峰。在
MWCNTs/Hb/GCE生物传感器的基础上，在修饰液中
加入壳聚糖保证其修饰膜稳定性制备出MWCNTs/
Hb/CHIT/GCE生物传感器，由图1可见，MWCNTs/Hb/
CHIT/GCE生物传感器的氧化还原电流大于
MWCNTs/Hb/GCE的电流，且峰形较好。
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脑的结构图
为了考察MWCNTs-Hb-CHIT生物传感器的电极传质过程是受扩散控制还是吸附控制影响，将MWCNTs-Hb-CHIT生物传感器置于0.1 mol/L的PBS （pH=7.4，含5×10-3 mol/L K4[Fe(CN)6]，0.1 mol/L NaCl）电解质溶液中，在不同速率下进行循环伏安扫描，结果如图2。图中氧化峰电流与还原峰电流比值约为1∶1，两峰电位差约为300 mv，表现为不可逆
的电极过程。扫描速率设定为0.15 V/s、0.1 V/s、0.08
V/s、0.05 V/s、0.03 V/s，随着扫描速率的加快，峰电位发生移动，峰电流增加，峰电流（I）与扫描速率的平方根（v1/2)在0.03 V/s~0.15 V/s之间呈线性关系（图2），线性回归方程分别为：I=236.12v1/2-3.3969（r=0.9953），I=237.79v1/2+3.0807（r=0.9962），表明电极传质过程主要是受扩散控制。
实验中，MWCNTs首先沉淀在GCE表面，然后Hb被固定在MWCNTs/GCE上，这样溶液中Acr分子可以和Hb结构中N-末端缬氨酸的α-NH2形成共价化合物Hb-Acr（反应机理见图3），钝化电极，达到定量检测Acr的目的。
图3 丙烯酰胺与血红蛋白形成共价结合物反应机理Fig.3 The mechanism of covalent compound formation b etween
acrylamide and hemoglob in
2.2 MWCNTs-Hb-CHIT生物传感器测定Acr 的分析条件优化
2.2.1 MWCNTs的用量
经过强酸的化学性处理，碳纳米管不仅被活化，同时缩短了长度，在碳纳米管末端发生羧基和酚基结合反应。试验表明，电极表面的多壁碳纳米管用量会对峰电流产生影响，开始氧化峰电流随多壁碳纳米管量的增加而逐渐增加，这是因为电极表面的活性点随多壁碳纳米管量的增加而增多，显著提高电子转移速率，最终导致氧化峰电流也增加。当用量超过10 μg/cm2时，氧化峰电流反而降低，此时电极表面的膜变厚，阻碍了K4[Fe(CN)6]与电极之间的电子交换。因此本法选多壁碳纳米管的用量为10 μg/cm2。
2.2.2 电解质溶液pH的选择
按比例调节磷酸氢二钠、磷酸二氢钠用量，分别制备0.1mol/L，pH为5.8、6、6.5、7、7.4、7.7和8的PBS缓冲溶液（含5×10-3 mol/L K4[Fe(CN)6]，0.1 mol/L NaCl），研究支持电解质的pH值对峰电流的影响。图4表明，随着pH值的升高，还原峰电流逐渐增大，当pH为7.4时，峰电流达到最大，随后又逐渐降低，说明修饰膜中的Hb与溶液中Hb催化反应所需最适宜的pH值一致，同时考虑到Acr在中性及偏酸性条件下可以稳定存在，所以支持电解质pH值选为7.4。
图4 支持电解液pH对峰电流影响
Fig.4 The effect of supporting electrolyte pH on peak current 2.2.3 扫描次数影响
图5 扫描次数对峰电流和峰电位影响
Fig.5 The effect of scanning time on p eak current and peak
potential
关于立夏的诗注：1~5分别代表扫描次数。
关于年的古诗实验考察扫描次数对对峰电位和电流的影响，如图5所示。随着扫描次数的增加峰电流明显下降，但峰电位基本不变。由于Hb-Acr的形成属于不可逆的过程，即溶液中Acr会以Hb-Acr结合物的形式附在电极表面，不再回到溶液中，因此在实际测定中，电极经修饰后，只需扫描一次即可。
2.2.4 电位增量的影响
电位增量分别取0.05 V、0.02 V、0.01 V、0.008 V、0.006 V、0.004 V进行脉冲扫描，结果表明当电位增量大于0.01 V时，峰电流较低且峰形不好，电位增量为0.004、0.005、0.008 V时扫描效果差异不大，但考虑到电位增量越小，扫描一次所需时间相对延长，故电位增量取0.008 V。
271
272
2.3 标准曲线
2 4.20 1.50 5.62±2.01 95.10 2.2
3 3 4.20 2.50 6.64±0.77 97.60 1.08 4
列组词
4.20
3.50
7.55±2.66
95.71 2.55
按实验方法对麻花样品中Acr 含量进行测定，同时进行回收率试验，结果见表1。结果表明其回收率
在90.0%~97.6%之间，RSD 在1.08%~2.55%范围内。
2.5 食品样品丙烯酰胺的测定结果
把K 4[Fe(CN)6]作为氧化还原探针表征该生物传感器的特性，实验表明电极传质过程主要是受扩散控制。利用差分伏安脉冲法研究了丙烯酰胺在该生物传感器上的电化学行为。通过对实验条件的选择和优化，确定最佳分析条件。在最优条件下对多种油炸食品中Acr 含量进行测定，所测数值与HPLC 测
定结果一致，
加标回收率和精密度良好，能够满足实际应用需要。
3.2 我国将食品中丙烯酰胺的控制及风险评估列为国家重大科技专项“食品安全关键技术”项目之一，卫生部食品安全计划也将食品中丙烯酰胺检测方法研究及暴露水平监测作为一个重要科研课题，利用纳米生物传感技术测定食品中丙烯酰胺具有简便、准确、无需衍生化等优点，对人们日常饮食中丙烯酰胺的快速检测具有重要意义，同时为健全食品质量监控体系提供参考方法。
票据理财参考文献
[1]范云露，陆启玉.食品中丙烯酰胺的形成与风险分析[J].粮油
食品科技,2013,5(21):84-88国庆节活动
FAN Yun-lu, LU Qi-yu.Formation of acrylamide in food and its risk analysis [J].Science and Technolog y of Cereals, Oils and Foods, 2013, 5(21): 84-88
[2]朱雨辰.食品中丙烯酰胺的研究进展[J].食品安全质量检测
学报,2013,4(2)
ZHU Yu-Chen, WANG Fei, SONG Jian.Recent progress of acrylamide in heat-procesd foods [J].Journal of Food Safety and Quality. 2013,4(2)
[3]龙小涛，何嘉锐，叶雪丽.食品中丙烯酰胺的抑制方法研究进
展[J].现代食品科技,2012,28(6):688-690
[4]赵永日，金昌海.食品中丙烯酰胺的分析与控制研究进展[J].
农产品加工,2013,6:58-61
[5]Joanna O, Ewa N. New trends in quantification of acrylamide
in food products [J]. Talanta, 2011, (86): 143-151
[6]Stobiecka A, Radecka H, Radecki J. Novel voltammetric
bionsor for determining acrylamide in food samples [J].
Bionsors and Bioelectronics, 2007, 22(9-10): 2165-2170 [7]Jia J B, Wang B Q, Zhu Q. A reagentless amperometric
immunonsor bad on gold electrode for nanoparticles/ thionine/ Nafion-membrane-modified determination of α-1-fetoproein [J]. Electrochem. Commun, 2005, 7, 355-360 [8]Agnieszka Krajewska, Jerzy Radecki and Hanna Radecka. A
voltammetric bionsor bad on glassy carbon electrodes modified with single-walled Carbon nanotubes/hemoglobin for detection of acrylamide in water extracts from potato crisps [J].
Sensors 2008, 8, 5832-5844
[9]张文玲，王丽然，费永乐等.微分脉冲伏安法快速测定油炸食
品中丙烯酰胺[J].食品科学,2013,34(22):154-159
[10]Wang Q L, Lu G X, Yang B J. Direct electrochemistry and
electrocatalysis of hemoglobin immobilized on carbon paste electrode by silica sol-gel film [J]. Bions. Bioelectron. 2004, 19, 1269-1275
[11]Muhammad J A Shiddiky, Angel A J Torriero. Application of
ionic liquids in electrochemical nsing systems [J].
Bionsors and Bioelectronics, 2011 (26): 1775-1787
[12]Jo M. Pingarron, Paloma Yanez-Sedeno, Araceli
Gonzales-Cortez.Gold nanoparticle-bad electrochemical bionsors [J].Electrochim. Acta, 2008 (53), 5848-5866 [13]邹小智.纳米材料/血红蛋白修饰电极的电化学行为及其应
用研究[D].华中师范大学,2007
Zou Xiaozhi. Electrochemical behavior of nanomaterial/hemoglobin modified electrode and its application [D].Central China Normal University, 2007
273
