广东化工2021年第7期ꞏ28ꞏ第48卷总第441期
毛豆提取物的体外抗衰老活性研究
胡露，魏瑞敬，聂艳峰，王丽华，陈杰，张巧玲，郭朝万*
(广东丸美生物技术股份有限公司，广东广州510000)
[摘要]以毛豆为研究对象，采用超声波辅助水提取法对其进行提取，通过ABTS+ꞏ清除能力测试、DPPHꞏ清除能力测试、胶原蛋白酶抑制能力测试、弹性蛋白酶抑制能力测试和晚期糖基化终产物AGEs的清除能力测试等方法，对毛豆提取物的体外抗衰老活性进行考察评估。结果显示，毛豆提取物具有良好的体外抗氧化和抗糖化活性：清除ABTS+ꞏ的IC50值为11.16mg/mL，清除DPPHꞏ的IC50值为11.77mg/mL，清除AGEs的IC50值为3.21mg/mL；对与皮肤衰老紧密相关的多种蛋白酶显示出很好的体外抑制活性：抑制胶原蛋白酶的IC50值为12.91mg/mL，50 mg/mL的毛豆提取物具有与阳性对照药物西维来司钠(50μmol/L)相当的抑制弹性蛋白酶的能力。以上结果表明，毛豆提取物具有较好的体外抗衰老活性。
[关键词]毛豆提取物；抗衰老；自由基；晚期糖基化终产物；胶原蛋白酶；弹性蛋白酶
[中图分类号]TQ[文献标识码]A[文章编号]1007-1865(2021)07-0028-03
Study on the In Vitro Anti-aging Activity of Soybean Extracts
Hu Lu,Wei Ruijing,Nie Yanfeng,Wang Lihua,Chen Jie,Zhang Qiaoling,Guo Chaowan*
(Guangdong Marubi Biotechnology Co.,Ltd.,Guangzhou510000,China)
Abstract:In this study,soybean was extracted by ultrasonic assisted extraction.The in vitro anti-aging activity of the soybean extracts was tested by ABTS+ꞏscavenging ability test,DPPHꞏscavenging ability test,collagen protea inhibition test,elasta inhibition test and advanced glycation end products(AGEs) scavenging ability test.The results suggested that the soybean extracts displayed significant antioxidant and anti-glycation activities in vitro:the IC50for ABTS +ꞏscavenging was11.16mg/mL,the IC50for DPPHꞏscavenging was11.77mg/mL,and the IC50of AGEs scavenging was3.21mg/mL;The extracts also showed great inhibitory activity against various proteas related to skin aging:the IC50of collagena inhibition was12.91mg/mL,and50mg/mL of soybean extracts had similar inhibitory effects on elasta as the positive control(Civeilex sodium,50μmol/L).The results indicated that the soybean extracts have good anti-aging activity in vitro.
Keywords:Soybean extracts；Anti-aging；Free radical；AGEs；Collagena；Elasta
1研究背景
毛豆又名菜用大豆，因其荚上有细毛，人们俗称为“毛豆”。菜用大豆籽粒中含有丰富的氨基酸，仅就游离氨基酸来说，未成熟的菜用大豆比粒用大豆含有更多的必需氨基酸[1-2]。毛豆因其味道鲜美，蛋白质含量高，同时含有多种维生素和膳食纤维等营养物质，颇受人们的喜爱。而人们对毛豆的研究多数在于食品领域，对于毛豆在化妆品领域中的研究和应用报道较少。
本研究立足于绿色、天然、安全的开发角度，以食用毛豆为研究对象，通过超声波辅助水提取法对其进行提取，并采取多种体外功效测试方法，评估其体外抗衰老的功效活性，为探索其在化妆品领域中的广泛应用提供参考；基于食材来源的活性成分开发的护肤品，不仅能够满足消费者对化妆品功效性和安全性的双重要求，而且符合现代化妆品行业绿色环保、天然安全的发展趋势，具有广阔的市场前景。
2材料和方法
2.1材料与试剂
原料：新鲜毛豆，购于京东商城绿鲜知自营旗舰店；
试剂：[2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]二铵盐(ABTS)、N-(甲氧基琥珀酰基)-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-缬氨酸4-硝基苯胺(MAAPVN)，购于Sigma公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、I
型胶原蛋白酶、维生素C(含量≥99%)，购于广州市齐云生物科技有限公司；N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰基]-亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-丙氨酸(FALGPA)，购于上海源叶生物科技有限公司；弹性蛋白酶，购于上海瑞永生物科技有限公司；Tris-HCl缓冲液、牛血清白蛋白，购于上海伯奥生物科技有限公司；没食子酸儿茶素没食子酸酯、盐酸氨基胍，购于上海阿拉丁公司；西维来司钠，购于MCE公司；乙醇、过硫酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、甘氨酸、氯化钠、氯化钙、氢氧化钠、二甲基亚砜，均为分析纯试剂，均购于广州化学试剂厂。
2.3试验方法
2.3.1原料预处理
将新鲜毛豆去皮后，冻干、粉碎，过60目筛网，收集毛豆粉末，于密封、干燥条件下保存备用。
2.3.2毛豆提取物的制备
精确称取10g毛豆粉末，与20%体积分数的乙醇以1︰50的料液比混合，置于超声波细胞粉碎机中，在
大学周记
超声功率为400W，温度为30℃，超声开2s、关1s的条件下，超声处理20min；然后转移至60℃水浴锅中，静置保温提取120min，于4℃、12000 r/min条件下离心20min，取上清液用滤纸过滤，得到毛豆粗提液。
将毛豆粗提液用100kD的膜包进行超滤，去除大分子蛋白，收集透过液，于50℃条件下减压浓缩至原体积的1/5~1/6，冷冻干燥，得到毛豆提取物冻干粉。
2.3.3毛豆提取物对ABTS+ꞏ清除能力测定
参照Re R等[3]和孙连立等[4]报道的方法，精确称取0.0386g ABTS，用2.45mmol/L的过硫酸钾定容至10mL，避光保存12~16 h后使用，作为ABTS储备液。用10mmol/L的PBS(pH=7.4)缓冲液将ABTS储备液稀释40~60倍(稀释后，充分摇匀ABTS储备液)，使其在734nm处吸光值为0.7~0.8之间，得到ABTS工作液。将毛豆提取物冻干粉用去离子水配制成一定浓度的样品待测液，分别吸取190μL ABTS工作液和10μL样品加入96孔板，充分摇匀后，室温孵育6min，用酶标仪测定734nm的吸光度。以100μg/mL的VC为阳性对照，每组样品测3个复孔，ABTS+ꞏ清除率按照下式计算：
100
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-
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=）
（
）
清除率（
A
A
A
式中：A0为以PBS代替样品测定的吸光度；A1为样品组测定的吸光度；A2为以PBS代替ABTS工作液测定的吸光度。
2.3.4毛豆提取物对DPPHꞏ清除能力测定
参照Lu Y R等[5]和Stéphanie D等[6]报道的方法，精确称取0.0079g DPPH，用无水乙醇定容至100mL，配制成0.2mmol/L DPPH溶液，得到DPPH工作液；将毛豆提取物冻干粉用去离子水配制成一定浓度的样品待测液，分别吸取100μL DPPH工作液和100μL样品加入96孔板，充分摇匀后，室温避光反应30min，用酶标仪测定517nm的吸光度。以12.5μg/mL的VC为阳性对照，每组样品测3个复孔，DPPHꞏ清除率按照下式计算：
[作者简介]胡露(1991-)，女，湖北咸宁人，硕士研究生，主要研究方向为天然产物的研究与应用。*为通讯作者。
2021年第7期广东化工第48卷总第441期
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2
1⨯-=）（）清除率（A A A 式中：A 0为以无水乙醇代替样品测定的吸光度；A 1为样品组测定的吸光度；A 2为以无水乙醇代替DPPH 工作液测定的吸光度。2.3.5毛豆提取物对晚期糖基化终产物(AGEs)清除能力测定
根据刘慧琳等[7]和程树军[8]报道的方法，用0.05mol/L 的PBS 磷酸盐缓冲液(pH=7.4)配制10mg/mL 牛血清白蛋白溶液。将毛豆提取物冻干粉用去离子水配制成一定浓度的样品待测液，然后吸取上述不同浓度供试品溶液各1mL ，分别加入2mL 牛血清白蛋白溶液和2mL 的45mg/mL 葡萄糖溶液，震荡均匀，放置于60℃恒温恒湿培养箱中孵育40h 后，用酶标仪对其进行检测，荧光激发/发射波长为370/440nm ，记录荧光吸收值。以0.25mmol/L 盐酸氨基胍为阳性对照，每组样品测3个复孔，AGEs 清除率按照下式计算：
100
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01
0⨯--=A A B B （）清除率（式中：A 0为没有添加待测样、添加葡萄糖溶液的吸光度；A 1
为没有添加待测样、没有添加葡萄糖溶液的吸光度；B 0为添加待测样、添加葡萄糖溶液的吸光度；B 1为添加待测样、没有添加葡萄糖溶液的吸光度。listed
2.3.6毛豆提取物对胶原蛋白酶抑制能力测定
excel列求和参照Judith W 等[9]和程树军[8]报道的方法，配制含有0.4mol/L NaCl 和0.01mol/L CaCl 2的0.05mol/L 甘氨酸缓冲液，用该缓冲液配制1.1U/mL 的I 型胶原蛋白酶溶液和1mmol/L 的N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰基]-亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-丙氨酸(FALGPA)。将毛豆提取物冻干粉用去离子水配制成一定浓度的样品待测液，然后将50μL 样品、20μL I 型胶原蛋白酶溶液和60μL 甘氨酸缓冲液混合，在37℃温育20mim ，再加入50μL FALGPA 溶液，充分摇匀后，在37℃反应30min ，用酶标仪测定335nm 的吸光度。以1.2mg/mL 没食子酸儿茶素没食子酸酯为阳性对照，胶原蛋白酶抑制率按照下式计算：
100
)-1%1
01
0⨯--=A A B B （）抑制率（式中：A 0为没有添加待测样、添加底物的吸光度；A 1为没有添加待测样、没有添加底物的吸光度；B 0为添加待测样、添加底物的吸光度；B 1为添加待测样、没有添加底
物的吸光度。2.3.7毛豆提取物对弹性蛋白酶抑制能力测定
参照Judith W 等[9]和程树军[8]报道的方法，用二甲基亚砜配制5mmol/L N-(甲氧基琥珀酰基)-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-缬氨酸4-硝基苯胺(MAAPVN)溶液，用去离子水配制0.9U/mL 弹性蛋白酶溶液。将毛豆提取物冻干粉用去离子水配制成一定浓度的样品待测液，然后将100μL 0.05mol/L 的Tris-HCl 缓冲液、50μL 弹性蛋白酶和50μL 待测液混合，在25℃温育20min 后，添加50μL MAAPVN 溶液，充分摇匀，在25℃反应60min 后，用酶标仪测定410nm 的吸光度。以50μmol/L 西维来司钠为阳性对照，弹性蛋白酶抑制率按照下式计算：
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湖北二本大学
B B （）抑制率（式中：A 0为没有添加待测样、添加底物的吸光度；A 1为没有添加待测样、没有添加底物的吸光度；B 0为添加待测样、添加底物的吸光度；B 1为添加待测样、没有添加底物的吸光度。
3结果与分析
3.1不同浓度毛豆提取物对ABTS+ꞏ的清除能力
图1不同浓度毛豆提取物对ABTS+ꞏ的清除能力
Fig.1Scavenging ability of different concentrations of soybean
extracts on ABTS+radical为人师表老陈醋
按照方法2.3.3考察了2mg/mL 、4mg/mL 、8mg/mL 、16mg/mL 、32mg/mL 的毛豆提取物对ABTS+ꞏ
的清除能力，测试结果如图1所示。
由图1结果可以看出，随着浓度的升高，毛豆提取物对ABTS+ꞏ的抑制率呈逐渐上升趋势，经拟合回归方程，计算其IC 50值为11.16mg/mL 。当毛豆提取物浓度达32mg/mL 时，其对ABTS+ꞏ的抑制率达97.32%，明显高于阳性对照100μg/mL 的VC 对ABTS+ꞏ的抑制率78.24%。从以上实验数据说明，毛豆提取物对ABTS+ꞏ具有较好的清除能力。
3.2不同浓度毛豆提取物对DPPHꞏ的清除能力
按照方法2.3.4考察了2mg/mL 、4mg/mL 、8mg/mL 、16mg/mL 、32mg/mL 的毛豆提取物对DPPHꞏ的清除能力，测试结果如图2所示。
图2不同浓度毛豆提取物对DPPHꞏ的清除能力
Fig.2Scavenging ability of different concentrations of soybean
extracts on DPPH radical 由图2结果可以看出，随着浓度的升高，毛豆提取物对DPPHꞏ的抑制率呈逐渐上升趋势，经拟合回归方程，计算其IC 50值为11.77mg/mL 。当毛豆提取物浓度达32mg/mL 时，其对DPPHꞏ的抑制率达66.58%，略低于阳性对照12.5μg/mL 的VC 对ABTS+ꞏ的抑制率80.26%。从以上实验数据说明，毛豆提取物具有一定的DPPHꞏ清除能力。
3.3不同浓度毛豆提取物对晚期糖基化终产物(AGEs)的清除能力
按照方法2.3.5考察了0.3125mg/mL 、0.625mg/mL 、1.25mg/mL 、2.5mg/mL 、5mg/mL 、10mg/mL 、20mg/mL 的毛豆提取物对AGEs 的清除能力，测试结果如图3
所示。
图3不同浓度毛豆提取物对晚期糖基化终产物(AGEs)的清除能力
Fig.3Scavenging ability of different concentrations of soybean
extracts on AGEs 由图3结果可以看出，随着浓度的升高，毛豆提取物对AGEs 的清除率呈逐渐上升趋势；但当浓度超过5mg/mL 后，其对AGEs 清除率的增速减慢，经拟合回归方程，计算其IC 50值为3.21mg/mL 。当毛豆提取物浓度达20mg/mL 时，其对AGEs 的清除率达84.55%，略低于阳性对照0.25mmol/L 盐酸氨基胍对AGEs 的清除率104.07%。从以上实验数据说明，毛豆提取物具有较好的AGEs 清除能力，具有较好的抗糖化效果。
3.4不同浓度毛豆提取物对胶原蛋白酶的抑制能力
按照方法2.3.6考察了1.25mg/mL 、2.5mg/mL 、5mg/mL 、10mg/mL 、20mg/mL 的毛豆提取物对胶原蛋白酶的抑制能力，测试结果如图4所示。
广东化工2021年第7期ꞏ30ꞏ第48卷总第441期
图4不同浓度毛豆提取物对胶原蛋白酶的抑制能力
Fig.4Inhibition of different concentrations of soybean extract on
collagena
由图4结果可以看出，随着浓度的升高，毛豆提取物对胶原蛋白酶的抑制率呈逐渐上升趋势，经拟合回归方程，计算其IC50值为12.91mg/mL。当毛豆提取物浓度达20mg/mL时，其对胶原蛋白酶的抑制率达80.64%，略高于阳性对照1.2mg/mL的没食子酸儿茶素没食子酸酯对胶原蛋白酶的抑制率73.99%。从以上实验数据说明，毛豆提取物对胶原蛋白酶具有较好的抑制能力。
3.5不同浓度毛豆提取物对弹性蛋白酶抑制能力
按照方法2.3.7考察了10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40 mg/mL、50mg/mL的毛豆提取物对弹性蛋白酶的抑制能力，测试结果如图5所示。
图5不同浓度毛豆提取物对弹性蛋白酶的抑制能力
Fig.5Inhibition of different concentrations of
soybean extracts on elasta
由图5结果可以看出，当毛豆提取物浓度小于40mg/mL时，对弹性蛋白酶的抑制效果随浓度增加不明显；当毛豆提取物浓度大于40mg/mL时，对弹性蛋白酶的抑制效果有明显提升；当毛豆提取物浓度达50mg/mL时，其对弹性蛋白酶的抑制率为65.15%，略低于阳性对照50μmol/L西维来司钠对弹性蛋白酶的抑制率86.30%。从以上实验数据说明，毛豆提取物对弹性蛋白酶具有一定的抑制能力。
4结论
本研究以食用毛豆为研究对象，通过超声波辅助提取法对其进行提取，对其除杂、浓缩后，冷冻干燥得毛豆提取物冻干粉，并重点考察了毛豆提取物的体外抗氧化和抗糖化活性，以及对皮肤衰老相关的多种蛋白酶抑制活性，结果表明，本研究所制备的毛豆提取物具有较好的体外抗衰老功效。
近年来，消费者对绿色、天然、安全的化妆品的青睐程度日趋增加，许多天然食品含有多种丰富优质的营养，将这些天然优质食材的营养成分进行提取后应用到化妆品中，为化妆品的开发提供了新的思路。国内外化妆品生产企业纷纷将目光投向这一研究领域，其中，广东丸美生物技术股份公司的春纪品牌首次提出“食材养肤”理念[10]，并以杨梅、黑白大米、葡萄、咖啡、辣木籽、参茸等食材为原料开发出了多款“食材养肤”特点的护肤化妆产品，得到了市场的广泛认可。毛豆作为一种常见食材，对于其化妆品护肤功效的应用研究较少，本研究结果有望为毛豆在抗衰老护肤领域的应用以及毛豆资源的
深入开发提供有力参考。
参考文献
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[8]程树军．化妆品评价替代方法标准实施指南[M]．北京：中国质检出版社，中国标准出版社．2017：314-319．
[9]Judith W，Sonja M，Daniela S，et al．Inhibitory effects of polyphenols from grape pomace extract on collagena and elasta activity[J]．Fitoterapia，2005，101：179-187．
[10]春纪．食材更养肤[M]．广州：广东科技出版社，2012．
(本文文献格式：胡露，魏瑞敬，聂艳峰，等．毛豆提取物的体外
抗衰老活性研究[J]．广东化工，2021，48(7)：28-30)
