鲤浮肿病毒荧光RAA快速检测方法的建立
郑晓聪; 陈雨; 温智清; 叶文涛; 张建勋; 黄倩君; 梁晓清; 刘荭
【期刊名称】《《中国预防兽医学报》》
水煮鱼乡【年(卷),期】2019(041)007
【总页数】5页(P721-725)
【关键词】重组酶介导链替换核酸扩增技术; 鲤浮肿病毒; 现场检测; 快速检测
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【作 者】郑晓聪; 陈雨; 温智清; 叶文涛; 张建勋; 黄倩君; 梁晓清; 刘荭颗字组词
【作者单位】深圳海关食品检验检疫技术中心 广东深圳518045; 南京农业大学 江苏南京210095; 大连海洋大学 辽宁大连116023; 杭州众测生物科技有限公司 浙江杭州310052
【正文语种】中 文
【中图分类】S852.65捉迷藏怎么写
鲤浮肿病毒(Carp edema virus，CEV)是鲤浮肿病(Carp edema virus dia，CEVD)的病原[1]，常致使鲤或锦鲤出现昏睡、浮肿、烂鳃、凹眼等临床症状，引起较高的死亡率[2]。CEV是DNA病毒，大小200 nm，具囊膜，属于痘病毒科(Poxviridae)[3]。CEV呈全球性流行，现已在我国河北、河南、辽宁、北京、浙江、云南等多个省市检出CEV[4-7]。
鲤是我国主要的淡水养殖品种之一，锦鲤为鲤的变种，是重要的观赏鱼养殖品种，开展鲤浮肿病防控技术研究对该鱼养殖业具有重要的意义。建立灵敏、高效的病原检测技术是目前水生动物疫病防控的有效手段之一。目前，CEV的检测方法有组织电镜、套式PCR和荧光定量PCR方法[1,8-9]，其中英国环境渔业水产养殖研究中心(CEFAS)建立的荧光定量PCR方法适用于我国CEV的监测[1,10]。重组酶介导的链替换扩增(Recombina-aid amplification，RAA)技术是一种恒温快速扩增核酸的方法。利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶代替了传统PCR的热循环解链过程，实现了在37℃～42℃恒温下的核酸快速扩增，其中荧光RAA技术可以实现20 min内实时观察检测结果，具备简单、节能、便携、快速等特点[11-12]，特别适合基层实验室使用以及用于现场检测。鉴于现有的检测方法对实验设备依赖性，为此，本研究应用了一种新型的恒温核酸扩增技术--RAA用于CEV检测，为CEV的现场快速检测提供新的技术手段。
1 材料与方法
1.1 病毒株与临床样品 CEV、锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus，KHV)、鲤疱疹病毒 2型(Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2)、传染性脾肾坏死病毒(Infection spleen and kidney necrosis virus，ISKNV)、流行性造血器官坏死病毒(Epizootic haematopoietic necrosis virus，EHNV)、鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus，SVCV)、传染性鲑鱼贫血病毒(Infectious salmon anaemia virus，ISAV)、病毒性出血性败血症病毒(Viral hemorrhagic pticemia virus，VHSV)、传染性造血器官坏死病病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV)、传染性胰腺坏死病病毒(Infectious pancreatic necrosis virus， IPNV)、 草 鱼 出 血病病毒(Grass carp hemorrhage virus，GCHV)等鱼类病毒均由深圳海关食品检验检疫技术中心水生动物实验室保存。35份鲤科鱼类临床样品为各省市送检样品。
1.2 主要试剂与仪器 RAA核酸扩增试剂(荧光型)购自杭州众测生物科技有限公司；TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit、 PCR kit、Real time PCR Kit、pMD18-T载体、DH5α感受态细胞均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；QIAamp DNA Mini QIAcube Kit
购自QIAGEN公司；核酸自动提取仪(QIAcube)购自QIAGEN公司；恒温荧光信号收集装置T16-ISO购自英国Twista公司。
1.3 引物设计与筛选 根据GenBank登录的CEV基因序列(MG550022.1、KX253997.1、KX254006.1、KX254012.1、KX254027.1、KX254003.1、KX254013.1、KX254020.1)进行比对分析，设计3组引物和探针(表1)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将3组引物按照荧光RAA反应体系对提取的CEV基因组进行扩增，筛选反应速度快、荧光信号强的引物组进行后续试验。
表1 RAA的引物和探针Table 1 Primers and probes for CEV fluorescence RAA assay组别Groups 1组Group 1引物名称Primer name CEV RPA F1 CEV RPA R1 CEV RPA P1 2组Group 2 CEV RPA F2 CEV RPA R2 CEV RPA P2 3组Group 3 CEV RPA F3 CEV RPA R3 CEV RPA P3序列(5'-3')Primer quences(5'-3')TATTGTAGCATTTCCTAGTTTGTATGGC AAATTGCAAATGTTATGTTCTGGAAAGG ACTCTCTTTACTGYAACTCCTTGAGGAA[FAM-dT][THF][BHQ-dT]GATCTAGAATTCCAC(C3 Spacer)TTTCCATTRGCATAAAATCCTTCCCA TAAAGAG
AGTTTGTTTCTTGCCATACAA ATTTGRGTTGAAACATGTTTTAGMGTTT[FAM-dT]G[THF]A[BHQ-dT]ATTGTAGCATTTCCT(C3 Spacer)TTCCATTAGCATAAAATCCTTCCCAAAT GGAATCCAGATTGATGATTGGAATAAGA ATTTCCTAGTTTGTATGGCAAGAAACAAAC[FAM-dT]C[THF]C[BHQ-dT]TTACTGYAACTCCTT(C3 Spacer)
1.4 重组质粒标准品的构建与鉴定 根据CEV P4a基因序列(MG550022.1)设计一对引物(CEVcF：TTG TAGTTGTTTAATATTTGTG/CEVcR：TTCCAGAGC AAGTTAAAATTGC)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以提取的CEV基因组DNA为模板，使用该引物进行PCR扩增，将扩增的基因片段纯化后连接pMD18-T载体，构建重组质粒pMD18-CEVP4a，重组质粒经测序鉴定正确后，测定浓度并计算拷贝数，作为荧光RAA的质粒标准品。阅读小报怎么做
1.5 RAA反应条件的优化 采用筛选的引物探针，将其浓度分别配制为 5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L按照RAA(荧光型)试剂盒说明书配制50 μL反应体系，置于T16-ISO仪器
中反应进行引物探针浓度筛选。确定引物探针浓度后，选取浓度2.8×103拷贝/μL和2.8×101拷贝/μL的质粒标准品为模板，在不同温度(37℃、39℃、42℃)条件下反应20 min，收集FAM荧光。以确定最佳反应条件。
1.6 特异性试验 按照核酸提取试剂盒说明提取CEV、 KHV、 CyHV-2、 ISKNV、 EHNV、 SVCV、ISAV、VHSV、IHNV、IPNV、GCHV等鱼类病毒核酸，其中提取的SVCV、ISAV、VHSV、IHNV、IPNV、GCHV的RNA反转录为cDNA，以建立的CEV荧光RAA方法进行扩增，以CEV病毒核酸作为阳性对照，评估该方法的特异性。
1.7 敏感性性试验 将构建的质粒标准品10倍倍比稀释(2.8×106拷贝 /μL～2.8×100拷贝 /μL)后，分别作为模板，以建立的CEV荧光RAA方法进行扩增，设ddH2O为阴性对照，确定该方法的敏感性。
1.8 重复性试验 选取 2.8×106拷贝 /μL、2.8×104拷贝 /μL、2.8×102拷贝 /μL 3 个浓度的质粒标准品进行重复性试验，每个浓度重复5次，根据起峰时间计算组内变异系数；同时，将上述试验每3 d检测一次，连续检测3次，根据起峰时间计算组间变异系数，以评价该方法的重复性和稳定性。
1.9 临床样品的检测 使用35份临床鲤科鱼类样品对建立的方法进行测试，每份样品包含每尾鱼的脑、脾、肾、腮等病料，根据徐立蒲[5]报道的方法处理各病料样品。使用试剂盒提取样品核酸，应用本研究建立的CEV荧光RAA方法进行检测，同时应用荧光定量PCR方法[1]进行检测，比较二者的检测结果，并计算二者的符合率。
2 结果
2.1 引物的筛选 用设计的3组引物和探针，分别对CEV基因组核酸进行扩增，结果显示第1组引物探针在扩增4 min时开始检测到荧光信号，并且荧光信号较强，扩增效果最好(图1)，因此选择第一组引物探针用于后续实验。
图1 3组引物的扩增效果比较Fig.1 The fluorescence RAA results of the 3 primer ts
魅族系统2.2 反应条件的优化结果 通过荧光信号和扩增曲线起峰时间来选择最优引物探针浓度，当引物和探针浓度均为10 μmol/L时，荧光信号最强，扩增曲线出现得最早，将其确定为最佳工作浓度。对反应温度进行优化，结果显示，以不同浓度的质粒标准品为模板时均显示反应温度为37℃时，最终达到的荧光信号值较强，但是起峰时间较晚，反应温度为42℃时，喜欢英语怎么说
起峰较快，但是荧光信号值较低。反应温度为39℃时，反应相对迅速，信号值强，因此选择39℃作为后续实验的反应条件。
最终确定反应体系与条件为：浓度为10 μmol/L的引物CEVRPAF1和CEVRPAR1各2μL，10μmol/L的探针 CEV RPA P1 0.6 μL，模板 1 μL，A Buffer 40.9 μL，ddH2O 1 μL。将上述 47.5 μL 溶液混合均匀后加入到装有冻干酶制剂的反应管中，上下翻转混匀，最后加入2.5 μL B buffer(280 mmol/L醋酸镁)后立即置于T16-ISO仪器中39℃反应20 min。遨游大海
2.3 特异性试验结果 提取几种常见鱼类病毒的核酸作为模板，应用建立的荧光RAA方法进行扩增，结果显示除CEV外，其它病毒核酸均无扩增(图2)，表明该方法特异性较强。
