生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2009年第3期
·综述与专论·
收稿日期：2008-11-13
基金项目：“十一五”奶业国家科技支撑计划（2006BAD12B08，2006BAD04A10）作者简介：赵圣国（1984-），硕士研究生，研究方向：瘤胃微生物及酶学
通讯作者：王加启，研究员，博士生导师，主要从事反刍动物营养和牛奶质量改良研究；E -mail ：wang -jia -**********
脲酶（urea ），又称尿素酶或酰胺水解酶，编号为EC 3.5.1.5，是人类首次获得晶体的镍离子金属酶。它能催化尿素水解，产生二氧化碳和氨，其催化反应速度是常规化学催化的1014倍。在自然界中，很多生物体都能合成脲酶，如细菌、植物和真菌。脲酶有助于植物和微生物体利用内源性和外源性尿素作为氮源，并能将分解产生的氨合成机体蛋白质[1]。脲酶能够参与植物系统氮转运通路和毒素的伤害[2]；
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参与反刍动物尿素再循环系统；还能引起人类和动物的胃肠道感染疾病的发生，如幽门螺杆菌脲酶导致胃炎，能引起尿路感染并诱导产生尿结
石[3]。因此，很多研究是针对如何寻找脲酶抑制剂，来抑制脲酶活性，保护机体感染或提高机体对氮的利用率。
同样脲酶蛋白自身的用途也非常广泛，尤其是近年来固定化脲酶技术大发展，极大的拓宽了脲酶的应用范围。目前脲酶蛋白广泛应用于医学生化检测、工业制造和环境保护中。现就脲酶蛋白在化学和临床分析、环境保护、生物医药工程、食品饮品和太空飞船水循环中的应用作一综述。
1固定化脲酶
游离脲酶由于活力不易保持、难于重复利用和
脲酶在生物工程中的应用
赵圣国1，2
王加启1
刘开朗1
李旦1
于萍1
卜登攀1
魏宏阳1
周凌云1李发弟2
（1中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室，北京100193；
爱护眼睛作文2
甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州730070）
摘要：脲酶是一种高效的尿素分解催化剂，化学反应速度是常规化学催化的1014倍，广泛应用于工业、农业和医
药行业。论述脲酶在生物工程中的应用，内容包括检测血、尿、酒饮料、天然水和环境污水中尿素；检测肌酐和精氨酸；消除肾衰竭病人体内多余尿素，消除酒饮料和废水中尿素；回收太空飞船上的废
水和控制多级酶促反应中的pH 。
关键词：脲酶
固定化
尿素
手工制作小木屋
pH 稳定
生物反应器
Application of Urea in Bioengeering
Zhao Shengguo 1，2
Wang Jiaqi 1Liu Kailang 1Li Dan 1Yu Ping 1Bu Dengpan 1
Wei Hongyang 1Zhou Lingyun 1Li Fadi 2
（1State Key Laboratory of Animal Nutrition ，Institute of Animal Science ，Chine Academy of Agricultural Sciences ，Beijing
100193；2Animal Science and Technology College of Gansu Agricultural University ，Lanzhou 730070）
Abstract ：Urea is a highly efficient catalyst for the hydrolysis of urea ，the reaction rate of which is approximately 1014times than that of the noncatalyzed reaction.It has been ud in agriculture ，
industry and medicine areas.In this work the applications in bioengeering was reviewed ，including urea content analysis in blood ，urine ，alcoholic beverages ，natural water and environmental wastewaters ；determination of creatinine ，arginine ；urea removal from artificial kidney dialyzates ，
alcohol beverages and fertilizer wastewaters ；wastewater reclamation for life support systems in space and pH control or shift for multi -enzyme reaction system.
Key words ：Urea Immobilization
Urea pH stability Bioreactor
生物技术通报Biotechnology Bulletin2009年第3期
难于长期贮存等缺点，其应用受到一定的限制。而固定化酶可作为一个良好的反应系统，使自然的酶结合于不溶性的包埋载体材料上，使脲酶稳定性得到加强，且可重复利用。固定化过程具有影响酶活性、米氏常数、最适温度、热稳定性、贮存稳定性、最适pH、pH稳定性和抑制剂的作用。固定脲酶的方法主要有物理吸附法、交联法、包埋法和共价键合法。物理吸附法获得的固定化酶由于重复使用次数不高，其应用受到限制；而交联法或共价键合法使酶有较好的稳定性，保持了酶的催化活性。目前已经有多种材料用于微生物脲酶的固定化，包括PET 膜、氨基多糖、包醛氧淀粉、纤维素、褐藻酸钙盐、磁性壳聚糖微球、聚苯胺、聚醚矾膜和明胶等[4]。
邓迎迎等[5]以甲壳素为原料制备出壳聚糖载体，并对脲酶进行固定化。该固定化酶的最适温度为65℃，最适pH值为6.6，米氏常数为0.009mol/L，较游离酶均有较大改善。周建琴等[6]用戊二醛将伴刀豆球蛋白和壳聚糖载体交联，并利用伴刀豆球蛋白与脲酶糖链的特异性结合作用，实现脲酶的定向固定化。定向固定化脲酶的最适pH5.0～6.0、最适温度77℃、米氏常数Km11.76mmol/L，与游离酶相比有更宽的pH适用范围，最适温度提高，与底物的亲和力较大，且有较好的操作稳定性。彭虹旎等[7]以氨基多糖为载体材料，采用三聚磷酸钠固定的方法制成氨基多糖微球，并以此氨基多糖微球为载体用戊二醛交联法进行脲酶固定化研究。光滑表面微球载体与多孔微球载体对脲酶的固定化效率分别是51．5％和68％；用1．5cm×15cm柱进行尿素转化时间12min，光滑表面微球载体固定化脲酶和多孔微球载体固定化脲酶对尿素溶液（300mg／L）转化率分别为91.8％和99.99％。
2检测生化指标
2.1测定肌酐含量
肌酐是肌肉在人体内代谢的产物，其在血中的含量能反映肾脏的正常与否。脲酶可用于测定人体肌酐的含量，间接电导法测定肌酐含量的反应如下：
生物传感器的酶层板中含有3种酶：肌酸酐酶、肌酸酶和脲酶。肌酸酐酶能将肌酐转变肌酸，再将肌酸转变成尿素，并利用脲酶将尿素转变成氨离子，最后利用成氨敏感电极检测氨量，通过检测氨量来检测肌酐的含量。该测定方法的肌酐范围是1~50mM，反应仅需60s[8]。Pandey等[9]将肌酸酐酶和肌酸酶用溶剂凝胶连接起来，用对甲基苯磺酸甲酯将脲酶固定在多聚离子pH电极上，检测肌酐的下限为100μM。Karaku鬤等[10]将脲酶和肌酸酶固定在聚氯乙烯氨膜电极上检测肌酐，其线性范围为1.0×10-5～1.0×10-3M，电极反应时间是60s，2个月后稳定性下降了40%~45%。
2.2测定精氨酸含量
精氨酸是生糖氨基酸，对于人体营养非常重要。精氨酸作为药品能用于内分泌疾病的治疗，精氨酸酶也能将精氨酸分解成尿素，常应用于生物加工和食品行业。
L-精氨酸酶能将L-精氨酸催化为L-鸟氨酸和尿素。尿素被转化成氨后，用比色法测定氨的含量。Alons
o等[11]再将精氨酸酶和脲酶固定在环氧酯上，然后装入50mm×3mm玻璃柱内，检测精氨酸。这一酶反应器能稳定工作6个月，使用800次后酶仍能保持80%的活性。L-精氨酸的浓度下限为8mM，在7.5~38mM之间保持线性关系，相对标准偏差为1.8%。Ramón等[12]利用脲酶测定葡萄汁和酒中的L-精氨酸含量，酒中L-精氨酸回收率在98.3%~104.4%之间，变异系数在0.4%~1.47%之间。葡萄汁中L-精氨酸回收率在100~101.3之间，变异系数为0.6%。这一方法经济廉价，每个反应大约$0.43，反应时间短，优于比色分析方法。
2.3测定尿素含量
在医药、环境和生物产业中，尿素浓度的测定具有重要的意义。由于人体血液中尿素的测定在临床医学上有重要的实用价值（血液中尿素的浓度高低可判断肾脏功能是否正常），所以脲酶电极是近年热点研究的一类酶电极。尿素水解产生的氨和二氧化碳能引起反应液pH、离子组成和温度的变化。根据酶促反应来测定这些变化形成了许多种测定尿素浓度的检测方法。但是，溶液中的酶并不稳定，需要足够多的数量来维持，目前常利用固定化脲酶
肌酐+H2O 肌酸酐酶
肌酸+H+
肌酸+H2O 肌酸酶
肌氨酸+尿素+H+
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技术。固定化脲酶技术包括电位分析方法（氨或二氧化碳敏电极、氨离子电极、pH电极和场效应晶体管），电流计法、电导滴定法、光学法、热量法、声学法、比色法和离子对高效液相色谱法[13]。商业化脲酶生物传感器能用于测定血清、尿液、天然水、废水、食品和酒中尿素浓度。
Boubriaka等[14]在离子敏感场效应晶体管上面覆盖一层牛血清白蛋白薄膜后将脲酶固定在上面，用于测定血清中的尿素浓度，尿素浓度在小于2 mM时具有良好的线性关系，与传统化学的脲酶-吲哚苯法一致。Suye等[15]利用荧光素钠作为荧光染料来反映pH的改变。在λex=490nm和λex=514nm下测定荧光强度，当尿素浓度在0.25～3mM时，能呈现很好的线性关系，相关系数为0.996；当利用光导纤维探针来测量荧光强度时，当尿素浓度在0.10～1.75mM时呈现线性关系。
3控制尿素含量
3.1消除肾衰竭病人体内多余的尿素
尿素是氮代谢过程的主要废物，消除肾衰竭病人体内尿素非常重要。由于尿素没有很好的吸收剂，最有效的方法是利用脲酶来消除。1964年人们就开始利用脲酶消除尿素，在体外人工细胞中利用脲酶成功地将尿素转变成了氨，但是，血氨浓度高于10-4M时易引起人体氨中毒。因此，应用该方法必须有去除氨的配套措施。1973年，Patzer等[16]在人工细胞上将脲酶微囊化处理，再利用化学吸收剂去除氨。根据这一原理生产出了人工肾脏。
目前利用的氨吸收剂的吸收能力有限，除了利用气体膜除氨外，而且尿素去除膜反应器结合固定化电透析也有报道。另一种方法是利用多重酶体系将尿素和氨转变成必须氨基酸。微囊多重酶体系包括脲酶、谷氨酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶，它能将尿素转变成谷氨酸，但谷氨酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶能使NADPH循环再生，而且谷氨酸能形成丙氨酸。多重酶体系也用于肝衰竭病人，尿素能被有效的转变成L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸[17]。
口服疗法治疗尿毒症的原理是通过口服制剂吸附人体肠道中的尿素，因为由肝脏产生的尿素有20％将随血流扩散到人体肠道中去，此法可间接降低血液中的尿素浓度。处于研究中的口服吸附剂有多种，其中最具创新和有明显效果的是加拿大麦吉尔大学的研究，他们将脲酶基因工程菌包埋在APA 微囊内，口服治疗肾衰竭鼠模型，获得成功[18]。但是，重组菌的安全性值得担忧。Chow[19]等利用藻酸盐-多聚赖氨酸-藻酸盐高分子膜包被能分泌脲酶的徳氏乳杆菌，制成微囊，尿毒症患者口服24h内能有效的降低血中尿素和氮的浓度。
3.2回收利用太空飞船上的废水
在孤立的太空飞船上，水的循环再利用非常重要，利用脲酶净化水是很有意义的[20]。Schusl[21]等建立和评价了利用固定化脲酶生物反应器持续消除封闭环境中的尿素。该生物反应器均包括了5个床层。从里到外，第一个床由两个离子交换系统组成，目的是去除碘，防止对第二床层中脲酶活性的影响，第二床层中脲酶将尿素水解成氨和二氧化碳，后面的两个床层用于去除产生的离子，如NH4+和HCO3-。最后一层床位是用无菌碘来对流过的水杀菌。200cm3的固定化脲酶生物反应器能持续运行220d。该生物反应器已经通过太空飞船废水（卫生水和尿液）的检测验证。
3.3清除酒饮料中的尿素
酒精饮料中含有致癌性化学物质氨基甲酸乙酯（Ethylcarba-mate），它是由尿素和乙醇经化学反应形成的。因此，去除酒饮料中的尿素对于控制产品质量是非常重要的。早在1977年，就有人利用脲酶去除酒中的尿素。但是，刀豆脲酶的最适pH为7.0，米酒和白酒中pH4.4和3.2，所以脲酶加入后活性必然会很低[22]。
随后，人们陆续从乳酸菌和其它微生物中发现了酸性脲酶。吴伟祥等[23]利用筛选的肠杆菌属一株菌9043C12产生的脲酶，在25℃，pH5.0条件下，在含乙醇16%或20%（v/v）、尿素30mg/L的模拟酒中添加10U/L脲酶，可使尿素去除率在36h内达90%以上。在美国和日本，脲酶已经应用于工业化生产中，
但直接添加脲酶有很多缺憾，如价格贵，处理时间长（7~30d），不能连续处理和脲酶必须被巴氏灭活。所以，工业大规模处理中，通常用固定在壳聚糖衍生物上的脲酶处理酒饮料。Marco等[24]证明用此方法在低温（5~15℃）高流速条件下运行
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150多天后，米酒中尿素的浓度能下降到3ppm。3.4处理含尿素的工业废水
在工业废水中含有大量的尿素和氨，废水氨氮含量能达到125mg/L，尿素含量能达到750mg/L。现代尿素处理系统是对废水进行高温（190~290℃）和高压（10~20kg/cm2）处理[25]。但是，热处理水解尿素技术有很多缺陷，因利用脲酶水解尿素是很好的选择。
可以直接利用脲酶，或利用具有脲酶活性的微生物处理废水，产生的氨能通过气流、蒸汽或离子交换来回收。生物处理过程包括尿素水解成氨、硝化和去硝化过程。由于废水的pH通常高于9.0，可以通过加入磷酸，通入二氧化碳降低pH，维持脲酶活性。用缓冲液和EDTA处理工业上废水价格比较贵，并污染环境。因此，对于生物反应器的稳定性仍是个问题。有人通过培养微生物分泌脲酶对污水进行净化[26]。
杨少斌等[27]采用等离子体引发聚四氟乙烯（FE）表面固定化脲酶，并利用固定化酶膜处理含尿素废水。研究发现，固定化酶处理900mg/L的尿素废水，30℃以上的温度下1h以内尿素转化率能保证在90％以上，并且固定化酶比活力不变。魏永峰等[28]发现壳聚糖球珠固定化脲酶的储藏稳定性优于游离酶，但催化活性小于游离酶，其米氏常数小于游离酶。应用所制备的固定化酶检测分析废水中的尿素，线性范围为1.0×10-5～5.0×10-3g/ml，平均回收率（100±3.2）％，检出限1.0×10-5g/ml。
4控制或改变生物反应器中pH
幽门螺杆菌的细胞膜中的脲酶能水解尿素产生缓冲液-氨和氨基甲酸酯，保证了幽门螺杆菌在强酸性胃环境中的生存和定植，这类似于固定化脲酶反应和酶联免疫分析中pH的控制技术[29]。通过不断地滴定可以控制生物反应器中的pH，但是这些反应是在固相介质中，滴定极易引起酶微环境中pH的不稳定。
在多级酶化学反应中，一个酶反应的产物是另一个酶反应的底物，稳定的pH至关重要，并且每一步的最适pH都各有不同。在工业中，利用葡萄糖糖化酶和葡萄糖异构酶催化生产高果糖浆，这两种酶的最适pH值分别是5.0和7.0~8.5。当把两种酶同时置于pH6.5的环境中进行催化反应时，两种酶的活力都很低。利用含脲酶的薄层允许两步酶反应同时进行，利用尿素水解生成的氨消耗氢离子，保证葡萄糖异构酶维持在最适pH5.0[30，31]。双酶免疫分析法也需要不同的pH，辣根过氧化酶为5.1，β-糖苷酶为7.0，脲酶能将pH自动改变到所需的最适pH，以使辣根过氧化酶和CAL快速反应[32]。5结论
利用脲酶测尿素和肌酐去除人工肾脏和酒精中的尿素都已经商业化生产。但是其中最重要的问题是酶的稳定性，固定化脲酶具有几天到1年的半衰期，根据载体物，固定化程序和应用不同。因此，脲酶研究的一个趋势是寻找一个能获得高活性或长期稳定性固定化酶的方法和分离具有高活性微生物脲酶，耐热性脲酶，碱酸性pH脲酶。利用具有脲酶活性的微生物替代游离性脲酶也是另一个趋势。水解产物氨，能提高溶液pH，能抑制和消除脲酶活性。目前已有利用离子交换、吸收、电透析和气膜分离方法去除氨的报道，但是，大多数情况下去除的效率并不理想，有待于进一步研究。
固定化细胞是一种很有前途的处理技术，特别适用于抑菌性强的废水处理，固定化细胞能保持高活性。而微生物是脲酶的主要来源，通过对产脉酶的微生物进行筛选和优化处理，达到大规模生产脲酶的目的，这也是目前研究的一个热点。此外，固定化微生物技术还有很多问题有待解决，这也是今后一段时间内固定化技术的研究方向。首先，载体是固定化技术的重要组成部分，而目前载体价格仍然令人难以承受。一般固定化微生物半衰期较长的也仅能达到多天，要经常更换载体，不经济，而且运行管理繁琐。因此，进一步开发新型优良的固定化载体对固定化技术的发展至关重要。其次，固定化微生物的稳定性及性能的改善也是研究的一个重点。
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