作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2022, 48(11): 2706 2714 zwxb.chinacrops/ ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9 E-mail:***************
本研究由海南省重点研发计划项目(ZDYF2022XDNY135), 中国农业科学院科技创新工程(CAAS-ZDRW202201)，国家重点研发计划项目(2021YFD1201603-2)和国家自然科学基金项目(31601302)资助。
This study was supported by the Key Rearch and Development Program of Hainan Province (ZDYF2022XDNY135), the Agricultural Sci-ence and Technology Program for Innovation Program (CAAS-ZDRW202201), the National Key Rearch and Development Program of China (2021YFD1201603-2), and the National Natural Science Foundation of China (31601302).
*
通信作者(Corresponding authors): 张辉,E-mail:******************；胡正,E-mail:*****************
同等贡献(Contributed equally to this work)
第一作者联系方式: 陈向前,E-mail:***********************；姜奇彦,E-mail:******************
Received (收稿日期): 2021-11-26; Accepted (接受日期): 2022-02-25; Published online (网络出版日期): 2022-03-08.
URL: knski/kcms/detail/11.1809.S.20220305.1514.002.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2022.14220
大豆多基因编辑表达载体的构建及应用
陈向前** 姜奇彦** 孙现军 牛风娟 张慧媛 胡 正* 张 辉*
中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081
摘 要: 大豆基因家族往往存在多个功能相似的基因, 开发多基因编辑载体对多基因或基因家族进行编辑, 对遗传转化效率低的大豆的基因编辑及基因功能研究具有重要的应用价值。本研究利用大豆特有的不同U6启动子驱动表达sgRNA, 利用载体上同尾酶将不同大豆U6启动子表达的sgRNA 进行串联, 成功构建了可以同时对大豆多个基因进行编辑的CRISPR/Cas9多基因编辑表达载体pCambia3301-Cas9-GmU6n-gDNAn 。并利用该载体, 在大豆发状根中成功实现了大豆GRF (Growth-Regulating Factor)基因家族不同成员同时被编辑的目的。该载体的创建有效提高了大豆基因编辑效率, 为大豆基因编辑及基因功能研究提供重要的工具。 关键词: 大豆; U6启动子; CRISPR/Cas9多基因编辑载体; 发
状根
Construction and application of soybean CRISPR/Cas9 multiplex editing vector
CHEN Xiang-Qian **, JIANG Qi-Yan **, SUN Xian-Jun, NIU Feng-Juan, ZHANG Hui-Yuan, HU Zheng *, and ZHANG Hui *
Institute of Crop Sciences, Chine Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract: Most members of one gene family have similar function in soybean. Construction of soybean multiplex editing vector to edit multiple genes or gene families have important application value in soybean gene editing and gene functions, especially for the soybean with low transformation efficiency. Here, we reported a CRISPR/Cas9 multiplex editing vector, pCambia3301- Cas9-GmU6n-gDNAn, that enabled the editing of multiple genes in soybean. In this vector, different sgRNAs were driven by different soybean U6 promoters, and multiple sgRNA expression casttes were asmbled into pCambia3301-Cas9 vector by isocaudamers. The result showed that this system could simultaneously produce multiple mutations in soybean hairy roots by targeting multiple GRF genes via single transformation events. This vector can improve the efficiency of gene editing in soybean, and provide a simple toolbox for studying functions of multiple genes and gene families i
n soybean for basic rearch and genetic improvement.
Keywords: soybean; GmU6 promoter; CRISPR/Cas9 multiplex editing vector; hairy root
基于成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)的基因组编辑技术主要通过细胞内 Cas9 (CRISPR-associated protein 9)蛋白结合一条末
端与目标基因20碱基互补的单链非编码RNA (single guide RNA, sgRNA), 利用互补的20碱基引导序列(guide RNA, gRNA)锁定目的基因, 在Cas9蛋白作用下切割目的基因, 通过生物体内的非同源重组或同
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第11期陈向前等: 大豆多基因编辑表达载体的构建及应用 2707
源重组机制对断裂DNA进行非精确修复, 从而导致目的基因发生突变[1]。自2013年首次报道CRISPR/ Cas9基因编辑技术应用于植物之后[2-4], CRISPR/ Cas9基因编辑技术广泛地应用于不同植物目标基因的定点突变, 是获得植物基因功能研究所需突变体的一种重要技术手段[5]。CRISPR/Cas9基因编辑技术可以高效的获得目的基因的突变体, 而且等位基因的双突变体在T0代就能获得, 这为植物基因功能研究节省了大量的时间[4]。CRISPR/Cas9基因编辑技术诱导形成的突变体能在子代中稳定的遗传, 可以用子代进行基因功能研究[6-8]。CRISPR-Cas9基因编辑技术同样在作物品种改良上获得了广泛的应
用。Wang等[9]首次报道了在面包小麦中抗白粉病基因MLO (mildew resistance locus O)进行突变, 获得了抗白粉病的小麦株系。对油菜BnaMAX1 (Brassica napus more axillary growth 1)基因的编辑可以有效的改善油菜株型并增加产量[10]。Li等[11]对棉花CLA (cloroplastos alterados)基因的编辑获得了不含棉酚的棉花。Pramanik等[12]对番茄Pel和Mol1基因的编辑, 使番茄获得了对黄化曲叶病毒和白粉病的抗性。Qi 等[13]对玉米MS26 (male sterile 26)基因的编辑, 创制了玉米雄性不育系, 使一步法实现玉米杂交育种成为现实。CRISPR-Cas9基因编辑技术以其简单、高效、快速和费用低的特点, 已成为植物以及作物的基础研究和遗传改良的必不可少的工具[14]。
大豆是由四倍体进化而来的二倍体作物, 基因组经历了2次复制而具有高度的重复性, 约75%基因存在多个拷贝[15]。对大豆基因功能研究, 往往涉及同一家族多个基因的功能研究, 因此开发多基因编辑载体, 对大豆多基因编辑已成为大豆基因功能研究的一种有效手段。目前在植物中已开发了多个多基因编辑技术, 利用植物体内RNA核酸酶对tRNA 的自剪切作用, Xie等[16]将多个sgRNA用tRNA进行串联, 在水稻中实现了对多个基因的编辑。利用拟南芥U6-26启动子串联表达不同sgRNA, 在烟草中对多个基因进行了编辑[17]。Ma等[18]利用水稻U6和U3启动子的串联, 在水稻中实现了多基因的编辑。在大豆中, 利用拟南芥不同U6启动子串联, 同时对SPL9 (squamosa promoter binding protein-like 9)基因家族和LHY (later elongated hypocotyls)基因家族的多个基因进行了突变[19-20]。大豆有11个U6启动子, 不同启动子具有不同的基因编辑效率[21]。与拟南芥U6启动子相比, 大豆U6启动子驱动sgRNA的表达具
有更高的大豆基因编辑效率[22], 因此利用大豆不同U6启动子进行多基因表达载体的构建, 是对大豆多基因编辑的一种有效方法。
本研究选用GRF基因作为多基因编辑的对象。GRF基因是一个多基因家族, 大豆中存在24个GRF 基因。另外GRF基因作为miR396的靶基因, GRFs都含有miR396靶位点CGTTCAAGAAAGCCTGTGG AA, 其中还含有PAM位点TGG, 据此设计CRISPR/ Cas9的靶位点。由于GRF基因内miR396靶位序列的保守性, 一个gDNA可以覆盖多个GRF基因。本研究设计了4个gDNA, 单个gDNA可以靶向多个(2~6个) GRF基因, 4个串联gDNA可以精确靶向13个GRF基因, 使单次转化可以尽可以的获得多个基因的突变, 从而达到多基因编辑的目的。
1 材料与方法
1.1植物材料
大豆Williams 82由本实验室保存。
1.2 菌株与质粒
菌株为大肠杆菌菌株Trans1-T1, 购买于北京全式金生物技术有限公司, 发根农杆菌K599由中国农业科学院作物科学研究所侯文胜老师课题组惠赠。质粒pGmU6-10-sgRNA2.0、pGmU6-2、pGmU6-8、p
GmU6-11[21]和pCambia3301-Cas9[22]由本实验室保存, 各载体序列见附图1。
角蛋白酶
1.3方法
1.3.1 pGmU6-10-sgRNA3.0载体构建在载体pGmU6-10-sgRNA
2.0的基础上, 加入拟南芥PDS (Phytoene Dehydrogena)基因, 构建为pGmU6-10- sgRNA
美国恐怖电视剧3.0载体。具体为, 将pGmU6-10-sgRNA2.0载体用Bsa I酶切, 酶切总反应体系为50 μL, 其中10× FastDigest Green buffer 5 μL, pGmU6-10-sgRNA2.0 20 μL, Bsa I 4 μL。混匀, PCR仪内37 30 min,
℃并对酶切产物进行凝胶回收。
用引物对PDS-HF/R克隆拟南芥PDS基因, PCR 总反应体系为50 μL, 其中2× TransStart FastPfu PCR SuperMix 25 μL, PDS-HF (10 μmol L–1)和PDS- HR (10 μmol L–1)各1 μL, 拟南芥基因组DNA 2 μL。PCR反应程序为94 5 min; 94 30 s, 55 30 s,
℃℃℃
72 1 min, 32
℃个循环; 72 10 min; 4
℃℃保温。并对PCR产物进行回收。
最后利用同源重组的方法将载体pGmU6-10- sgRNA2.0和拟南芥PDS基因连接, 构建为pGmU6-
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10-sgRNA3.0载体。总反应体系为 4 μL, 包含pGmU6-10-sgRNA和PDS同源重组反应体系为2× HiFi Asmbly Cloning Mix 2 μL、pGmU6-10-sgRNA 酶切回收产物和PDS扩增回收产物各1 μL。反应程序为50 30 min
℃。将连接产物转化大肠杆菌, 随机挑取3~5个克隆, 测序验证序列的准确性。所用引物序列见表1。
1.3.2 pGmU6-2/8/11-sgRNA3.0载体构建在pGmU6-10-sgRNA3.0载体的基础上, 分别用基因编辑效率相对较高的大豆U6启动子G mU6-2、GmU6-8、GmU6-11[21]替换GmU6-10, 分别构建pGmU6-2-sgRNA3.0、pGmU6-8-sgRNA3.0、pGmU6- 11-sgRNA3.0载体, 各载体序列见附图1。以pGmU6- 2-sgRNA3.0载体构建为例具体为, 将pGmU6-10- sgRNA3.0载体用Bst E II和Xho I双酶切, 去掉GmU6-1
0, 酶切总反应体系50 μL, 其中10× Fast- Digest Green buffer 5 μL, pGmU6-10-sgRNA3.0 20 μL, Bst E II和Eco R I各
2.5 μL。混匀, 37 30 min,
℃回收酶切产物的大片段(切去GmU6-10的pGmU6- 10-sgRNA3.0载体骨架)。然后用引物对GmU6-2-HF/R
表1 本研究所用引物序列
Table 1 Primers ud in this study
萝莉是什么意思引物名称Primer name
引物序列Primer quence (5'-3')
载体构建引物Primers ud in construction of vectors
PDS-HF GAAATGTGCCACCACATGGATTggtgaccGCGCACAACCCTTTCCAGTTTCT
PDS-HR AACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAcctaggCATCATAGTTACTAACCTCACT
GmU6-2-HF TGTAAAACGACGGCCAGAGAATTCGAGCTCGAGTCCAATATGCCC
GmU6-2-HR AACTGGAAAGGGTTGTGCGCGGTCACCAACATCTTGAATGTTGTATGTC
GmU6-8-HF TGTAAAACGACGGCCAGAGAATTCGAGCTCGAGATTCGAGCTCGA
GmU6-8-HR AACTGGAAAGGGTTGTGCGCGGTCACCAATCCATATGTTTTCCTGGGACT
GmU6-11-HF TGTAAAACGACGGCCAGAGAATTCGAGCTCGAGATGGTCTATGAG
GmU6-11-HR AACTGGAAAGGGTTGTGCGCGGTCACCAACCAGTTTGTTCCATCTCTG
串联sgRNA构建引物Primers ud in asmbling of multiple sgRNA expression casttes
U2-GRF TGACATACAACATTCAAGATGTTGAAACCGTTCAAGAAAGCCTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT U8-GRF TAGTCCCAGGAAAACATATGGATTGCCACAGGCTTTCTTGAACGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT U10-GRF GAAATGTGCCACCACATGGATTGGTTCCACAGGCTTTCTTGAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT
学期目标U11-GRF CAGAGATGGAACAAACTGGTTGGAATCGTTCAAGAAAGCCTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT GRF突变检测PCR引物Primers ud in the detection of GRF mutations
GRF5-F/R GAGCCAGGGAGGTGTAGGAG/AATGTGATGAATGGAATAAACGA
GRF6-F/R ATGGAAAGAAATGGCGATGC/ACCAACCACAAACGAGGAAA
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GRF7-F/R ATGGGATGAGGATGATGATGT/GAGGAATGAGGAGGAATAGGG
GRF8-F/R GAGCCAGGCAGGTGTAGGAG/ACGAATGAGGTGGAAGAGGG
GRF9-F/R CACATCCTCTTCTCGCTCTTC/GAAACTCACCTGGGTTCCTTAT
GRF10-F/R GTTCACAGTGGATGGTGGTTT/CAAGGTATGGCTGAGTGGTAGTA关于责任的事例
GRF13-F/R GCAGGAGGACTGATGGAAAA/TACTTGGAATCGCATAGGGA
GRF14-F/R CCATTTTGTCTTTATTGCTGC/TGGGAAGGTTTTGGAAGTTTA
GRF15-F/R TGTTGATTGGTTATTTGGTGC/TGTGATAGTGGGTTTGGTCTGA
GRF16-F/R ATATTAGTGATAAAGTAGAGGTGGGA/AACTCAATAACAAGCAGACGC
GRF17-F/R ATGAGCGTTCCTCCGCCGTCT/CCCTTGCGCCATTGATGTGC
GRF18-F/R TGACCTCCTTCTCCCCATTC/CAGTTGCAGTTCCAGAAACATTA
GRF19-F/R AATCAGGGTATTGGGGTAGAG/AGGGTGGTGAACAAATGGAA
GRF20-F/R AGGGTATTGGGGTAGAGGAGC/CGAAGAAGATCAAATGGGGAT
GRF21-F/R TCAGGGTACTACTGGCGAAGA/TGACCGAGGTGAAGGAGATT
下画线部分为GRF-gDNA1~GRF-gDNA4, 两侧为重组连接序列。
The underline part in each primer is GRF-gDNA1–GRF-gDNA4, and both sides of gDNA quence are ud for recombinant PCR.
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第11期陈向前等: 大豆多基因编辑表达载体的构建及应用 2709
从pGmU6-2质粒中扩增GmU6-2, PCR总反应体系50 μL, 其中2× TransStart FastPfu PCR SuperMix 25 μL, GmU6-2-HF (10 μmol L–1)和GmU6-2-HR (10 μmol L–1)各1 μL, pGmU6-2质粒0.5 μL。反应程序为: 94℃5 min; 94 30 s, 55 30 s, 72 1 min, 32
℃℃℃个循环;皮皮虾怎么剥
72 10 min; 4
℃℃保温, 并将GmU6-2启动子PCR产物回收。最后用同源重组的方式, 将切去GmU6-10的pGmU6-10-sgRNA3.0载体骨架和GmU6-2启动子DNA同源重组, 构建为pGmU6-2-sgRNA3.0载体。
1.3.3 多靶位点Cas9载体构建从大豆基因组数据库(bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/)中获取大豆GRF基因中miR396靶位点(5'-CGTTCAAG AAAGCCTGTGGAA-3')[23]中的PAM位点(CCT和TGG)下游20 bp序列, 分别设计CRISPR/Cas9的靶位点。GRF-gDNA1/2/3/4寡核苷酸见表1, 不同GRF-gDNA可以靶向同一个GRF基因, 去掉重复后精确靶向13个GRF基因, 还有一些靶标序列只是与gDNA最末端一个碱基不同。具体为: GRF-gDNA1 (5'-AAACCGTTCAAGAAAGCCTG-3')靶向GmGRF4 (Glyma.17G050200)、GmGRF11 (Glyma.16G007600)、GmGRF12 (Glyma.07G038400)、GmGRF19 (Glyma. 03G192200)、GmGRF20 (Glyma.19G192700)、GmGRF22 (Glyma.11G208800); GRF-gDNA2 (5'-CCA CAGGCTTTCTTGAACGA-3')靶向GmGRF5 (Glyma. 17
G232700)、GmGRF6 (Glyma.U028700)、GmGRF7 (Glyma.17G232600)、GmGRF8 (Glyma.U028600); GRF-gDNA3 (5'-GTTCCACAGGCTTTCTTGAA-3')靶向GmGRF19 (Glyma.03G192200)、GmGRF20 (Glyma. 19G192700)、GmGRF21 (Glyma.10G067200)、GmGRF22 (Glyma.11G208800); GRF-gDNA4 (5'-GAAT CGTTCAAGAAAGCCTG-3')靶向GmGRF1 (Glyma. 15G176500)、GmGRF2 (Glyma.09G068700)。而GRF- gDNA4与GmGRF9、GmGRF10、GmGRF13、GmGRF 14、GmGRF15、GmGRF16、GmGRF17、GmGRF18的靶标序列只在远离NGG的最末端相差1个碱基。
将pGmU6-2/8/10/11-sgRNA3.0载体用Bst E II 和Avr II双酶切(切掉PDS基因), 用同源重组方式分别与GRF-gDNA1/2/3/4连接, 构建形成带有不同gDNA和不同GmU6启动子的载体pGmU6-gDNA。将测序正确的不同pGmU6-gDNA质粒进行Xho I和Bam H I, Sal I和Bam H I双酶切。其中Xho I和Bam H I双酶切质粒回收短片段(GmU6-gDNA), Sal I和Bam H I双酶切质粒回收载体骨架长片段, T4连接酶连接长片段和短片段, 总体系10 μL, 其中连接体系为Liner vector DNA 1 μL, Inrt DNA 3 μL, 10× T4 DNA Liga Buffer 1 μL, T4 DNA Liga 0.5 μL。这样重复将短片段pGmU6-gDNA连入, 获得多个sgRNA串联表达载体pU6-10:gDNA1-U6-8:gDNA2- U6-2:gDNA3-U6-11:gDNA4 (pGmU6n-gDNAn)。
最后将串联表达载体和pCambia3301-Cas9表达载体进行Eco R I和Hin d III双酶切, 串联表达载体回收短片段(GmU6n-gDNAn), pCambia3301-Cas9表达载体回收大片段, T4 DNA连接酶连接, 转化。挑取
克隆进行测序, 测序正确的克隆进行质粒提取, 获得多靶位点Cas9载体pCambia3301-Cas9-GmU6n- gDNAn。
1.3.4 大豆发状根诱导及突变位点检测大豆发根农杆菌转化及大豆发状根诱导参考实验室已有方法[24]。将多靶位点Cas9载体pCambia3301-Cas9- GmU6n-gDNAn转化K599。用含多靶位点Cas9载体的农杆菌K599侵染大豆子叶节, 诱导发状根。待从侵染位点长出的发状根长到4~5 cm时取单根提取DNA, 用于突变位点的检测, 检测方法包括被编辑靶基因的PCR产物T7 Endonuclea I酶切检测及单克隆测序。Gma-GRF扩增引物见表1, PCR扩增产物条带单一的可以将PCR产物用T7 Endonuclea I酶切然后琼脂糖凝胶电泳检测。T7酶切总反应体系为10.5 μL, 其中PCR产物5 μL, 10× NE buffer 2 1.1 μL。在95℃条件下, 反应5 min, 再用梯度PCR降温至室温。然后每个反应中加入0.5 μL T7酶, 37℃条件下, 反应30 min, 用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。或者将PCR产物连接到pEASY-T1克隆载体上, 转化后挑取单克隆测序, 查看靶基因突变情况。
2结果与分析
2.1不同启动子驱动的sgRNA
3.0载体的构建
将pGmU6-10-sgRNA2.0载体用Bsa I酶切开, 用引物对PDS-HF/R克隆拟南芥PDS基因, 利用同源重组的方法将拟南芥PDS基因连到切开的载体pGmU6-10-sgRNA2.0上, 构建为pGmU6-10- sgRNA3.0载体。Bst E II和Avr II双酶切pGmU6-10- sgRNA3.0载体验证了PDS基因的连入。pGmU6-10- sgRNA2.0大小为2981 bp, 引入PDS基因后可以同时引入BstE II和Avr II双酶切位点。利用双酶切将PDS基因切除后, 通过琼脂糖电泳, 可以很明显检测出pGmU6-10-sgRNA3.0被酶切(图1-A), 而且引入的PDS基因片段大小为828 bp, 可以很容易将载
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体片段从琼脂糖凝胶上切割下来纯化回收。与传统的sgRNA载体相比, 主要有几个优势: 1) 传统的sgRNA一般用Bsa I单酶切, 而且无外源片段的插入, 酶切用琼脂糖纯化时, 无法通过电泳区分出酶切和非酶切的条带; 而2.9 kb的载体片段插入0.8 kb的PDS基因, 可以很明显区分酶切和非酶切条带, 从而使回收的载体更纯。2) 不同的酶进行双酶切有更高的效率, 可以有效降低假阳性。
将pGmU6-10-sgRNA3.0载体用Bst E II和Xho I 双酶切, 去掉GmU6-10, 回收载体骨架长片段。用引物对GmU6-2-HF/R从pGmU6-2质粒(载体)中扩增GmU6-2。然后用同源重组的方式, 将切去GmU6- 10的pGmU6-10-sgRNA3.0载体骨架和GmU6-2启动子DNA同源重组, 构建为pGmU6-2-sgRNA3.0载体(图1-
B)。以同样的方式, 在pGmU6-10-sgRNA3.0载体的基础上, 分别用GmU6-8、GmU6-11替换GmU6-10, 分别构建pGmU6-8-sgRNA3.0、pGmU6- 11-sgRNA3.0载体。pGmU6-2/8/10/11-sgRNA3.0载体示意图如图1-C。2.2多个sgRNA串联表达载体
分别将pGmU6-2/8/10/11-sgRNA3.0载体用Bst E II和Avr II双酶切, 小片段为切掉的PDS基因, 大片段为载体骨架(图2-A)。将设计好的GRF-gDNA1/ 2/3/4用同源重组方式分别与pGmU6-2/8/10/11- sgRNA3.0载体骨架连接, 构建形成带有不同gDNA 和不同GmU6启动子的载体pGmU6-2/8/10/11- gDNA1/2/3/4。
将测序正确的不同pGmU6-gDNA质粒进行Xho I和Bam H I, 以及Sal I和Bam H I的双酶切。其中Xho I和Bam H I双酶切质粒回收短片段(GmU6- gDNA), Sal I和Bam H I双酶切质粒回收载体骨架长片段(图2-B)。T4连接酶连接长片段和短片段, 将2个GmU6-gDNA连接到一起。同时在载体两端引入了1对同尾酶Xho I和Sal I, 利用同尾酶连接导致酶切位点的消失, 重复上面的步骤后, 将不同U6启动子驱动的sgRNA串联到一个载体上。获得多个sgRNA串联表达载体pGmU6n-gDNAn: 载体核心序列见附图1。
图1不同大豆U6启动子驱动的sgRNA3.0载体的构建
Fig. 1 Vector construction of sgRNA3.0 with different sgRNAs driven by different soybean U6 promoters
A和B: pGmU6-sgRNA3.0表达载体构建, M: DL2000; A1: PDS PCR扩增; A2: pGmU6-10-sgRNA2.0 Bsa I酶切; A3: pGmU6-10-sgRNA3.0 Bst E II和Avr II双酶切。B1: pGmU6-2-sgRNA3.0 Bst E II和Xho I双酶切, B2: GmU6-2, B3: GmU6-8, B4: GmU6-11。C: pGmU6-sgRNA3.0表达载体图。
A and B: construction of pGmU6-sgRNA3.0 vector, M: DL2000; A1: PCR clone of PDS gene; A2: pGmU6-10-sgRNA2.0 digested with Bsa I; A3: pGmU6-10-sgRNA3.0 digested with Bst E II and Avr II; B1: pGmU6-2-sgRNA3.0 digested with Bst E II and Xho I; B2: GmU6-2, B3: GmU6-8, B4: GmU6-11. C: structure of pGmU6-sgRNA3.0 vector.
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