ｂｌｏｔ．Ｔｈｅｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｃｙｃｌｅｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｔｈｅａｂｉｌｉｔｙｏｆｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｔｒａｎｓｗｅｌｌａｓｓａｙ．ＴｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＭＭＰ ２ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＥＬＩＳＡ．Ｔｈｅｃｈａｎｇｅｏｆｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃａｌｃｉ ｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｌａｓｅｒｃｏｎｆｏｃａｌｓｃａｎ ｎｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｉｎｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣａＳＲｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｔｈｅｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｄｅｘａｎｄＰＣＮＡｗｅｒｅｅｎｈａｎｃｅｄ，ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｓｏｆＭＭＰ ２ａｎｄｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｍｉｇｒａｔｅｄｃｅｌｌｓｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗａｓｅｌｅｖａｔｅｄ．ＧｄＣｌ
３
ａｎｄＮＰＳ２１４３ｕｐ ｒｅｇｕｌａｔｅｄａｎｄｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｈｅａｂｏｖｅｅｆｆｅｃｔｓｃａｕｓｅｄｂｙｉｎｓｕｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ ＴｈｅＣａＳＲａｃｔｉｖａｔｅｄｂｙｉｎｓｕｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｃａｎｐｒｏｍｏｔｅｐｒｏ ｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｍｉｇｒａｔｉｏｎｏｆ
ｒａｔＲＡＭＳＣｓ，ｉｎｗｈｉｃｈｉｎｔｒａ ｃｅｌｌｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍｉｏｎｐｌａｙａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｃａｌｃｉｕｍｓｅｎｓｉｎｇｒｅｃｅｐｔｏｒ；ｒｅｎａｌａｒｔｅｒｙｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌ；ｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ；ｈｉｇｈｉｎｓｕｌｉｎ；ｐｒｏｌｉｆ ｅｒａｔｉｏｎ；ｍｉｇｒａｔｉｏｎ
树正群海
网络出版时间：２０２０－１２－１６８：０５ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．Ｒ．２０２０１２１５．１１２０．０２４．ｈｔｍｌ
桃叶珊瑚苷通过激活ＥＲβ途径抑制心肌细胞凋亡
李春晓，张璐莎，张丽媛，马璐璐，王倩怡，方乐玉，杨文杰，孙 伟，冷雨泽，陈 璐，王 虹
同意做某事（天津中医药大学中西医结合学院、方剂学教育部重点实验室、天津市中药药理学
重点实验室、天津中医药大学中医药研究院，天津 ３０１６１７）
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－１９７８．２０２１．０１．０１２
文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２１）０１－００６８－０７中国图书分类号：Ｒ ３３２；Ｒ２８４ １；Ｒ３２９ ２５；Ｒ３２９ ４１１；Ｒ３９２ １１；Ｒ５４２ ２２；Ｒ９７７ １２余光中散文精选
摘要：目的 探讨桃叶珊瑚苷（ａｕｃｕｂｉｎ，ＡＵ）抑制心肌细胞凋亡发挥抗心肌缺血损伤从而改善急性心肌梗死后心功能的作用与可能机制。方法 采用冠状动脉左前降支结扎法制作小鼠急性心肌缺血（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ，ＭＩ）模型。采用超声心动、Ｍａｓｓｏｎ染色检测小鼠心功能及梗死面积。建立肿瘤坏死因子 α（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ α，ＴＮＦ α）／放线菌酮（ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ，ＣＨＸ）诱导的大鼠Ｈ９ｃ２心肌细胞损伤模型。采用ＩｎｃｕＣｙｔｅ活细胞成像、ＴＵＮＥＬ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ等方法探讨了ＡＵ的抗心肌细胞损伤作用及其作用机制。结果 研究结果表明，ＡＵ可以改善心肌梗死小鼠的心功能，降低梗死面积，减少由ＴＮＦ α／ＣＨＸ诱导的心肌细胞凋亡，降低ｃａｓｐａｓｅ ３蛋白质表达，上调Ｂｃｌ２／Ｂａｘ比值；同时ＡＵ可使ＥＲβ（ｅｓ ｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒβ，ＥＲβ）表达升高，且雌激素受体β抑制剂可阻断ＡＵ的抗凋亡作用。结论 该研究证实，ＡＵ可以通过
收稿日期：２０２０－０７－１５，修回日期：２０２０－０９－２２
基金项目：国家国际科技合作专项基金资助项目（Ｎｏ２０１５ＤＦＡ３０４３０）；国家自然科学基金青年项目（Ｎｏ８１６０３３２９）
作者简介：李春晓（１９９２－），女，博士生，研究方向：中药心血管药理，Ｅ ｍａｉｌ：１２５６６６５３７８＠ｑｑ．ｃｏｍ；
陈 璐（１９８９－），女，博士，助理研究员，研究方向：中药
心血管药理，通讯作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｌｕｔｊｕｔｃｍ＠ｔｊｕｔｃｍ．ｅｄｕ．
ｃｎ；
二亩地王 虹（１９７４－），女，博士，研究员，博士生导师，研究方
向：中药心血管药理，通讯作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｗａｎｇｈｏｎｇｓｙｓ＠
１２６．ｃｏｍ抑制心肌细胞凋亡发挥抗心肌缺血损伤从而改善急性心肌梗死后心功能的作用，其部分作用机制与ＥＲβ通路的激活有关。
关键词：桃叶珊瑚苷；心肌细胞；细胞凋亡；植物雌激素；雌激素受体；肿瘤坏死因子 α
缺血性心脏病（ｉｓｃｈｅｍｉｃｈｅａｒｔｄｉｓｅａｓｅ，ＩＨＤ）是全球死亡率最高的疾病之一［１］。急性心肌梗死（ａ ｃｕｔｅｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ，ＡＭＩ）能
够导致不可逆的心肌细胞损伤或继发的心肌供血不足。虽然现有的治疗方法能够改善冠状动脉血流，增加缺血区域的血液供应从而达到治疗效果［２］，但其发病率和死亡率依然居高不下。氧化应激损伤是缺血性心脏病的主要发病机制［３］，活性氧的积累导致心肌细胞的坏死和凋亡，其中细胞凋亡贯穿心肌梗死发生的整个病程［４］，因此减少心肌梗死后的心肌细胞凋亡对限制心肌梗死患者的组织损伤程度及改善心脏功能具有重要意义。
雌激素受体β（ｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒβ，ＥＲβ）在调节正常生理、衰老和多种疾病中发挥重要作用［５］。ＥＲ最典型的功能为配体激活的转录因子，介导激素调节的组织和器官中的基因转录［６］。研究表明［７］，绝经后妇女急性心肌梗死的增加可能与体内雌激素水平下降和ＥＲβ表达下降有关。在心肌梗死中，ＥＲβ通过调节ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ信号通路改善急性心肌梗死患者的心功能及ＭＩ后的心肌纤维化［８－９］，是预防及治疗围
·
８
６
·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｊａｎ；３７（１）：６８～７４
绝经期综合征患者急性心肌梗死的潜在靶点之一。桃叶珊瑚苷（ａｕｃｕｂｉｎ，ＡＵ）又称β Ｄ 吡喃葡萄
糖苷，是杜仲、车前草、地黄等中药材的有效成分之一。近年来研究表明，ＡＵ具有抗氧化、抗炎、抗纤
维化等多种药理作用［
１０－１１］
处女座和什么星座最配，对免疫、心脑血管、神经系统均有保护作用，但其对心肌细胞凋亡的作用机制尚不清楚。本课题组前期研究发现ＡＵ具有植物
雌激素样作用［１２］
，能够激活雌激素受体。本研究旨
在探讨ＡＵ对心肌凋亡的影响及其机制，为ＡＵ防治缺血性心脏病提供新的实验依据。１ 材料与方法１．１ 材料
１．１．１ 细胞与动物 大鼠Ｈ９ｃ２，购于美国ＡＴＣＣ公司，８周龄雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠购自北京维通利华实验动物研究中心，许可证号：ＳＣＸＫ（京）２０１６ ０００６。
１．１．２ 药物与试剂 ＡＵ购于成都曼斯特生物科技有限公司（批号：ＤＳＴ１９０９０７ ００４），纯度为９９ ９３％，分子量为３４６ ３３，分子式：Ｃ１５Ｈ２２Ｏ９；肿瘤坏死因子 α（Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ α，ＴＮＦ α，货号：３１５ ０１Ａ）购于ＰｅＰｒｏＴｅｃｈ；放线菌酮（Ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ，ＣＨＸ，货号：Ｍ４８８１）、ＭＴＴ（货号：Ｍ８１８０）购于Ｓｏ ｌａｉｂｒｏ；ＭＰＰｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（货号７Ａ／１９８３４３）、（Ｒ，Ｒ） ＴＨＣ（货号：６Ａ／１９２６７８）购于ｔｏｃｒｉｓ公司；ＤＣＦＨ ＤＡ粉末（货号：Ｄ６８８３）购于Ｓｉｇｍａ；ＤＭＥＭ（货号：ＳＨ３００２２ ０１）购于Ｈｙｃｌｏｎｅ；胎牛血清（ＦＢＳ，货号：０４ ００１ １ＡＣＳ）、双抗（青链霉素，货号：０３ ０３１ １Ｂ）、胰蛋白酶（货号：０３ ０５２ １Ａ）购于ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｄｕｓ ｔｒｉｅｓ；β Ａｃｔｉｎ（３Ｅ５）ＲａｂｂｉｔｍＡｂ（货号：４９７０）、ｃａｓｐａｓｅ ３Ａｎｔｉｂｏｄｙ（货号：９６６２）、ＡｋｔＡｎｔｉｂｏｄｙ（货号：４６９１）、ｐ ＡｋｔＡｎｔｉｂｏｄｙ（货号：４０６０）、Ｂｃｌ２Ａｎｔｉ ｂｏｄｙ（货号：３４９８）、ＢａｘＡｎｔｉｂｏｄｙ（货号：２７７２）购于
ＣＳＴ；Ｇｏａｔａｎｔｉ ＲａｂｂｉｔＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５９４
ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（货号：Ａ １１０１２）购于Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＩｎＳｉｔｕＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（货号：１１６８４８１７９１０）购于Ｒｏｃｈｅ。１．２ 方法
１．２．１ 动物及给药 小鼠在体实验经天津中医药大学伦理委员会（中国天津）批准，在体研究方法均按照指南操作。所有动物实验均按照美国指南（ＮＩＨ出版物＃８５ ２３，１９８５年修订）和赫尔辛基宣言的原则进行。将小鼠饲养于温度（２２±２）℃和湿度５５％±５％房间中，１２ｈ照明／１２ｈ黑暗昼夜交替，在进行实验前适应性喂养１周。研究中使用的ＡＵ
人参分类为１０ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１
，辛伐他汀作为阳性药，使用剂
来大姨妈可以洗头吗
量为１
０ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１
。将ＡＵ和辛伐他汀溶解在生理盐水中灌胃给药。
１．２．２ 手术 腹腔注射三溴乙醇麻醉小鼠，结扎左前降支冠状动脉建立急性ＭＩ模型。手术后将小鼠随机分为４组：
假手术组，模型（生理盐水）组，ＡＵ组和Ｓｉｍ组。从ｄ０开始，将小鼠随机分组给药。１．２．３ 超声心动 在术前１ｄ，术后７、１４和２８ｄ，
用Ｖｅｖｏ２１００ＴＭ
高分辨率超声生物显微镜（Ｖｉｓｕａｌ
ＳｏｎｉｃｓＩｎｃ ，Ｃａｎａｄａ）和Ｖｅｖｏ分析软件（Ｖｅｖｏ２ ２ ３，［
ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓＩｎｃ．］）进行超声心动图测量。麻醉小鼠后，记录Ｍ－模式短轴图像和Ｂ－模式长轴图像。测量左心室收缩末期容积（ＬＶＥＳＶ）和舒张末期容积（ＬＶＥＤＶ）。计算左心室射血分数（ＬＶＥＦ）（ＬＶＥＦ＝
［ＬＶＥＤＶ－ＬＶＥＳＶ］／ＬＶＥＤＶ）。１．２．４ Ｍａｓｓｏｎ染色 在造模２８ｄ超声心动图分析后取材，用体积分数０ ０４多聚甲醛固定后包埋在石蜡中，并在缝合线下方５００ｍｍ距离处切片。通过Ｍａｓｓｏｎ＇ｓＴｒｉｃｈｒｏｍｅ染色评估心脏组织的梗死面积。１．２．５ 细胞培养 细胞培养所用培基为ＤＭＥＭ加入体积分数０ １的胎牛血清，及体积分数０ ０１的青链霉素混匀，４℃存放。细胞于体积分数０ ０５的ＣＯ２、０ ９５空气、３７℃、饱和湿度的培养箱内培养。细胞融合至０ ８～０ ９时进行传代。
１．２．６ 细胞活力检测 正常培养细胞融合至０ ８
时，以８×１０３
个细胞每孔接种于９６孔板中，分别为Ｃｏｎｔｒｏｌ（０ １％ＤＭＳＯ）组；ｍｏｄｅｌ组（１０μｇ·Ｌ－１ＴＮＦ α
，５ｍｇ·Ｌ－１ＣＨＸ，０ １％ＤＭＳＯ）；ＡＵ１０μｍｏｌ·Ｌ－１组（１０μｇ·Ｌ－１ＴＮＦ α，５ｍｇ·Ｌ－１
ＣＨＸ，ＡＵ１０μｍｏｌ·Ｌ－１）；ＡＵ２０μｍｏｌ·Ｌ－１组（１０μｇ·Ｌ－１ＴＮＦ α，５ｍｇ·Ｌ－１ＣＨＸ，ＡＵ２０μｍｏｌ·Ｌ－１）；ＡＵ５０μｍｏｌ·Ｌ－１组（１０μｇ·Ｌ－１ＴＮＦ α，５ｍｇ·Ｌ－１ＣＨＸ，ＡＵ５０μｍｏｌ·Ｌ－１），共５组，每组６个复孔。造模同时用ＡＵ处理心肌细胞６ｈ后进行ＭＴＴ检测。ＭＴＴ使用浓度为０ ５ｇ·Ｌ－１，每孔加入２０μＬ并在３７℃下孵
育４ｈ。除去含ＭＴＴ的培养基后，每孔加入２００μＬＤＭＳＯ，用酶标仪检测４９０ｎｍ处各孔的ＯＤ值。１．２．７ ＩｎｃｕＣｙｔｅ活细胞成像系统 Ｈ９ｃ２细胞以含体积分数０ １的ＦＢＳ的ＤＭＥＭ完全培养基常规培养，当细胞生长覆盖到培养皿的０ ９后用胰酶消化，
细胞计数后，以８×１０３
个细胞每孔接种于９６孔板
ope
中。用显微镜观察细胞情况后置于培养箱中培养。将实验分为６组，每组３个复孔，分别为分别为Ｃｏｎ
ｔｒｏｌ（０ １％ＤＭＳＯ）组；ｍｏｄｅｌ组（１０μｇ·Ｌ－１
ＴＮＦ α，５ｍｇ·Ｌ－１ＣＨＸ，０ １％ＤＭＳＯ）；ＡＵ２０μｍｏｌ·Ｌ－１组（１０μｇ·Ｌ－１ＴＮＦ α
，５ｍｇ·Ｌ－１ＣＨＸ，ＡＵ２０μｍｏｌ··
９６·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｊａｎ；３７（１）
Ｌ－１）；Ｅ２组（１０μｇ·Ｌ－１ＴＮＦ α，５ｍｇ·Ｌ－１ＣＨＸ，Ｅ２１０ｎｍｏｌ·Ｌ－１）；ＡＵ＋ＭＰＰ组（１０μｇ·Ｌ－１ＴＮＦ α，５ｍｇ·Ｌ－１ＣＨＸ，ＡＵ２０μｍｏｌ·Ｌ－１，ＭＰＰ１００ｎｍｏｌ·Ｌ－１）；ＡＵ＋ＭＰＰ组（１０μｇ·ｍＬ－１ＴＮＦ α，５ｍｇ·Ｌ－１ＣＨＸ，
ＡＵ２０μｍｏｌ·Ｌ－１，ＭＰＰ１００ｎｍｏｌ·Ｌ－１）；ＡＵ＋（Ｒ，Ｒ）－ＴＨＣ组（１０μｇ·Ｌ－１ＴＮＦ α，５ｍｇ·Ｌ－１ＣＨＸ，ＡＵ２０μｍｏｌ·Ｌ－１，（Ｒ，Ｒ） ＴＨＣ１００ｎｍｏｌ·Ｌ－１）。细胞培养２４ｈ后，细胞贴壁良好，铺展生长，此时吸弃培养液，置换成体积分数０ ０１的ＦＢＳ的完全培养液进行血清饥饿。血清饥饿２４ｈ后，依据上述分组置换成含有ＴＮＦ α及ＣＨＸ的的完全培养液中。造模６ｈ后，进行ＴＵＮＥＬ染色，置于Ｉｎｃｕｃｙｔｅ中拍照。
１．２．８ Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 正常培养细胞融合至０ ８时，以２ ４×１０５个细胞每孔接种于６孔板中，分别为Ｃｏｎｔｒｏｌ（０ １％ＤＭＳＯ）组；ｍｏｄｅｌ组（１０μｇ·Ｌ－１ＴＮＦ α，５ｍｇ·Ｌ－１ＣＨＸ，０ １％ＤＭＳＯ）；ＡＵ２０μｍｏｌ·Ｌ－１组（１０μｇ·Ｌ－１ＴＮＦ α，５ｍｇ·Ｌ－１ＣＨＸ，ＡＵ２０μｍｏｌ·Ｌ－１）；Ｅ２组（１０μｇ·Ｌ－１ＴＮＦ α，５ｍｇ·Ｌ－１ＣＨＸ，Ｅ２１０ｎｍｏｌ·Ｌ－１），共４组，每组３个复孔。培养２４ｈ待细胞贴壁生长良好后，按分组加入培基，造模给药６ｈ后提取总蛋白。用ＢＣＡ法进行蛋白浓度测定，取等量蛋白进行ＳＤＳ ＰＡＧＥ，半干法转膜，与相应一抗二抗结合反应后，用化学发光法检测抗原抗体结合区带。用凝胶成像分析仪进行电泳条带的拍照与分析。实验中以β ａｃｔｉｎ为内参，分别检测了ｃａｓｐａｓｅ ３、Ｂａｘ、Ｂｃｌ２、ｐ Ａｋｔ、Ａｋｔ。
１．２．９ ＴＵＮＥＬ染色 正常培养细胞融合至０ ８时，以８×１０３个细胞每孔接种于９６孔板中，将实验分为６组，每组３个复孔，分别为分别为Ｃｏｎｔｒｏｌ（０ １％ＤＭＳＯ）组；ｍｏ
ｄｅｌ组（１０μｇ·Ｌ－１ＴＮＦ α，５ｍｇ·Ｌ－１ＣＨＸ，０ １％ＤＭＳＯ）；ＡＵ２０μｍｏｌ·Ｌ－１组（１０μｇ·Ｌ－１ＴＮＦ α，５ｍｇ·Ｌ－１ＣＨＸ，ＡＵ２０μｍｏｌ·Ｌ－１）；Ｅ２组（１０μｇ·Ｌ－１ＴＮＦ α，５ｍｇ·Ｌ－１ＣＨＸ，Ｅ２１０ｎｍｏｌ·Ｌ－１）；ＡＵ＋ＭＰＰ组（１０μｇ·Ｌ－１ＴＮＦ α，５ｍｇ·Ｌ－１ＣＨＸ，ＡＵ２０μｍｏｌ·Ｌ－１，ＭＰＰ１００ｎｍｏｌ·Ｌ－１）；ＡＵ＋ＭＰＰ组（１０μｇ·Ｌ－１ＴＮＦ α，５ｍｇ·Ｌ－１ＣＨＸ，ＡＵ２０μｍｏｌ·Ｌ－１，ＭＰＰ１００ｎｍｏｌ·Ｌ－１）；ＡＵ＋（Ｒ，Ｒ） ＴＨＣ组（１０μｇ·Ｌ－１ＴＮＦ α，５ｍｇ·Ｌ－１ＣＨＸ，ＡＵ２０μｍｏｌ·Ｌ－１，（Ｒ，Ｒ） ＴＨＣ１００ｎｍｏｌ·Ｌ－１）。细胞培养２４ｈ后，细胞贴壁良好，铺展生长，此时吸弃培养液，２４ｈ后置换成含有ＴＮＦ α（１０μｇ·Ｌ－１）、ＣＨＸ（５ｍｇ·Ｌ－１）的完全培养液６ｈ后使用ＩｎＳｉｔｕＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ试剂盒进行染色，ＤＡＰＩ复染细胞核。１．２．１０ 统计学方法 实验数据均以珋ｘ±ｓ表示，采用ＳＰＳＳ１４ ０统计软件进行ｔ检验，多组间比较宜用方差分析。
２ 结果
２．１ ＡＵ能够改善心肌梗死小鼠的心功能 超声心动检测术前１ｄ，术后给药７ｄ、１４ｄ和２８ｄ左心室短轴缩短率和射血分数。结果显示，心肌梗死前组间的短轴缩短率和射血分数无显着差异，两者均具有正常的心肌功能。心肌梗死后，心肌梗死的Ｃ５７ＢＬ／６小鼠随机分组，在ｄ７、１４和２８进行相关指标的检测。结果显示，模型组、ＡＵ组及阳性药组相较于假手术组的ＥＦ％和
ＦＳ％明显降低。给药后７ｄ，ＡＵ及阳性药组与模型组之间没有显着差异。但给药后ｄ１４、２８，ＡＵ组给药效果良好，明显优于模型组（Ｆｉｇ１Ａ，Ｂ）。连续给药２８ｄ后，对来自小鼠的心脏组织进行Ｍａｓｓｏｎ染色。结果显示正常心室结构完整，心肌纤维化不明显，梗死部位无蓝色，无心室壁变薄。在模型组中，心室壁严重梗塞，纤维化，变薄和心室腔扩大，纤维化程度占整个心室壁的约４０％～５０％。非梗塞区域有松散的组织细胞和增加的空隙。给药组与模型组相比，给药组的心室壁纤维化及心室腔的变化得到改善（Ｆｉｇ１Ｃ，Ｄ）。２．２ ＡＵ能够减少急性心肌梗死小鼠心肌细胞凋亡 连续给药２８ｄ后，对来自小鼠的心脏组织进行ＴＵＮＥＬ染色。心肌细胞的凋亡可以通过ＴＵＮＥＬ＋／ＤＡＰＩ双色荧光重合信号确认，ＴＵＮＥＬ＋ｃｅｌｌ为红色，ＤＡＰＩ为蓝色。结果显示ＡＵ给药组与生理盐水组相比，ＴＵＮＥＬ＋（ｒｅｄ）信号明显减少（Ｆｉｇ２）。２．３ ＡＵ提高ＴＮＦ α／ＣＨＸ损伤模型中的心肌细胞活力 课题组前期结果表明，ＴＮＦ α／ＣＨＸ能够成功诱导心肌细胞损伤，为了确定药物浓度，本研究采用ＭＴＴ法检测不同浓度下ＡＵ对模型中细胞活力的影响，结果显示ＡＵ在２０μｍｏｌ·Ｌ－１及５０μｍｏｌ·Ｌ－１时，能够明显在ＴＮＦ α／ＣＨＸ损伤模型中增加细胞活力，差异具有统计学意义（Ｆｉｇ３）。预处理２４ｈ能够增强其保护作用。
２．４ ＡＵ能够减少ＴＮＦ α／ＣＨＸ损伤模型中的细胞凋亡 为了进一步证明ＡＵ的抗凋亡作用，本研究采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测ＴＮＦ α／ＣＨＸ损伤模型中６ｈ时ｃａｓｐａｓｅ
３、Ｂｃｌ２、Ｂａｘ、Ａｋｔ以及ｐ Ａｋｔ蛋白的表达，结果显示造模６ｈ时，模型组与对照组相比，ｃａｓｐａｓｅ ３蛋白表达增加，差异具有统计学意义；ＡＵ组与模型组相比，ｃａｓｐａｓｅ ３蛋白表达减少，Ｂｃｌ２／Ｂａｘ比例上调，其结果差异具有统计学意义（Ｆｉｇ４）。２．５ ＡＵ能够促进ＥＲα以及ＥＲβ的表达 确定
·
０
７
·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｊａｎ；３７（１）
Ｆｉｇ１ ＡＵｉｍｐｒｏｖｅｓｃａｒｄｉａｃｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｒｅｄｕｃｅｓｉｎｆａｒｃｔｓｉｚｅａｆｔｅｒＭＩ
Ａ：Ｃｈａｎｇｅｓｉｎｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｊｅｃｔｉｏｎｆｒａｃｔｉｏｎ（ＥＦ％）， Ｐ＜０ ０１ｖｓｓｈａｍ，＃Ｐ＜０ ０５ｖｓｓａｌｉｎｅ（ｎ＝６）；Ｂ：ＣｈａｎｇｅｓｉｎＬｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｆｒａｃ ｔｉｏｎａｌｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ（ＦＳ％）， Ｐ＜０ ０５， Ｐ＜０ ０１ｖｓｓｈａｍ（ｎ＝６）；Ｃ，Ｄ：Ａｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔ
ｉｖｅｉｍａｇｅａｎｄａｖｅｒａｇｅｓｃａｒａｒｅａｏｆＭａｓｓｏｎ’ｓＴｒｉｃｈｒｏｍｅｓｔａｉ ｎｉｎｇｏｎｄａｙ２８
，ｒｅｓｕｌｔｓａｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｓ珋ｘ±ｓ， Ｐ＜０ ０５ｖｓｓａｌｉｎｅ（ｎ＝３）
．Ｆｉｇ２ ＡＵｉｎｈｉｂｉｔｓａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｍｙｏｃａｒｄｉａｌｃｅｌｌｓａｆｔｅｒＭＩＴｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｍｙｏｃａｒｄｉａｌｃｅｌｌｓｗａｓａｓｓｅｓｓｅｄｂｙｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇａＴＵＮＥＬａｓｓａｙｏｎｄａｙ２８．ＴＵＮＥＬｓｔａｉｎｉｎｇｗａｓｖｉｓｕａｌｉｚｅｄｕｎｄｅｒｆｌｕｏｒｅｓ ｃｅｎｃｅ，ｃｅｌｌｓｐｏｓｉｔｉｖｅｆｏｒＴＵＮＥＬａｐｐｅａｒｅｄｒｅｄｉｎｃｏｌｏｒ，ａｎｄＤＡＰＩａｐ ｐｅａｒｅｄｂｌｕｅ（ｎ＝３，ｓｃａｌｅｂａｒ：２５μｍ）．
ＡＵ的抗凋亡作用后，本研究进一步对ＡＵ如何影响凋亡做了进一步的探讨，采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂ
ｌｏｔ方法检测ＡＵ对心肌细胞中ＥＲα以及ＥＲβ的表达的影响，结果显示ＡＵ能够明显促进心肌细胞中ＥＲα以及
ＥＲβ的表达，差异具有统计学意义（Ｆｉｇ５）。２．６ ＥＲβ抑制剂能够减弱ＡＵ的抗凋亡作用 为了探讨ＡＵ是否通过激活雌激素受体抑制细胞凋亡，本研究采用ＴＵＮＥＬ法检测ＥＲα的抑制剂Ｍ
Ｐ
ＰＦｉｇ３ ＡＵｉｍｐｒｏｖｅｓｍｙｏｃａｒｄｉａｌｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙａｇａｉｎｓｔＴＮＦ α
／ＣＨＸｔｒｅａｔｍｅｎｔＣｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙｗａｓｅｖａｌｕａｔｅｄｂｙａｎＭＴＴａｓｓａｙ，Ｐｒｅｍｅａｎｓｔｈｅｐｒｅ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＡＵ．Ｒｅｓｕｌｔｓａｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｓ珋ｘ±ｓ， Ｐ＜０ ０５， Ｐ＜０ ０１ｖｓｃｏｎｔｒｏｌ；＃Ｐ＜０ ０５，＃＃
Ｐ＜０ ０１ｖｓｍｏｄｅｌ（ｎ＝４）．
·
１７·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｊａｎ；３７（１）
Ｆｉｇ４ ＡＵｉｎｈｉｂｉｔｓａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙＴＮＦ α
／ＣＨＸＴｈｅｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐｗａｓｔｈｅｃｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆ１０μｇ·Ｌ－１ＴＮＦ αａｎｄ５ｍｇ·Ｌ－１ＣＨＸａｆｔｅｒ６ｈ．ＴｈｅＡＵｇｒｏｕｐｗａｓｏｎｔｈｅｓａｍｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｗｉｔｈｐｒｅｔｒｅａｔ ｍｅｎｔｏｆ２０μｍｏｌ·Ｌ－１ＡＵａｆｔｅｒ２４ｈ．Ｒｅｓｕｌｔｓａｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｓ珋ｘ±ｓ， Ｐ＜０ ０１ｖｓｃｏｎｔｒｏｌ；＃Ｐ＜０ ０５，＃＃Ｐ＜０ ０１ｖｓｍｏｄｅｌ（ｎ＝３）
．
Ｆｉｇ５ ＡＵｐｒｏｍｏｔｅｓＥＲαａｎｄＥＲβｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎＨ９ｃ２ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｂｙ１０μｍｏｌ·Ｌ－１ａｎｄ２０μｍｏｌ·Ｌ－１
ＡＵａｆ ｔｅｒ２４ｈ．Ｒｅｓｕｌｔｓａｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｓ
珋ｘ±ｓ， Ｐ＜０ ０５， Ｐ＜０ ０１ｖｓｃｏｎ ｔｒｏｌ（ｎ＝３）．
和ＥＲβ的抑制剂（Ｒ，Ｒ） ＴＨＣ对给药后ＴＮＦ α／ＣＨＸ损伤模型中凋亡的影响。结果显示，
ＭＰＰ对ＡＵ的心肌细胞保护作用无明显影响；而加入（Ｒ，Ｒ） ＴＨＣ后，细胞凋亡数量较ＡＵ组有明显上升，其结果差异具有统计学意义（
Ｆｉｇ６）。本研究证明，ＡＵ能够激活ＥＲβ发挥心肌保护作用。
３ 讨论
ＡＵ是杜仲等中药的活性成分之一，本研究发现ＡＵ可使ＥＲβ表达升高，抑制心肌细胞凋亡，并且加入ＥＲβ抑制剂可阻断ＡＵ的抗凋亡作用。表明ＡＵ可以通过激活ＥＲβ通路，发挥抗心肌缺血损伤从而改善急性心肌梗死后心功能的作用。
植物雌激素是对具有雌激素相似结构，能够作用于雌激素受体的一类化合物的统称。课题组前期研究证实ＡＵ是一种具有植物雌激素样作用的小分
子，能够激活雌激素受体［１２］
。雌激素受体ＥＲ于发
现于１９５８年，其中ＥＲβ分布于卵巢、
中枢神经系统、心血管系统、肺、结肠、肾脏和免疫系统中［１３］。
心血管系统功能异常是临床绝经期综合征表现的重
要方面之一，Ｚｈａｎｇ等［９］研究发现，Ｔｇ ＥＲβ转基因
小鼠的心肌组织Ⅰ型胶原、α ＳＭＡ、ＴＧＦ βｍＲＮＡ的表达水平明显低于野生型小鼠，说明ＥＲβ有助于抑制心肌梗死后心肌纤维化和重塑过程，提高心肌抗
纤维化能力。同时，Ｗａｎｇ也研究发现将ＥＲβ敲除后，ＰＩ３Ｋ和Ａｋｔ磷酸化水平下调，ｃａｓｐａｓｅ ３和ｃａｓｐａｓｅ ８的表达增加，Ｂｃｌ ２蛋白表达水平降低，证明ＥＲβ可能是通过调节Ｐ
Ｉ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路改善急性心肌梗死患者的心功能［８］
。
本研究采用ＴＮＦ α和ＣＨＸ共同诱导心肌细胞损伤模型，探讨了ＡＵ抗心肌细胞损伤作用及其与ＥＲ信号通路的相关性。ＴＮＦ α能够与膜受体ＴＮ ＦＲＩ或ＴＮＦＲＩＩ结合，激活凋亡通路，同时刺激ＴＮＦ抗凋亡因子（ＴＮＦａｐｏｐｔｏｓｉｓｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｆｒａｃｔｉｏｎ，ＴＡＰＦ）的生成，而ＣＨＸ能够抑制ＴＡＰＦ阻断ＴＮＦ α激活的
·２
７·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｊａｎ；３７（１）
