FKBP38可调控多巴胺能神经元的凋亡

更新时间:2023-06-14 23:09:11 阅读: 评论:0

网络出版时间:2022-12-0918:33:20 网络出版地址:https://kns.cnki.net/kcms/detail//34.1086.R.20221209.1428.020.html
FKBP38可调控多巴胺能神经元的凋亡
刘 静,谢彩婷,封文斌,赵文卓,李芳红,吴晓丽,赵子建
(广东工业大学生物医药学院,广东广州 510006)
收稿日期:2022-08-22,修回日期:2022-11-24
基金项目:国家自然科学基金资助项目(No82003615);国家重点研
非税收入票据发计划(No2018YFA0800603);广东省重点领域研发计划“新药创制”专项(No2019B020201015);广东省创新团队(
No2016ZT06Y432);广东省高校高水平科研项目(No20ZK0230)
作者简介:刘 静(1995-),女,硕士生,研究方向:FKBP38对帕金
森病的治疗,
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E mail:18086471761@163.com;吴晓丽(1988-),女,博士,讲师,研究方向:神经退行性疾病机制研究及药物开发,通信作者,E mail:wuxiaoli@gdut.edu.cn;
赵子建(1962-),男,博士,教授,博士生导师,研究方向:慢性疾病与创新药物,通信作者,E mail:azzhao@gdut.edu.cn
doi:10.12360/CPB202201094
文献标志码:A文章编号:1001-1978(2023)01-0090-07中国图书分类号:R 332;R329 25;R742 5;R745 7;R977 6摘要:目的 研究FKBP38在鱼藤酮诱导的帕金森病(Par kinson’sdiseasePD)细胞模型中抑制凋亡的作用。方法 体内实验:构建MPTP所致的PD体内模型,检测PD小鼠脑中α synuclein、TH和FKBP38的表达。体外实验:使用鱼藤酮刺激多巴胺能神经元MN9D细胞构建PD体外模型;采用Westernblot检测PD体外模型中α synuclein、TH、Tom20和FKBP38的表达水平;将FKBP38慢病毒转入MN9D细胞构建稳定过表达及敲减FKBP38的细胞株;采用CCK 8法检测过表达及敲减FKBP38的细胞在受到鱼藤酮刺激后的
细胞活力;通过Westernblot检测PD细胞模型中抗凋亡蛋白Bcl 2和凋亡蛋白B
ax的表达水平。结果 在PD体内外模型中,
FKBP38蛋白表达水平均明显地下调(P<0 01)。而敲减FKBP38后加剧了鱼藤酮造成的多巴胺能神经元细胞活力下降(P<0 05),而过表达FKBP38却可明显地改善鱼藤酮造成的多巴胺能神经元细胞活力下降(
P<0 05),并且,Westernblot结果表明,过表达FKBP38可明显地上调PD多巴胺能神经元中抗凋亡蛋白Bcl 2的表达水平及升高Bcl 2/Bax的比值(P<0 05)。结论 在PD细胞模型中,调控FK BP38可改善多巴胺能神经元凋亡。
关键词:帕金森病;鱼藤酮;MN9D细胞;细胞活力;凋亡;FK BP38
开放科学(资源服务)标识码(OSID):
  帕金森病(Parkinson’sdiseasePD)又称为震颤麻痹,是一种影响患者活动能力的中枢神经系统慢
性疾病,起病隐袭,进展缓慢[
1]
。其主要病理特征是中脑黑质致密部多巴胺能神经元损伤,神经元内出现以α 突触核蛋白(α
synuclein)为关键成分的路易小体(Lewybody),进而引起神经元变性、凋亡,
导致脑部多巴胺水平降低[
2]
。文献研究表明,减少多巴胺神经元凋亡可一定程度改善PD的症状。目前临床上用于治疗P
D的药物(司来吉兰和美多巴)均是通过提高多巴胺水平,从而减少神经元凋亡。然而,这些药物只能改善PD症状,并不能阻止病情
的进展,也无法治愈疾病[
1-3]
。因此,寻找新的靶点,在PD发病早期进行基因修饰,抑制神经元凋亡,进而改善PD症状,是极为迫切的事情。
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FK506结合蛋白38(FKBP38)是FKBP家族蛋白之一,特征在于其相应的mRNA在人脑组织中显
著表达[4]
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,包含FK506结合域并表现出肽基脯氨酰异构酶活性[5-6]。在小鼠胚胎发育过程中,FKBP38可通过拮抗Shh通路延缓神经管的关闭[7-8]。并且
FKBP38的丢失还会导致后神经管细胞凋亡增加和
发育异常[9]。此外,还有研究表明FKBP38通过其
C端跨膜结构域锚定在线粒体外膜上,招募并帮助
抗凋亡蛋白Bcl 2来抑制细胞凋亡[10-11]。这提示FKBP38可能是一种重要的细胞凋亡抑制剂[12]。但
是,尚未有研究报道F
KBP38在帕金森病中对多巴胺能神经元的作用。
因此,本文旨在探讨在PD体内外模型中FK BP38蛋白表达情况,并选用神经毒素诱导的PD体外模型,研究过表达和敲减FKBP38后,对多巴胺能神经元凋亡的作用。1 材料与方法1.1 材料
1.1.1 实验动物 8周龄♂的C57BL/6小鼠30只,体质量(20~25)g,购买于广东省医学实验动物中心(广东佛山,编号:44007200085200)。小鼠每笼5只,饲养温度(21~25)℃,12h昼夜交替,自由饮水摄食,每周更换3~4次垫料,动物在开展实验
前先适应性喂养1周。
1.1.2 细胞和慢病毒 MN9D(小鼠中脑多巴胺神经元)细胞购自广州吉尼欧公司。FKBP38慢病毒载体购自广州赛业公司,慢病毒载体为LV EFS>mFKbP8 PGK>Puro和LV CMV>eGFP/T2A/Puro(以下分别简写为OV FKBP38及OV NC),LV U6>mFKbP8[shRNA#2] PGK>Puro和LV U6>Scram ble shRNA PGK>EGFP/T2A/Puro(以下分别简写为sh NC及sh FKBP38),该慢病毒中含有FKBP38全长cDNA,所有结构都经DNA测序验证,转染效果经免疫印迹(Westernblot)验证。
1.1.3 试剂 RPMI1640(Lot:PM150110A)购自武汉普诺赛公司;胎牛血清购自于美国Gibco公司;胰酶(Lot:2120649)购买于美国Gibco公司;CCK 8(cellcountingkit 8,批号:G909FA003)购自上海生物工程有限公司;DMSO购自于美国sigmaaldrich公司;FKBP38抗体购自R&D公司;α synuclein、Tom20和Bax抗体购自美国CST公司;Bcl 2抗体购自英国Abcam公司;TH抗体购买于美国Gibco公司;鱼藤酮和MPTP购自中国阿拉丁公司;MPP+购买于美国Sigma公司。
1.1.4 仪器 二氧化碳培养箱CLM 170B 8 NF型(ESCO,新加坡);二级生物安全柜AC2 4S1型(ES CO,新加坡);EPED 2TF纯水仪(中国);DYY 6C电泳仪(中国);多管架自动平衡离心机TDZ5 WS型(上海卢湘仪离心机仪器有限公司);流式细胞仪(DXPAthenaTM,美国);Leica倒置显微镜(Leica,德国);酶标仪CMAXPLUS+(美国);化学发光凝胶成像系统ChemiDoc+XRS(Bio Rad,美国)。1.2 方法
1.2.1 小鼠分组及给药 小鼠随机分为2组,每组15只:对照组、模型组。以腹腔注射的方式给予模型组小鼠10mg·kg-1的MPTP,给予对照组小鼠相同体积的PBS。3d注射1次,连续注射7次,在末次注射后的d2进行脱颈椎处死小鼠,立即取脑,冰上操作,剥离纹状体和
黑质,液氮速冻,后转至-80℃保存备用。
1.2.2 细胞培养及药物处理 MN9D细胞用添加10%胎牛血清的RPMI1640培养基,于37℃、5%二氧化碳细胞培养箱中进行常规培养,每隔1天进行换液,2~3d进行传代,待细胞密度为85%左右,根据不同条件进行刺激。鱼藤酮及MPP+采用完全培养基溶解,刺激细胞时采取全换液的方式进行。1.2.3 细胞分组及感染 将MN9D细胞分为FK BP38过表达组(OV FKBP38)及对照组(OV NC)、敲减FKBP38组(sh FKBP38)及对照组(sh NC),将细胞铺板接种于6孔板,每孔接种细胞数2×105个,放置于培养箱常规培养。待细胞密度长于30%~50%时进行感染慢病毒实验,收集细胞提蛋白进行Westernblot检验慢病毒感染效率。
1.2.4 CCK 8法检测细胞增殖活性 将生长状态良好的MN9D细胞及转染慢病毒成功后的细胞制备成单细胞悬液并铺板接种于96孔板,每孔100μL细胞悬液,每孔接种细胞数2×104个,放置于培养箱常规培养。实验分组为不同浓度(8、4、2、1、0 5、0 25、0 125、0)μmol·L-1的鱼藤酮处理MN9D组,及同浓度鱼藤酮分别处理OV NC、OV FKBP38、sh NC、sh FKBP38组。过夜培养待细胞贴壁后,吸出原培养基,更换为提前配好不同浓度鱼藤酮药物的培养基;继续放置培养箱培养不同时间后,向每孔添加10μLCCK 8溶液,贴壁加入以免产生气泡,避光孵育,1~2h后取出,用酶标仪测定在450nm处的吸光度(A值)
1.2.5 Westernblot检测蛋白水平 在10cm细胞培养皿中加入200μLRIPA裂解液,裂解液含(RI PA、PMSF、蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂),用无菌细胞刮缓慢刮下,置于冰上裂解10min,超声破碎1~2次,每次30s,4℃离心机12000r·min-1离心20min后,取上清于另一干净Ep管中,蛋白定量BCA法检测待测样品浓度。待测样品与5×上样缓冲液稀释混合,金属浴10min。取同等质量蛋白样品在质量分数10%或12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)进行电泳,恒压转膜至PVDF膜,室温下用5%脱脂奶粉封闭1h或4℃过夜封闭。分别加一抗α-syn(1∶1000)、FKBP38(1∶500)、Bax(1∶1000)、TH(1∶1000)、Tom20(1∶1000)、Bcl 2(1∶2000)、β-actin(1∶5000),4℃孵育过夜。过夜孵育后TBST洗膜3次,二抗室温孵育1h,再次TBST洗膜3次,ECL发光成像仪曝光。并应用ImageJ软件对目标蛋白和内参蛋白灰度值进行分析,相对表达量=目的蛋白灰度值/内参灰度值。1.2.6 统计学方法 采用GraphPadPrism8 0软件进行数据处理,符合正态分布的计量资料以珋x±s表示,多组间比较采用单因素方差分析(ANOVE),组间多重比较采用Tukey法。
2 结果
2.1 PD体内模型中FKBP38表达情况 如Fig1所示,通过Westernblot检测MPTP诱导的PD体内模型。结果显示,在小鼠脑纹状体和黑质区域,α synuclein蛋白的表达量水平明显升高(P<0 01),
TH表达量水平明显下降(P<0 01)(Fig1A)。而在MPTP诱导的PD小鼠脑纹状体区域中FKBP38表达水平明显下降(P<0 01),在黑质区域中FK BP38表达量无明显变化(Fig1B),说明在MPTP诱导的P
D体内模型中FKBP38在纹状体中特异性下调,提示FKBP38与PD模型中的特异性蛋白(α sy nuclein和TH)存在相关性。
2.2 PD细胞模型中FKBP38表达情况 如Fig2所示,通过Westernblot检测鱼藤酮/MPP+(4μmol
·L-1)/(3mmol·L-1)处理MN9D细胞24h后的
α synuclein、TH、Tom20、FKBP38的表达。结果显示,在鱼藤酮刺激MN9D诱导的PD细胞模型中,α synuclein表达水平明显升高(P<0 01),TH表达水
平明显下降(
P<0 05),表明鱼藤酮诱导的PD细胞模型构建成功(Fig2A),Tom20的表达水平没有变化,而FKBP38表达水平明显下降(P<0 01)(Fig2B),表明FKBP38在鱼藤酮诱导的PD细胞模型中特异性降低。
2.3 稳定过表达FKBP38的MN9D细胞株的建立 如Fig3所示,利用携带FKBP38的慢病毒感染MN9D细胞。随后,我们利用Westernblot检测FKBP38的表达水平。与MN9D组相比,OV NC组和s
h NC组的FKBP38表达量均没有明显变化,说明选择的载体合适。与OV NC组相比,OV FKBP38组的FKBP38表达量明显上升(P<0 05),说明FKBP38过表达细胞构建成功。与sh NC组相比
Fig1 ExpressionofFKBP38proteininstriatumandsubstantianigraofPDmodel(珋x±s,n=3)
72小时是什么字  A:α
synuclein/THexpressioninstriatumandsubstantianigra;B:FKBP38expressioninstriatumandsubstantianigra. P<0 05,  P<0 01vscontro
Fig2 ExpressionofFKBP38inPDcellmodel(珋x±s,n=3)
A:α
synuclein/THexpressioninPDcells;B:Tom20/FKBP38expressioninPDcells. P<0 05,
P<0 01vscontrol坐过山车
Fig3 FKBP38lentiviraltransfectionofMN9Dcells(珋x±s,n=3)    P<0 01vscontrol
sh FKBP38组的FKBP38表达量明显下降(P<0 05),说明FKBP38敲减细胞构建成功。
2.4 鱼藤酮抑制MN9D细胞活力 如Fig4所示,CCK 8检测不同浓度(8、4、2、1、0 5、0 25、0 125、0)μmol·L-1的鱼藤酮处理MN9D细胞8h后,结果显示,显著抑制细胞增殖(Fig4A)(P<0 01),4μmol·L-1浓度时,细胞活力下降到对照组的49 52%,且用鱼藤酮(4μmol·L-1)处理MN9D细胞不同时间,发现随着处理时间的增加,细胞活力降低加剧(Fig4B)(P<0 01)处理8h时,细胞活力为对照组50 08%。因此,选用鱼藤酮(4μmol·L-1)处理MN9D细胞8h进行后续研究。
2.5 FKBP38对PD细胞活力下降的影响 如Fig5所示,鱼藤酮处理MN9D细胞8h后,与sh NC组模型组相比,sh FKBP38组模型组的细胞活力明显下降(Fig5A)(P<0 01),表明FKBP38敲减后加剧PD细胞活力下降。而与OV NC组模型组相比,OV FKBP38组模型组的细胞活力明显增强(Fig5B)(P<0 01),表明过表达FKBP38可以明显改善PD细胞活力下降。
2.6 FKBP38对PD细胞凋亡的影响 如Fig6所示,Westernblot检测结果显示,与对照组相比,模型组经鱼藤酮处理MN9D细胞8h后,抗凋亡蛋白Bcl 2的表达明显下调(P<0 05),凋亡蛋白Bax的表达没有差异,但Bcl 2/Bax比值降低(P<0 05),表明鱼藤酮引起了多巴胺能神经元的凋亡。与OV NC组模型组相比,OV FKBP38组模型组的Bcl 2蛋白表达上升(P<0 01),Bax
的表达量没有差异,
Fig4 EffectofrotenoneonviabilityofMN9Dcells(珋x±s,n=3)A:EffectsofdifferentconcentrationsofrotenoneontheviabilityofMN9Dcells;B:EffectsofrotenoneontheviabilityofMN9Dcellsatdif ferenttimepoints, P<0 05,  P<0 01vscontro
Fig5 EffectofFKBP38ondecreasedviability
ofPDcells(珋x±s,n=3)
A:Effectofsh FKBP38expressioninPDcells;B:EffectofFKBP38overexpressioninPDcells.  P<0 01vscontrol;##P<0 01vsModel
Fig6 EffectofFKBP38overexpressiononexpressionofBcl 2,BaxproteininPDcells(珋x±s,n=3)A:Weste
rnblotanalysisofBcl 2andBaxproteins;B:EffectofoverexpressionofFKBP38ontheratioofBcl 2/BaxproteininPDcells;C:EffectofknockdownofFKBP38onBcl 2/BaxproteinratioinPDcells. P<0 05,  P<0 01vscontrol;##P<0 01vscontrol
Bcl 2/Bax比值上升(P<0 01),说明过表达FK
BP38可以明显改善鱼藤酮引起的多巴胺能神经元
凋亡。与sh NC组模型组相比,sh FKBP38组模型
组的Bcl 2和Bax的表达量均无明显差异,表明敲
减FKBP38无明显加剧鱼藤酮引起的多巴胺能神经
元凋亡。
3 讨论
  帕金森病是一种进展非常缓慢的疾病,发病因
素复杂,且不同患者病情轻重也存在很大的差
异[13]。多巴胺是一种神经递质,将信息从一个神经
细胞传至另一个神经细胞,保证神经的传导性,由多
巴胺能神经元合成并储存在囊泡中,而后通过胞裂
外排的方式由神经元释放,多巴胺能神经元的病变
会导致帕金森病。这也是临床上导致PD的主要病
理特征,减少神经元凋亡对缓解PD进程有重要作立冬是什么意思
用[14]。目前,关于帕金森病治疗手段只能延缓但无
法阻止疾病的进展[15]。基因治疗是帕金森病治疗
的新兴领域,由于其发病机制复杂,其中线粒体功能
阴历七月十五障碍在帕金森病发生中具有重要作用[16-17]。因此
以线粒体相关基因为靶点寻找新的治疗方法具有重
要意义。同时,应深入研究线粒体功能障碍分子机
制,明确线粒体相关基因对帕金森病的影响。
为研究FKBP38对神经毒素诱导的帕金森病的
影响,本课题组检测在PD体内外模型中FKBP38表
达水平,实验结果发现,在PD体内模型中,与正常
组相比模型组小鼠脑纹状体区域中FKBP38表达水
平明显降低。同样,在PD细胞模型中,与正常组相
比FKBP38表达水平明显特异性降低。猜测高表达
FKBP38可能会延缓多巴胺神经元凋亡从而缓解PD
进程。为进一步探究FKBP38对帕金森病的影响,
我们在体外实验中通过使用FKBP38慢病毒转染
MN9D细胞来检测其表型变化。实验结果显示,鱼
藤酮可明显降低MN9D细胞活力,并通过降低Bcl 2
的表达量引起MN9D细胞凋亡。而过表达FKBP38
后能明显改善鱼藤酮引起的细胞活力下降,表明过
表达FKBP38可明显提高PD细胞活力。过表达
FKBP38后,抗凋亡蛋白Bcl 2的表达量明显升高,
Bcl 2/Bax比值明显升高,表明过表达FKBP38改善

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