网络出版时间：２０２２－１２－０９１５：４０：０８ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／／３４．１０８６．Ｒ．２０２２１２０９．１４２７．００９．ｈｔｍｌ
ＦｏｘＯ１／ｐ３８ＭＡＰＫ信号通路在ＬＰＳ致急性肺损伤中的作用研究
杨亚丽１，２，３，田 荣１，袁 茵１，王艳佳１，杨晓玲１
，２，３
（１．宁夏医科大学基础医学院；２．国家卫生健康委员会代谢性心血管疾病研究重点实验室；
３．宁夏血管损伤与修复研究重点实验室，宁夏银川 ７５０００４）
收稿日期：２０２２－０８－２３，修回日期：２０２２－１１－２６
基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ８１９６００６３）；宁夏科技创
新领才项目（
ＮｏＫＪＴ２０１６００９）；宁夏自然科学基金资助项目（
Ｎｏ２０２１ＡＡＣ０２０１２）；宁夏回族自治区一般项目（Ｎｏ２０２１ＢＥＡ０３０９１）
作者简介：杨亚丽（１９９３－），女，硕士生，研究方向：心血管病理生
理，
Ｅ ｍａｉｌ：７３５４５０９６１＠ｑｑ．ｃｏｍ；杨晓玲（１９７４－），女，博士，教授，博士生导师，研究方向：心血管病理生理，通信作者，
Ｅ ｍａｉｌ：ｙａｎｇｗｊ０４＠１２６．ｃｏｍｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２１０９０７３
文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２３）０１－００３６－０７中国图书分类号：Ｒ ３３２；Ｒ３２２ ３５；Ｒ３４５ ５７；Ｒ３９４ ２；Ｒ５６３ ８；Ｒ９７７ ３
摘要：目的 探讨叉头状转录因子Ｏ１（ｆｏｒｋｈｅａｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｏｆＯｃｌａｓｓ１，ＦｏｘＯ１）在脂多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＬＰＳ）致急性肺损伤（ａｃｕｔｅｌｕｎｇｉｎｊｕｒｙ，ＡＬＩ）中的作用及其调控机制。方法 采用ＬＰＳ模拟诱导ＡＬＩ模型。ＨＥ染色法观察肺组织的病理变化；
ＥＬＩＳＡ法检测肺组织中肿瘤坏死因子α（ＴＮＦ α
）和白细胞介素６（ＩＬ ６）的含量；免疫组化染色观察ＦｏｘＯ１在小鼠肺组织的表达；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＦｏｘＯ１、ＤＮＡ甲基转移酶和ｐ３８ＭＡＰＫ的磷酸化水平；ｑＲＴ ＰＣＲ检测ＦｏｘＯ１、ＩＬ ６、ＴＮＦ α和ＤＮＡ甲基转移酶的ｍＲＮＡ水平；巢式甲基化特异性Ｐ
ＣＲ（ｎＭＳ ＰＣＲ）检测肺组织中ＦｏｘＯ１启动子区ＤＮＡ甲基化的水平变化；培养肺血管内皮细胞（ｐｕｌｍｏｎａｒｙｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ，ＰＶＥＣｓ）并转染ＦｏｘＯ１ｓｉＲＮＡ，Ｗｅｓｔ ｅｒｎｂｌｏｔ检测ｐ３８ＭＡＰＫ的磷酸化水平；采用Ｐｅａｒｓｏｎ方法分析ＦｏｘＯ１甲基化水平与炎症因子的相关性。结果 与Ｃｏｎ ｔｒｏｌ组相比，ＬＰＳ组小鼠肺泡炎性细胞明显增多，肺组织水肿、充血明显；ＴＮＦ α和ＩＬ ６的水平分别升高５２ ２％和１５０ ４％（Ｐ＜０ ０５）；ｐ３８ＭＡＰＫ磷酸化水平及ＦｏｘＯ１表达分别增加１
３４ １％和６１ ８％（Ｐ＜０ ０５），而ＦｏｘＯ１启动子区ＤＮＡ甲基化水平降低１７ ２％（Ｐ＜０ ０５），体外转染ＦｏｘＯ１ｓｉＲＮＡ后，ｐ３８磷酸化水平降低，Ｐｅａｒｓｏｎ分析显示，ＦｏｘＯ１甲基化水平与炎症因子成负相关。结论 ＦｏｘＯ１启动子区低甲基化调控ＦｏｘＯ１／ｐ３８ＭＡＰＫ信号通路是ＬＰＳ诱导急性肺损伤的重要机制。
关键词：ＦｏｘＯ１；ＬＰＳ；急性肺损伤；ＤＮＡ甲基化；ｐ３８ＭＡＰＫ信号通路；肺血管内皮细胞
开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：
急性肺损伤（ａｃｕｔｅｌｕｎｇｉｎｊｕｒｙ，ＡＬＩ）是呼吸系统一种严重的疾病，其死亡率高，发病率约为３０％
～４０％［１］
。越来越多的证据表明，过度炎症反应在ＡＬＩ的发病中起关键作用［２－３］。作为革兰阴性细菌
细胞壁主要成分的脂多糖（
ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＬＰＳ），体内外实验均表明，ＬＰＳ诱导ＡＬＩ是一种被
广泛接受的细菌性脓毒症动物模型［
初一文言文４］
。ＦｏｘＯ１作为Ｆｏｘ转录家族的主要成员之一，可以调节多种基因的表达，参与细胞分化、氧化应激、炎症反应、脂代谢
等病理过程，并参与ＡＬＩ疾病发生［５－６］
。丝裂原活
化蛋白激酶（ｍｉｔｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓ，ＭＡＰＫｓ）信号通路是细胞内调控炎症产生的主要信
号转导通路，与ＬＰＳ诱发的ＡＬＩ有密切关系［７］，ｐ３８
ＭＡＰＫ通过磷酸化被激活后，调控下游转录因子，促进ＩＬ １、ＴＮＦ α等细胞因子的分泌，
服务感想简短一点诱导一系列炎症反应［７］。因此，本研究通过ＬＰＳ复制ＡＬＩ体内外模
型，探讨ＦｏｘＯ１ＤＮＡ甲基化及ＦｏｘＯ１／ｐ３８ＭＡＰＫ信号通路在ＡＬＩ中的作用及意义。１ 材料与方法１．１ 材料
１．１．１ 实验动物 ２０只ＳＰＦ级ＣＢＳ＋／＋♂小鼠饲
养于宁夏医科大学实验动物中心标准屏障环境内，通风良好，期间自由活动和饮食，饲养８周后，体质量约２５ｇ，实验动物合格证号：ＳＣＸＫ（京）２０１６ ０００６，根据实验安排和需要，对小
鼠进行处理。１．１．２ 主要试剂 ＬＰＳ购自美国Ｓｉｇｍａ公司；小鼠肿瘤坏死因子 α（ＴＮＦ α）、白介素 ６（ＩＬ ６）ＥＬＩＳＡ检测试剂盒购自武汉江莱生物科技股份有限公司；ＲＩ ＰＡ裂解液检测试剂盒购自碧云天生物技术公司；苏木精－伊红（ＨＥ）染色液购自武汉塞维尔生物科技有限公司；蛋白提取试剂盒、蛋白定量试剂盒均为南京凯基，ＤＮＡ、ＲＮＡ提取试剂盒均为天根公司产品，逆转录试剂盒和荧光定量ＰＣＲ试剂盒为北京ＴａＫａ Ｒａ公司；甲基化检测试剂盒为美国ＺＹＭＯＲＥ ＳＥＡＲＣＨ公司；ＦｏｘＯ１单克隆抗体购自Ａｂｍａｒｔ；ＤＡＢ显色液、山羊抗兔ＩｇＧ ＨＲＰ购自中杉金桥；引物由上海生工生物股份有限公司设计并合成。
·６
３·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２３Ｊａｎ；３９（１）：３６～４２
职工小家建设方案１．１．３ 仪器 超净工作台（苏州，安泰）；ＣＯ
２
培养
箱（德国，Ｈｅｒａｅｕｓ）；５４１５Ｄ型微量台式离心机（德国，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）；ＢＳ
１１０Ｓ型精密天平（德国，Ｓａｒｔｏｒｉ ｕｓ）；荧光定量ＰＣＲ仪（美国，Ｂｉｏ Ｒａｄ）；垂直电泳仪、凝胶成像仪和Ｍｏｄ ｅｌ６８０全自动酶标仪（美国，Ｂｉｏ Ｒａｄ），酶标仪（美国Ｂｉｏ ＴＥＫ），普通ＰＣＲ仪和ｑＲＴ ＰＣＲ仪（德国，耶拿）。
１．２ 方法
１．２．１ 动物分组 选取２０只８周龄２５ｇ左右的ＳＰＦ级ＣＢＳ＋／＋小鼠，随机分为ＬＰＳ组和Ｃｏｎｔｒｏｌ组，每组１０只，饲喂普通饮食，参考文献说明［８］，术前将ＬＰＳ溶解于无菌生理盐水中，小鼠禁食１２ｈ后，ＬＰＳ组根据５ｍｇ·ｋｇ－１的剂量给予ＬＰＳ腹腔注射，Ｃｏｎ ｔｒｏｌ组给予等量的生理盐水腹腔注射。造模成功６ｈ后麻醉处理动物获取肺组织。本研究严格按照《实验动物管理条例》进行实验。
１．２．２ 细胞培养 ＰＶＥＣ使用含１０％胎牛血清及１％的青链霉素的ＤＭＥＭ培养液，置于３７℃、５％
ＣＯ
２
的恒温培养箱中常规培养，隔日换液，根据细胞生长状态，传至２～３代可用于后续实验。１．２．
３ 细胞分组及转染 实验组：ＰＶＥＣ转染ｓｉ ＦｏｘＯ１组；阴性对照组（ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ，ｓｉ ＮＣ）：转染对基因无影响的空载ＲＮＡ；空白对照组（ｃｏｎ ｔｒｏｌ）：加入等体积的完全培养基组。将处于指数生长期的细胞消化后细胞计数，等量接种于６孔板，待细胞生长到肉眼观６０％～７０％密度时进行转染。依据Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００Ｒｅａｇｅｎｔ和ｓｉ ＦｏｘＯ１的说明书对各组细胞进行细胞转染实验，培养６ｈ后，换正常的培养基，４８ｈ后进行后续实验。
１．２．４ ＨＥ染色 处死小鼠后，取左肺上叶组织置于４％的多聚甲醛固定２４ｈ，进行常规脱水、石蜡包埋、切片，按标准操作进行ＨＥ染色，光学显微镜下观察肺组织的病理学变化。
１．２．５ 免疫组化染色 使用上述的方法制备的石蜡切片，经常规脱蜡水化，于０ ０１ｍｏｌ·Ｌ－１柠檬酸盐溶液高温加热进行抗原修复２ｍｉｎ后，每张切片滴入０ ３％过氧化氢以阻断内源性过氧化物酶的活性。经置室温冷却后，滴入１０％山羊血清３７℃封闭３０ｍｉｎ，以减少非特异性染色。滴加抗ＦｏｘＯ１（１∶２００）单克隆抗体在湿盒中４℃孵育过夜，次日滴加生物素标记的二抗，室温孵育１ｈ，加入ＤＡＢ显色，再使用苏木精染色液对切片进行复染，常规脱水中性树脂封片，置于显微镜下观察并拍照。１．２．６ 肺组织炎症因子的检测 各组小鼠处死后迅速取肺组织，称取约５０ｍｇ加入４５０μＬＰＢＳ，匀浆器充分研磨组织直至完全裂解，１２０００×ｇ离心１０ｍｉｎ，取上清，按照ＥＬＩＳＡ说明书，检测肺组织中ＩＬ ６和ＴＮＦ α的含量。
１．２．７ Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＦｏｘＯ１、ＤＮＡ甲基转移酶和ｐ３８ＭＡＰＫ的蛋白表达 称取Ｃｏｎｔｒｏｌ组及ＬＰＳ组肺组织各０ ６ｇ，用预冷的ＰＢＳ冲洗组织２次，加入细胞裂解液，使用匀浆机将其破碎，在４℃摇床裂解组织２ｈ，离心机４℃，１２０００×ｇ离心５ｍｉｎ，提取上清液，即得总蛋白，采用ＢＣＡ法测定各组蛋白含量，按每孔３０μｇ蛋白经煮沸８ｍｉｎ后，开始１０％ＳＤＳ ＰＡＧＥ凝胶电泳，随后将蛋白质湿转到ＰＶＤＦ膜上。用５％脱脂奶粉室温封闭２ｈ。加入一抗（１∶１０００）孵育，４℃摇床过夜，次日ＰＢＳＴ洗膜，１０ｍｉｎ，洗３次，然后使用含ＨＲＰ 二抗室温孵育２ｈ，ＰＢＳＴ洗膜３次后将ＰＶＤＦ膜放入凝胶成像仪内，膜上滴ＥＣＬ发光液，Ａ液∶Ｂ液＝１∶１，曝光，以β ａｃ ｔｉｎ为内参，ＩｍａｇｅＬａｂ图像分析软件分析各组蛋白的相对表达。
１．２．８ ｑＲＴ ＰＣＲ检测ＦｏｘＯ１和ＤＮＡ甲基转移酶的ｍＲＮＡ水平 称取各组组织约０ ６ｇ，使用匀浆机将其破碎，加１ｍＬＴＲＩｚｏｌＲＮＡ提取试剂，提取总ＲＮＡ，测定样品纯度（Ａ
２６０
／Ａ
２８０
＝１ ８０～２ ０）与浓度后将ｍＲＮＡ逆转录为ｃＤＮＡ。将得到的ｃＤＮＡ按照ＢｅｓｔａｒＳｙｂｒＧｒｅｅｎｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ１０μＬ、上游引物０ ８μＬ、下游引物０ ８μＬ、ｃＤＮＡ２μＬ、ＲＯＸ０ ４μＬ，灭菌蒸馏水６ ０μＬ，配成２０μＬ的ＰＣＲ扩增体系。在ＮＣＢＩ查询各基因的ＣＤＳ，用Ｐｒｅｍｉｅｒ６ ０软件设计引物。引物序列见Ｔａｂ１。扩增条件如下：９５℃预变性２ｍｉｎ，９５℃变性１０ｓ，５７℃退火３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，４０个循环，以ＧＡＰＤＨ作为内参，目的基因的相对表达用２－ΔΔＣＴ法分析。
Ｔａｂ１ ＰｒｉｍｅｒｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ
ＧｅｎｅＴｈｅｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′ ３′）Ｐｒｏｄｓｉｚｅ（ｂｐ）ＦｏｘＯ１Ｆ：ＧＣＣＣＣＴＧＡＣＡＣＡＡＴＧＧＴＣＣ１０７
Ｒ：ＧＴＣＴＧＧＣＣＧＧＴＧＴＡＣＴＣＴＧ
ＤＮＭＴ１Ｆ：ＧＧＧＴＣＴＴＴＧＴＧＧＣＴＧＧＧＴＣＡＡＧ１３０
Ｒ：ＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＧＣＡＧＡＧＣＣＴＴＴＧ
ＤＮＭＴ３ＡＦ：ＧＡＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＴＡＴＧＡＧＧＡＴＧＧ１０１
Ｒ：ＣＡＡＧＡＣＡＣＡＡＴＴＣＧＧＣＣＴＧＧ
ＤＮＭＴ３ＢＦ：ＣＧＴＴＡＡＴＧＧＧＡＡＣＴＴＣＡＧＴＧＡＣＣ１６９
Ｒ：ＣＴＧＣＧＴＧＴＡＡＴＴＣＡＧＡＡＧＧＣＴ
ＧＡＰＤＨＦ：ＡＧＧＴＣＧＧＴＧＴＧＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧ９５
Ｒ：ＧＧＧＧＴＣＧＴＴＧＡＴＧＧＣＡＡＣＡ
１．２．９ ｎＭＳ ＰＣＲ检测ＦｏｘＯ１启动子区ＤＮＡ甲基化水平 按ＤＮＡ提取试剂盒说明书提取各组细胞
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中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２３Ｊａｎ；３９（１）
全基因组ＤＮＡ，亚硫酸盐修饰法对全基因组ＤＮＡ进行甲基化修饰。ｎＭＳ ＰＣＲ法检测ＦｏｘＯ１启动子区ＤＮＡ甲基化程度的改变。针对ＦｏｘＯ１启动子区，在线（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｒｏｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｃｇｉ ｂｉｎ／ｍｅｔｈｐｒｉｍｅｒ／ｍｅｔｈｐｒｉｍｅｒ．ｃｇｉ）设计一对外引物及两对内引物（外引物：上游：５′ ＴＴＴＧＴＡＧＧＴＧＴＧＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＧＴＧ ３′，下游：５′ ＡＡＴＡＣＴＣＣＡＡＡＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＡＣ ３′；甲基化内引物：上游：５′ ＴＡＧＡＡＡＡＧＣＧＧＴＴＴＴＴＡＴ ＡＧＡＡＧＡＣ ３′，下游：５′ ＴＡＣＣＴＡＴＡＣＡＣＡＣＣＴＡ ＣＡＡＡＡＣＧＡＡ ３′；非甲基化内引物：上游：５′ ＴＧＧ ＴＡＧＡＡＡＡＧＴＧＧＴＴＴＴＴＡＴＡＧＡＡＧＡＴ ３′，下游：５′ ＣＣＣＴＡＣＣＴＡＴＡＣＡＣＡＣＣＴＡＣＡＡＡＡＣＡ ３′）。反应体系：ＭＩＸ１２ ５μＬ、Ｈ
２
Ｏ７μＬ、上下游引物各１μＬ、已修饰的ＤＮＡ模板３ ５μＬ，共２５μＬ。外引物扩增的反应条件为：９５℃２ｍｉｎ；９５℃２０ｓ，６０℃３０ｓ，７２℃３０ｓ，２０个循环，每个循环降０ ５℃至５０℃，７２℃２ｍｉｎ。以外引物的ＰＣＲ产物为模板，进行内外引物的扩增，反应条件同外引物。随后，取１０μＬＰＣＲ产物于２％的琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶成像分析仪成像并分析甲基化条带及甲基化条带的光密度，按如下公式进行计算：甲基化／％＝甲基化ＯＤ值／（甲基化ＯＤ值＋非甲基化ＯＤ值）×１００％。１．３ 统计学方法 采用ｐｒｉｍｅ６ ０软件进行统计学分析
整理，实验数据均为计量资料采用珋ｘ±ｓ表示，两样本均数间比较采用Ｓｔｕｄｅｎｔ′ｓｔ检验，多样本均数间比较采用Ｏｎｅ ｗａｙＡＮＯＶＡ检验。
形容思想的成语２ 结果
２．１ 肺组织的形态学变化 正常肺脏组织壁薄，无结缔组织增生、增厚；各级支气管结构完整清晰，染色较为均匀，未见明显变性坏死（Ｆｉｇ１Ａ）；ＬＰＳ组小鼠肺泡结构被破坏，肺泡壁溶解断裂，局部肺泡腔狭窄甚至消失，肺泡壁、肺泡腔或间质炎细胞大量浸润（Ｆｉｇ１Ｂ）
。恶露颜色
Ｆｉｇ１ Ｌｕｎｇｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆｍｉｃｅｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ（２００×）Ａ：ＨＥｓｔａｉｎｉｎｇｏｆｌｕｎｇｔｉｓｓｕｅｓｅｃｔｉｏｎｓ；Ｂ：ＬＰＳ（５ｍｇ·Ｌ－１）
２．２ 各组小鼠ＩＬ ６和ＴＮＦ α的表达 与Ｃｏｎｔｒｏｌ相比，ＬＰＳ组小鼠肺组织ＩＬ ６和ＴＮＦ α浓度及ｍＲ ＮＡ水平均明显升高，其中ＥＬＩＳＡ结果显示，ＩＬ ６和ＴＮＦ α浓度分别升高了３８ ９％和５２ ５％（Ｆｉｇ２Ａ，Ｐ＜０ ０５），ｑＲＴ ＰＣＲ结果显示，ＩＬ ６和ＴＮＦ α的ｍＲ ＮＡ水平分别升高了１４４ ５％和２４６ ９％（Ｆｉｇ２Ｂ，Ｐ＜０ ０１），
驴肉怎么做
且差异有统计学意义。
Ｆｉｇ２ ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｙｔｏｋｉｎｅｓＩＬ ６
ａｎｄＴＮＦ α（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
Ａ：ＩＬ ６ａｎｄＴＮＦ αｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＥＬＩＳＡ．Ｂ：ＴｈｅｍＲＮＡｌｅｖｅｌｓｏｆＩＬ ６ａｎｄＴＮＦ αｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｑＲＴ ＰＣＲ． Ｐ＜０ ０５， Ｐ＜０ ０１ｖｓＣｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．
２．３ 肺组织中ＦｏｘＯ１的表达变化 肺组织免疫组化分析显示：与Ｃｏｎｔｒｏｌ组比较，ＬＰＳ组ＦｏｘＯ１的表达高于正常肺组织的表达（Ｆｉｇ３Ａ）；ｑＲＴ ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分别检测肺组织中ＦｏｘＯ１ｍＲＮＡ及蛋白的表达水平，结果显示：与Ｃｏｎｔｒｏｌ组比较，ＬＰＳ组ＦｏｘＯ１的ｍＲＮＡ和蛋白表达分别增加了１３４ ９％和６１ ８％（Ｆｉｇ３Ｂ和Ｃ），且差异有统计学意义（Ｐ＜０ ０１）。
２．４ ＦｏｘＯ１ＤＮＡ甲基化水平改变 利用生物信息学软件分析预测ＦｏｘＯ１启动子区结构，在启动子上游－１２２６～－１３５２和－１４１４～－１７９６ｂｐ的位置存在两个ＣｐＧ岛（Ｆｉｇ４Ａ）。利用ｎＭＳＰ检测ＦｏｘＯ１启动子区的改变，结果显示，与对照组相比，ＬＰＳ组ＦｏｘＯ１启动子区甲基化水平降低了１７ ２％（Ｆｉｇ４Ｂ，Ｐ＜０ ０５）。
ＤＮＡ甲基转移酶是维持ＤＮＡ甲基化修饰的酶，主要包括ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ和ＤＮＭＴ３Ｂ，ｑＲＴ ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分别检测了ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ的表达，结果显示，ＬＰＳ组小鼠肺组织ＤＮ
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玛雅遗址３
·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２３Ｊａｎ；３９（１）
ＭＴ３Ａ和ＤＮＭＴ１的ｍＲＮＡ水平分别降低了１４９ １％和５９ ８％（Ｐ＜０ ０５，Ｐ＜０ ０１），ＤＮＭＴ３Ｂ变化差异无统计学意义（Ｐ＞０ ０５，Ｆｉｇ４Ｃ）；ＤＮＭＴ３Ａ和ＤＮＭＴ３Ｂ的蛋白水平分别降低了１４２ １％和３７ ７％（Ｐ＜０ ０５，Ｐ＜０ ０１），ＤＮＭＴ１的变化无统计学意义（Ｐ＞０ ０５，Ｆｉｇ４Ｄ），综合以上数据，说明ＦｏｘＯ１启动子区发生甲基化主要受到ＤＮＭＴ３Ａ的
调控，从而参与ＬＰＳ导致的肺损伤过程。
２．５ ＦｏｘＯ１甲基化水平与炎症的相关性分析 Ｐｅａｒｓｏｎ相关性分析结果显示，ＦｏｘＯ１甲基化水平与
小鼠肺组织ＩＬ ６及ＴＮＦ α浓度呈负相关（ｒ２
＝－０ ５２１８
，ｒ２
＝－０ ７８８２）（Ｆｉｇ５Ａ，Ｂ，Ｐ＜０ ０５，Ｐ＜０ ０１），该相关性分析表明，小鼠肺组织炎症因子的产生与ＦｏｘＯ１启动子区ＤＮＡ
甲基化水平相关。
Ｆｉｇ３ ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＦｏｘＯ１ｉｎｌｕｎｇｔｉｓｓｕｅｓｏｆｍｉｃｅ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
Ａ：ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＦｏｘＯ１ｉｎｌｕｎｇｔｉｓｓｕｅｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（４００×，ｂａｒ＝５０μｍ；ｂｒｏｗｎｉｓＦｏｘＯ１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）；Ｂ，Ｃ：ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＦｏｘＯ１ｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｑＲＴ ＰＣＲａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ． Ｐ＜０ ０１ｖｓＣｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ
．
Ｆｉｇ４ ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＤＮＡｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｉｎｌｕｎｇｔｉｓｓｕｅｓ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
Ａ：ＣｐＧｉｓｌａｎｄｓｉｎＦｏｘＯ１ｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｗｅｒｅｐｒｅｄｉｃｔｅｄｆｏｒｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓ；Ｂ：ＴｈｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＦｏｘＯ１ｇｅｎｅｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙａｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．（Ｍｉｓｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ；Ｕｉｓｎｏｎ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）．Ｃ，Ｄ：ＴｈｅｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＤＮＭＴ１，ＤＮＭＴ３ＡａｎｄＤＮＭＴ３Ｂｗｅｒｅｄｅｔｅｃ
ｔｅｄｂｙｑＲＴ ＰＣＲａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ． Ｐ＜０ ０５，
Ｐ＜０ ０１ｖｓＣｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．
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９３·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２３Ｊａｎ；３９（１）
Ｆｉｇ５ ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＦｏｘＯ１
ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌａｎｄｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ
Ａ：ＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｂｅｔｗｅｅｎＩＬ ６ｉｎｌｕｎｇｔｉｓｓｕｅｓａｎｄＦｏｘＯ１ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌ；Ｂ：ＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｂｅｔｗｅｅｎＴＮＦ αｉｎｌｕｎｇｔｉｓｓｕｅｓａｎｄＦｏｘＯ１ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌ．
风险投资家２．６ ｐ３８ＭＡＰＫ的磷酸化水平 与Ｃｏｎｔｒｏｌ对照比较，ＬＰＳ组肺组织ｐ３８ＭＡＰＫ蛋白表达无差异（Ｐ＞０ ０５），而ｐ３８ＭＡＰＫ磷酸化水平明显增加，升高了１３４ １％（Ｐ＜０ ０１），见Ｆｉｇ６
。
Ｆｉｇ６ Ｔｈｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｐ３８ＭＡＰＫ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
Ｔｈｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｐ３８ＭＡＰＫｉｎｌｕｎｇｔｉｓｓｕｅｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ． Ｐ＜０ ０１ｖｓＣｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．２．７ 干扰ＦｏｘＯ１后ｐ３８ＭＡＰＫ的表达变化 为了进一步探讨ＦｏｘＯ１在肺损伤中的机制，构建ＦｏｘＯ１干扰片段并转染至ＰＶＥＣ４８ｈ，ｑＲＴ ＰＣＲ结果显示，在引起ＦｏｘＯ１表达下调的３个干扰片段中，ＦｏｘＯ１ ｓｉＲＮＡ １８０３（ｓｉ ＦｏｘＯ１）敲低效果最佳，可用于后续试验（Ｆｉｇ７Ａ）。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ验证其干扰效率，结果显示，ＦｏｘＯ１干扰片段筛选成功（Ｆｉｇ７Ｂ）；为证明ＦｏｘＯ１在ＬＰＳ诱导的肺损伤中调控作用，
在ＬＰＳ干预ＰＶＥＣ情况下转染ｓｉ ＦｏｘＯ１，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ｐ３８ＭＡＰＫ的磷酸化变化。结果显示，与ＬＰＳ＋ｓｉ ＮＣ组相比，ＬＰＳ＋ｓｉ ＦｏｘＯ１组ｐ３８ＭＡＰＫ蛋白磷酸化水平明显降低（Ｆｉｇ７Ｃ），以上结果说明，ＦｏｘＯ１可以调控ｐ３８ＭＡＰＫ的磷酸化水平。
３ 讨论
脂多糖是革兰阴性菌细胞壁的主要活性成分，可诱导炎症反应的过度激活，现已被广泛应用于诱导ＡＬＩ模型［９－１０］。我们的实验给予小鼠腹腔注射ＬＰＳ诱导构建了急性肺损伤小鼠模型，肺损伤小鼠模型中病理学表现为肺泡结构损伤，肺间质充血水肿、大量炎性细胞浸润，肺组织匀浆液ＴＮＦ α和ＩＬ ６含量也明显高于对照组，说明我们成功构建了急性肺损伤小鼠模型。
ＦｏｘＯ１作为人体最重要的转录因子之一，在多种细胞类型中广泛表达，可通过转录和翻译，调节细胞氧化应激反应、炎症及增殖等多种病理生理过程［１１］。ＦｏｘＯ１自身的转录后修饰调节ＦｏｘＯ１的功能奠定了它在代谢、免疫等方面研究中的重要地位［１２］。Ａｒｔｈａｍ等［１３］发现，Ａｋｔ１／ＦｏｘＯ１／ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ１通路参与了ＬＰＳ诱导的ＡＬＩ的发病机制中，而抑制ＦｏｘＯ１的表达后，可逆转脂多糖诱导的急性肺损伤。本研究结果显示：在ＬＰＳ诱导的肺损伤模型中，ＦｏｘＯ１表达明显增加，表明ＦｏｘＯ１参与了肺损伤的过程，但其具体机制有待进一步研究。
ＤＮＡ甲基化作为真核生物最常见的表观遗传修饰方式之一，目前，ＦｏｘＯ１ＤＮＡ甲基化作为一种调控机制日益成为人们研究的热点，课题组前期发现，ＦｏｘＯ１启动子区的低甲基化造成ＦｏｘＯ１的表达增加，在Ｈｃｙ诱导的肝细胞内质网应激未折叠蛋白反应中发挥重要作用［１４］，但是，关于ＦｏｘＯ１基因ＤＮＡ异常甲基化与肺损伤的相关性研究尚属于全新的领域，其具体作用尚不明确。我们通过生物信息学分析发现，ＦｏｘＯ１启动子区存在两个ＣｐＧ岛，提示ＦｏｘＯ１的表达可能受甲基化调控。进一步用ＭＳＰ检测ＦｏｘＯ１启动子区甲基化，结果显示，ＬＰＳ组肺组织ＦｏｘＯ１启动子区甲基化水平明显降低，与其
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·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２３Ｊａｎ；３９（１）
