农业机械学报第52卷第2期2021年2月
doi：10.6041/j.issn.1000-1298.2021.02.036
超声复合碱处理大豆蛋白与EGCG复合物功能特性研究
李杨1,2闫世长1徐静雯1谢凤英1武利春1齐宝坤1,2
(1.东北农业大学食品学院，哈尔滨150030；2.国家大豆工程技术研究中心，哈尔滨150030)
摘要：大豆分离蛋白(SPI)经超声复合碱处理后与表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)进行复合形成复合物。采用傅里叶变换红外光谱和荧光光谱对超声复合碱处理及EGCG改性的SPI结构及构象进行解析，以粒径、Zeta电位、浊度及乳化特性为指标，分析该复合体系中SPI构象改变与功能特性之间的关系。结果表明：超声复合碱处理使SPI的粒径减小、溶液电位绝对值增加、乳化性显著提高。超声复合碱处理的SPI与EGCG复合后,SPI的Zeta电位绝对值进一步显著增加，其粒径明显减小，乳化特性显著提高。光谱分析显示，超声复合碱处理以及EGCG可以改变SPI的二级结构，使蛋白链解折叠，并且改变蛋白芳香族氨基酸残基所处的微环境，使蛋白的构象发生改变。
通过荧光淬灭光谱分析发现,EGCG对SPI的荧光猝灭机制为静态猝灭,SPI与EGCG之间形成了结合位点数近似于1的复合物。
关键词：大豆分离蛋白；表没食子儿茶素没食子酸酯；超声复合碱处理；结构；功能特性
中图分类号：TS214.2文献标识码：A文章编号：1000-1298(2021)02_0364_07OSID：
Effects of Complexation with EGCG on Structural and Functional
Properties of Soybean Protein Treated by Ultrasound-assisted Alkali
LI Yang1,2YAN Shizhang1XU Jingwen1XIE Fengying1WU Lichun1QI Baokun1,2
(1.College of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin150030,China
2.National Rearch Center of Soybean Engineering and Technology,Harbin150030,China)
Abstract:Focusing on the effect of interaction with Epigallocatechin gallate(EGCG)on the structure and function of denatured soybean protein isolate(SPI).Fourier transforms infrared(FT—IR) spectros
copy and fluorescence spectroscopy were ud to analyze the structure and conformation of the SPI EGCG conjugates.The relationship between structural change and functional properties was analyzed through the determination of turbidity，emulsifying ability，emulsifying stability，particle size analysis，and Zeta potential analysis.The results showed that the absolute value of Zeta potential，turbidity as well as emulsifying activity and emulsion stability of denatured soybean protein were incread significantly，whereas its particle size was decread.After complexation with EGCG，the functional properties of the protein were further improved.The condary structure of SPI was changed and the protein was unfolded after EGCG were linked to it,which decread the content of琢-helix and incread the content of a random coil.Ultrasound combined alkali treatment also changed the structure of the protein.And the microenvironment around the aromatic amino acid residues in the protein was also changed，resulting in its conformational change.In addition，the fluorescence spectra showed that the fluorescence quenching of ultrasonic-assisted alkali treatment soybean protein by EGCG was a static quenching process with the formation of binding sites clo to1.
Key words:soybean protein isolate；EGCG；ultrasound-assisted alkali treatment；structure；functional properties
收稿日期：20200420修回日期：20200521
基金项目：黑龙江省自然科学基金杰出青年基金项目(JC2018009)和黑龙江省自然科学基金联合引导项目(LH2019C032)
作者简介：李杨(1981—)，男，教授，主要从事粮食油脂及植物蛋白工程研究，E-mail：***************
通信作者：齐宝坤(1986—)，男，讲师，博士，主要从事粮食油脂及植物蛋白工程研究，E-mail：******************
第2期李杨等：超声复合碱处理大豆蛋白与EGCG复合物功能特性研究365
0引言
大豆分离蛋白(Soybean protein isolate,SPI)具有加工性能好、营养价值高、成本低等优点，在食品工业中得到了广泛的应用。SPI在特定食品中的应用形式因其性质而不同，如乳化性、溶解性、凝胶性、分散性以及粘度等。在天然状态下，大豆蛋白的主要成分是储藏蛋白，即7S和11S球蛋白，占总蛋白的65%~80%，蛋白质的致密球状结构与低分子柔性以及不良的界面和乳化特性有关［1］。因此，研究者尝试采用许多技术来修饰和改变大豆蛋白的结构和聚集状态。
超声已被引入来改变食品的功能特性，可依靠产生的空化作用或机械剪切应力破坏蛋白的肽键以及非共价相互作用，改变蛋白的二级结构和疏水性［2］。超声与一些技术相结合可以改善蛋白质的功能特性。pH变换技术简单、易操作，且可以利用静电排斥作用使蛋白解折叠与亚基解离，尤其是在远离蛋白等电点的pH值下，因此，超声常与pH变换相结合来改善蛋白的功能特性［3］。文献［4］报道了超声联合pH处理可使豌豆蛋白结构发生改变，进而改善其功能特性。文献［2］研究发现，超声复合酸处理可以改变SPI的结构，使蛋白聚集体粒径减小、乳化性增强。文献［3］阐明了超声复合碱处理对Oleosin蛋白的结构及功能性的影响，超声复合碱处理可改善蛋白结构，提高其乳化性。文献［5］研究发现，超声复合碱处理较单独处理技术更能改善乳蛋白的结构与乳化特性。然而，超声等物理改性虽可提高蛋白的功能特性，但产生的自由基却可能加速蛋白的氧化⑷，从而限制了其在工业中的高值化应用。
表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)具有抗菌、抗氧化、抗炎以及抗肿瘤作用［7-9］，且具有较强的蛋白亲和性，可以与蛋白复合形成具有功能性质的复合体系［10］。文献［11］研究发现，EGCG与SPI相互作用，可改变蛋白的结构，复合物的乳化性与抗氧化性均得到改善。文献［12］研究发现,EGCG与卵清蛋白相互作用，降低了蛋白的致敏性，提高了蛋白的乳化性。一些学者还研究了改性蛋白与多酚的相互作用。文献［13］研究发现，热与花青素改性SPI使蛋白复合物乳化性得到改善。文献［14］研究发现，超声改性的大豆蛋白与花青素的相互作用使乳化性能明
显提高。文献［15］利用超声辅助大蒜素来改善乳清蛋白的结构，进而提高蛋白的溶解度与乳化特性。文献［16］利用碱处理辅助EGCG改性乳清蛋白，复合物的乳化性与抗氧化性得到增强。由此可知，多酚类成分与蛋白相互作用可以用来改善蛋白的结构与功能，且可以清除氧化自由基，这拓展了蛋白在功能性食品中的应用。然而，关于超声复合碱处理SPI与EGCG复合对蛋白的结构与功能的影响尚未见报道。
本文主要采用荧光光谱、红外光谱探究超声复合碱处理SPI和EGCG复合体系对蛋白结构的影响，通过粒度分析、Zeta电位、浊度、乳化性及乳化稳定性探究超声复合碱处理SPI与EGCG复合体系对蛋白功能性质的影响及变化规律。
1材料与方法
1.1材料与试剂
大豆，市售；EGCG(纯度99%以上)，上海源叶生物科技有限公司；盐酸、氢氧化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、甲醇，均为分析纯，北京新光化工试剂厂；其他试剂均为分析纯。
1.2仪器与设备
AL204型分析天平，梅勒特托利多仪器(上海)有限公司；PHS3C型实验室pH计，中国上海雷磁公司;F
6000型荧光分光光度计，日本Hitachi 公司;TU1800型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司;JJ1型增力电动搅拌器，江苏金城国胜仪器厂;Allegra64R型台式高速冷冻离心机，美国贝克曼公司；IRTracer100型傅里叶变换红外光谱分光光度计，日本岛津公司。
1.3方法
1.3.1样品制备
(1)大豆分离蛋白制备
根据文献［13］的方法，将大豆磨粉，过60目筛，用正己烷脱脂，将脱脂豆粉分散于去离子水中，液料比10mL/g，用2mol/L NaOH溶液调节pH值至9.0，搅拌1h,9000r/min离心30min，取其上清液，然后用2mol/L HCl溶液调节pH值至4.5，得到蛋白沉淀物，将蛋白沉淀物水洗3次,6500r/min离心30min得到沉淀物，将该沉淀物溶解后，用2mol/L NaOH溶液调节pH值至中性，冻干，即得大豆分离蛋白，使用凯氏定氮法测定蛋白含量，蛋白质量分数为(92.28±0.31)%。
(2)超声复合碱处理SPI和EGCG复合物制备
SPI的处理方法参照文献［2,16］的方法进行。
对照组(SPI)：称取大豆蛋白1.0g，溶解到100mL的去离子水中，在25益下搅拌1h，搅拌过程中利用0.1mol/L NaOH维持pH值为7.0，然后在5000r/min的条件下离心15min，得上清液，然后
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怎么弄目录冻干。
超声复合碱处理(UHSPI)：称取大豆蛋白1.0g，溶解到100mL的去离子水中，25益下搅拌1h，搅拌过程中利用0.1mol/L NaOH维持pH值7.0,200W超声处理5min(工作5s、间隔5s)，随后调节pH值至12，保持1h，随后再调节pH值至7.0，然后在5000r/min条件下离心15min，得上清液，然后冻干。
根据文献［17］的方法进行SPI和EGCG复合物的制备，将SPI和UHSPI粉末溶解在10mmo/L的PBS(磷酸盐缓冲液,pH值7.0)中，在室温(20益)下连续搅拌30min，加入EGCG粉末，蛋白与EGCG 质量比为100：1，连续搅拌90min。络合后，将混合溶液冻干进行后续分析。
1.3.2红外光谱
用IRTracer100型傅里叶变换红外光谱分光光度计在室温下记录样品的红外光谱。将样品与KBr混合，然后压片。在500~4000cm-1范围内记录光谱，分辨率为4cm-1。采用Peakfit4.12软件，利用高斯曲线拟合方法拟合琢-螺旋、茁-折叠、茁-转角和无规则卷曲的特征峰［17］，分析其含量。
1.3.3荧光光谱
向10mL的SPI溶液(0.5mg/mL,10mmol/L PBS,pH值7.0)中分别逐滴加入100滋L浓度为2.5、5.0、7.5、10.0.12.5.15.0、17.5、20.0滋mol/L 的EGCG溶液，旋涡振荡后应用F6000型荧光分光光度计测定样品的荧光淬灭光谱［17］o光谱测定条件设置为：激发波长280nm，扫描波长为300~ 450nm，激发狭缝、发射狭缝为5nm，扫描速率为600nm/min。蛋白及复合物的荧光测定条件为，室温条件下，以280nm为激发波长，扫描波长为300~ 450nm。荧光淬灭机制可分为动态淬灭与静态淬灭两种机制，应用Stern-Volmer方程判断猝灭类型，公式为
=1+心Q伊106=1+K q T0Q(1)
式中F0、F——未加入、加入EGCG时SPI溶液的
荧光强度
Q——EGCG的浓度，mol/L
K q—双分子猝灭常数,L/mol
K sv-----动态猝灭速率常数,L/(mol•s)
子0—猝灭剂不存在时荧光体的寿命，生物怎么才能赚到钱
大分子的平均寿命约为10-8s
一般情况下，猝灭剂对于生物大分子最大动态猝灭速率常数为2伊1010L/(mol・s)，当大于这一速率时，则为静态淬灭，静态淬灭满足公式
l g((F0-F)/F)=阪+nl g Q(2)式中K—
—表观结合常数
n—结合位点数
1.3.4粒径
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利用Zetasize Nano ZS90型纳米粒度及Zeta电位分析仪对样品溶液进行粒径分布测定。颗粒折射率1.45，分散剂折射率1.33，吸附率0.001。实验采 用体积平均直径0*3］表征粒径大小并记录溶液粒径的PDI(多分散指数”⑶。
1.3.5电位
采用Zeta电位仪测定样品的Zeta电位，对样品溶液进行适度稀释(样品质量浓度为1mg/mL)，上样量为1mL，测定温度为25益，温度平衡时间为2min［18］。
1.3.6浊度
将待测样品适当稀释后(样品质量浓度为5mg/mL)倒入石英比色皿中，并利用紫外分光光度计在波长600nm处测定样品吸光度，用吸光度表示其浊度［19］o
1.3.7乳化特性
参照文献［13］的方法稍作修改。将样品溶在PBS(10mmol/L,pH值7.0)中至蛋白质量浓度为1mg/mL，向稀释的样品中加入葵花油，水相与油相体积比为3：1，使用高剪切均质机以10000r/min均质3min形成乳状液，立即从其乳状液底部提取50滋L的乳液分散于0.1%的十二烷基硫酸钠溶液稀释100倍。经旋涡振荡后用分光光度法在波长500nm处测定样品的吸光度A500nm，用相同浓度十二烷基硫酸钠溶液作为空白对照，经10min后再次测量其吸光度。乳化活性指数直接用乳液吸光度表示，乳化稳定性指数计算公式为
E SI
100A0
A0一A10
(3)式中九、缶0——乳状液在0、10min时的吸光度
E SI---乳化稳定性指数,min
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1.4数据统计
所有实验重复3次，实验结果采用平均值土标准差表示。利用SPSS20软件进行ANOVA差异显著性分析及相关分析，当P<0.05差异性显著。利用Origin2020进行制图。
2结果与分析
2.1红外光谱分析
通过红外光谱可以分析蛋白二级结构的变化，其光谱与二级结构相对含量变化如图1与表1所示，与SPI相比,UHSPI酰胺I带与酰胺域带的光谱
第2期李杨等：超声复合碱处理大豆蛋白与EGCG复合物功能特性研究367
强度均发生变化，蛋白的琢-螺旋、茁-折叠相对含量显著下降（P<0.05），茁-转角相对含量显著增加。
这可能是因为超声引起的空化作用加速大豆分离蛋白的机械运动，使分子相互撞击，蛋白质的立体二级结构向不定型结构转变［14］，碱诱导产生的静电斥力使蛋白多肽链发生重排，蛋白解折叠，进而改变蛋白的结构［4-5-20］o此外，相应复合物中，UHSPI与EGCG复合之后琢-螺旋相对含量（13.33%）减少最多，无规则卷曲相对含量（17.89%）增加最显著，这可能是因为超声及碱处理使蛋白结构改变，疏水基团暴露,EGCG分子中的氧原子、羟基与蛋白分子中C=O、C—N基团通过疏水作用力结合，使SPI的二级结构改变［21］o文献［22］研究发现超声处理的蛋白内部疏水基团暴露，可增强乳蛋白与阿魏酸的结合，进而使蛋白结构发生改变。
150.——SPI——UHSPI
------SPI-EGCG------UHSBI-EGCG
125
50
25
§001000150020002500300035004000
below是什么意思波»/<m
超声复合碱处理及EGCG对SPI红外光谱的影响Fig.1Effect of EGCG and ultrasonic and alkali treatment
on FT IR of SPI树怎么画简单又好看
表1加入EGCG前、后SPI的二级结构相对含量
Tab.1Changes in the condary structure content of SPI before and after adding EGCG%样品琢-螺旋茁-折叠B-转角无规则卷曲
SPI(16.00±0.10)a(41.88±0.05)a(25.93±0.10)c(16.18±0.10)c UHSPI(14.91±0.10)b(41.04±0.04)b(29.07±0.10)a(14.92±0.10)d SPI ECCG(13.62±0.10)c(39.52±0.10)d(29.26±0.10)a(17.59±0.10)b UHSPI EGCG(13.33±0.10)d(40.78±0.10)c(28.01±0.10)b(17.89±0.20)a 注：同列数据不同小写字母表示差异显著（P<0.05），下同。
2.2荧光光谱分析
内源性荧光对蛋白质的色氨酸残基所处的微环境变化和蛋白质三级结构变化具有较高的灵敏度，因此常作为检测蛋白质空间结构变化的手段。如图2所示，与SPI相比,UHSPI的荧光强度显著增加且发生明
显的红移现象，这可能由于pH值12远离蛋白等电点（pI值约为4.5），提供较多的静电斥力，超声产生的空穴效应及剪切应力作用于SPI，破坏蛋白分子之间的相互作用，使蛋白分子展开，发色基团暴露［2-5-16］。此外，与EGCG复合之后，复合物的荧光强度均降低，表明EGCG对蛋白的荧光起到猝灭作用［17］，同时发现SPI EGCG复合物的最大吸收波长发生了红移,UHSPI与EGCG作用荧光淬灭
Fig.2Effect of EGCG on fluorescence spectroscopy
of ultrasonic and alkali treated SPI 最明显，表明EGCG与UHSPI的结合程度最强，可能是因为超声处理、碱处理与EGCG协同改变了SPI的结构构象，发色基团的微环境发生改变，由疏水环境变为亲水环境，肽链结构舒展［14-16］。
2.3粒径分析
粒径可以直观地表示蛋白聚集体的形成。如图3（图中不同字母表示差异显著）所示，与SPI相比,UHSPI的粒径明显减小，这可能因为超声的空化和机械作用、碱处理产生的静电斥力而最大程度地诱导较大的聚集蛋白塌陷和解离［2-23］，二者协同使蛋白结构展开、蛋白分子间作用减弱、亚基发生解离，粒径变小［3'5］，该结果与文献［5］的研究结果一致。此外，与SPI相比，当SPI与EGCG复合后，其粒径显著减小，且UHSPI EGCG具有更小的粒径，溶液PDI最小（0.32），表明颗粒分布
最为均一。这可能是由UHSPI与EGCG形成的复合物具有最强的负电性所致［13］。此外，文献［24］表示，蛋白与多酚复合后，会较为明显地改变蛋白的性质，使二者内部连接更紧密，从而改善溶液的粒径分布情况。
2.4电位分析
Zeta电位可以表征粒子之间的相互吸引能力。通过电位可以表征溶液的稳定性，电位的绝对值越大，产生的静电斥力越大，粒子之间越不容易发生相互碰撞导致聚集，反之，绝对值越小,
粒子间越易相
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图3加入EGCG前、后超声及碱处理的平均粒径、PDI及粒径分布
Fig.3Average particle size,PDI and particle size distribution in alkali and ultrasound treated soybean protein
solutions before and after being complexed with EGCG
互碰撞发生聚集形成大颗粒［13］。与对照SPI相比((-12.48±0.18)mV),UHSPI电位((-19.69土0.21)mV)绝对值显著增加(P<0.05)，这可能是当pH值变换(pH值由12到7)时，蛋白发生了解折叠的结构变化，带电基团暴露［4-16］o此外，超声利用空化作用打开蛋白结构［2］，超声的空穴效应及机械剪切与碱提供的静电斥力相协同，导致蛋白结构伸展，疏水性残基及带电基团暴露，电位绝对值增加［5］。
SPI与EGCG复合后，溶液的电位绝对值均显著增大(P<0.05),SPI EGCG的电位为(-13.88±0.46)mV,UHSPI EGCG的电位((-21.08±0.16)mV)绝对值最大。可能是由于EGCG带负电荷，并且在中性条件下酚羟基可以去质子化，所产生的氧中心可以输出较高的负电荷密度，与蛋白的正电
基团结合，使得SPI的负电荷相对增加［13］。此外，文献［18］研究表明，多酚与乳蛋白复合后，可降低蛋白的等电点，复合物的负电性增强。
2.5浊度分析
浊度的变化可以反映粒子的聚集情况，浊度主要与溶液的颜色、粒子的粒径等有关［25］。与SPI (0.26±0.014)相比,UHSPI浊度(0.083±0.013)明显减小，这可能是因为超声改变了蛋白的三、四级结构，以及碱处理提供的静电斥力，使蛋白与蛋白的相互作用减小，浊度减小，从而提高溶液体系的稳定性［3-5,16］
SPI与EGCG复合之后，所有复合物溶液的浊度与单纯蛋白溶液相比均显著增加,SPI EGCG的浊度为0.367±0.012，且UHSPI EGCG具有最小的浊度(0.135±0.016)，这可能是由于复合物溶液的粒径减小,PDI降低，溶液分散均匀，导致光发生漫反射，从而导致浊度的增加［24,26］。该结果与文献［19］的研究结论一致，花青素与SPI相互作用，使蛋白的结构改变，粒径更加均匀，光的漫反射增加，溶液浊度增加。此外，由于EGCG在中性及碱性条件下不稳定，易氧化成棕色的醌类物质，所以，溶液的颜色加深，也可能导致浊度增加［25］。
2.6乳化特性分析
乳化活性指数(EAI)及乳化稳定性指数(ESI)可以表征乳状液的乳化特性及稳定状态。EAI表示乳化剂形成油水界面的能力；ESI是指乳状液形成小液滴的抗应变能力［27］。如图4(图中不同小写字母表示乳化活性指数差异显著，不同大写字母表示乳化稳定性指数差异显著)所示，未加入EGCG时，与SPI相比,UHSPI表现出最高的EAI和ESI，可能由于碱处理产生的静电斥力与超声产生的空化作用相辅相成，使蛋白的疏水基团暴露，蛋白的二级、三级结构舒展，分子柔性增加，从而提高其乳化性［2-5］。
鸦片战争原因450
匚U乳化活性指数
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样品
图4EGCG对超声及碱处理的SPI乳化特性的影响
中国近代史时间Fig.4Effect of EGCG on EAI and ESI of ultrasonic
and alkali treated SPI solutions
SPI与EGCG复合后,UHSPI EGCG具有最高的EAI(1.98)、ESI(394.52min)，可能是由于EGCG 的加入增强界面薄膜的表面压力和黏弹性，形成较稳定的界面膜，增加复合物的EAI［10］o另外,SPI与EGCG复合后，油水界面层一部分被蛋白质占据，另一部分被EGCG占据，形成第1层乳化膜，蛋白质的疏水基团充分暴露和EGCG通过疏水相互作用形
