CHINESE JOURNAL OF ANATOMY V ol.42 No.1 2019 解剖学杂志 2019年第42卷第1期
脱细胞支架联合电针对坐骨神经损伤大鼠脊髓前角运动神经元的保护作用*
郭雨佳 姜晶晶 李 雅 付欣雅 孟德源 郝宇菲 尤俊巧 张银娟 付秀美△
（承德医学院，承德 067000）
摘要 目的：
探讨脱细胞支架（AS ）联合电针对坐骨神经损伤（SNI ）大鼠脊髓前角运动神经元的保护作用。方法：首先制备AS ，用于桥接损伤的神经。其次切除大鼠右侧坐骨神经10 mm ，建立大鼠SNI 模型。将SNI 模型大鼠随机分为模型组（M ）、AS 桥接组（AS ）和AS 联合电针治疗组（AST ）。模型组不予任何干预，AS 组将支架桥接于两断端处，AST 组在支架桥接术后2 d 给予电针进行治疗，采用20 Hz 、1 mA 疏密波相间的电流，针刺穴位为环跳和阳陵泉，每次电针15 min ，7 d 1个疗程。电针4周后，用电生理记录仪检测各组大鼠坐骨神经传导速度和波幅，用尼氏染色观察各组大鼠脊髓前角运动神经元的形态结构，用免疫印迹检测各组大鼠脊髓脑源性神经营养因子（BDNF ）和神经生长因子（NGF ）蛋白的表达。结果：AST 组大鼠坐骨神经传导速度和波幅明显高于AS 组；尼氏染色显示AST 组脊髓前角运动神经元胞体形态较完整，尼氏体呈蓝紫色、斑块状，偶见部分核移位现象，尼氏体的数量明显多于AS 组和模型组；免疫印迹结果显示AST 组脊髓内BDNF 和NGF 蛋白表达量均高于AS 组和模型组。
结论：脱细胞支架联合电针不仅可增加大鼠坐骨神经传导速度及波幅，还可阻止脊髓前角运动神经元中尼氏体肿胀与溶解，并可上调脊髓内BDNF 和NGF 蛋白的表达，对SNI 所致的脊髓前角运动神经元损伤有保护作用。关键词 脱细胞支架；电针；脊髓；脑源性神经营养因子；神经生长因子
Protective effect of acellular scaffolds combined with electroacupuncture on the motor
neurons in anterior horn of spinal cord in rats with sciatic nerve injury *
Guo Yujia ， Jiang Jingjing ， Li Ya ， Fu Xinya ， Meng Deyuan ， Hao Yufei ， You Junqiao ， Zhang Yinjuan ， Fu Xiumei △
（Chengde Medical College ， Chengde 067000， China ）Abstract Objective ： To investigate the protective effect of acellular scaffolds （AS ） combined with electroacupuncture （EA ） on the motor neurons in anterior horn of spinal cord in rats with sciatic nerve injury （SNI ）. Methods ： Firstly AS were prepared for bridging injured nerves. Then the right sciatic nerves were excid 10 mm and the SNI model was established. The rats of the SNI model were randomly divided into model group （M ），AS bridge group （AS ），and AS combined with EA treatment group （AST ）. The rats in the model group received no intervention after SNI. The rats in the AS group were bridged with AS ，and the rats in the AST group were treated with EA 2 days after bridging surgery ，
and then the current with rarefaction and den waves was adopted by 20 Hz ，1 mA. Huantiao and Yanglingquan were lected as the acupuncture points. Each EA lasted 15 minutes and 7 days as a cour of treatment. 4 weeks after EA ，sciatic nerve conduction velocity and amplitude were measured by electrophysiological recorder. Morphological structure of motor neurons in anterior horn of spinal cord was obrved by Nissl staining. The expression of brain-derived neurotrophic factor （BDNF ） and nerve growth factor （NGF ） were detected by Western blotting. Results ： The conduction velocity and amplitude of sciatic nerve in AST group were significantly higher than that in AS group. Nissl staining showed that neuronal soma of the anterior horn motor neurons in AST group was intact. Nissl bodies were blue and purple plaques. The number of Nissl bodies was higher than that in AS and M groups. The results of Western blotting showed that the expressions of BDNF and NGF protein in AST group were higher than tho in AS and M groups. Conclusion ： AS combined with EA not only increas the conduction velocity and amplitude of sciatic nerve in rats ，but also prevents the swelling and dissolution of Nissl bodies in anterior horn motor neurons in the spinal cord ，upregulates the expression of BDNF and NGF protein in the spinal cord ，so they have protective effect on the motor neurons in anterior horn of the
spinal cord in rats with SNI.
Key words acellular scaffolds ； electroacupuncture ； spinal cord ； brain-derived neurotrophic factor ； nerve growth factor
* 河北省教育厅基金（QN2014138）； 河北省重点发展学科“人体解剖与组织胚胎学”建设资助项目； 河北省承德医学院大学生创新创业国家级项目（201702）； 承德医学院高层次人才科研启动基金（201704）第1作者E-mail ：
△
通信作者，E-mail ：
收稿日期：2018-10-01；修回日期：2018-11-28
doi ： 10.3969/j.issn.1001-1633.2019.01.006
·论 著·寒假社会实践心得体会
坐骨神经损伤（sciatic nerve injury ，SNI ）多因
股部、臀部、腰部等处的组织受到伤害而引起发病，导致肌肉急剧的疼痛以及萎废性失用等症状，因
此中医学将其归属于“痹证”、“痿证”的范畴[1-2]。在临床治疗中，短距离的神经缺损可实施端-端吻合，长距离的神经缺损因无法进行端-端吻合故需要移植物桥接[3]。脱细胞支架（acellular scaffolds，AS）是采用化学除垢剂方法将带有抗原性的细胞和髓鞘成分去除，保留了施万细胞完整的基底膜，经实验证实具有免疫原性低且组织相容性好的优点，因此在修复长距离神经缺损中可作为良好替代物[4-5]。电针疗法则是利用中医学和物理学的原理，结合针刺和电流的作用，先于相应穴位针刺得气，后将电针连于针柄处，给予一定量的电流刺激，治疗疾病的一种方法[6]。本研究将AS与电针联合用于SNI 大鼠的治疗，通过检测坐骨神经传导速度及波幅、观察脊髓内前角运动神经元的形态结构以及检测脊髓内脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）和神经生长因子（nerve growth factor，NGF）的表达，探讨脱细胞支架联合电针对SNI 大鼠脊髓前角运动神经元的保护作用。
1 材料和方法
1.1 药物和试剂
脱氧胆酸钠、Triton X-100（Sigma）；蛋白裂解液、BCA 蛋白定量试剂盒、ECL发光液、尼氏染液（均购自北京鼎国生物技术有限公司）；BDNF 及NGF 抗体（Santa Cruz）；小鼠抗GAPDH抗体（Vazyme，USA）；兔/小鼠抗IgG-HRP二抗（Cell Signaling）。
1.2 实验动物分组和处理
SPF级雄性SD 大鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK （京）2016-0011），体质量180～220 g。其中6只大鼠用于制备AS，18只大鼠用于SNI 模型的制备。首先制备SNI 模型：分离大鼠右侧的坐骨神经，于梨状肌下缘约5 mm 处，切除坐骨神经10 mm。然后将模型大鼠随机分为模型组（M）、AS 桥接组（AS）、AS联合电针治疗组（AST）。模型组不予任何干预，AS 和AST 组均将AS桥接于两断端处，AST 组在AS 桥接术后2 d 给予电针进行治疗，采用20 Hz、1 mA疏密波相间的电流针刺穴位为环跳和阳陵泉，每次电针15 min，7 d 为1个疗程，共计4个疗程。术后各组于手术显微镜下用10-0缝合线缝合神经外膜，4-0的缝合线缝合肌肉和皮肤。电针治疗4 周后取材。
1.3 AS 的制备
AS 的制备方法依据参考文献 [7]。首先采用10％的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，在无菌条件下，应用显微剪切取双侧的坐骨神经，长度约为15 mm。然后仔细剥除神经外膜上的脂肪组织，并将其放置于专用盒里进行脱细胞处理。具体方法如下：将切取的神经先于蒸馏水中浸浴12 h；而后放于4.0％ Triton X-100中消化12 h；经过蒸馏水漂洗3 h 后；将其置于3％脱氧胆酸钠溶液中，并于脱色摇床上不间断振荡12 h（设置速率为100次/分）；重复以上步骤1 次；于蒸馏水中漂洗过夜；最后置于含有抗生素的0.01 mol/L PBS 中，4℃保存备用。
1. 4 检测各组大鼠坐骨神经传导速度和波幅
电针治疗4 周后，采用BL-420 神经电生理记录仪检测各组大鼠的坐骨神经传导速度和波幅。设定条件为：刺激强度：1～20 mA、频率：l Hz、时间：0.1～0.2 ms。记录如下：将大鼠麻醉，充分暴露坐骨神经（从近端至腓总神经入肌点处）。将钩形银针电极的两端分别放置于AS 的远端和近端，按照近端刺激、远端记录的原则，使用精度为0.2 mm 的游标卡尺进行两电极间距离的测量，从而测定得出坐骨神经传导速度及波幅。
1. 5 尼氏染色观察各组大鼠脊髓前角运动神经元的形态结构
取各组大鼠脊髓，经梯度蔗糖脱水、OCT 包埋后行冰冻切片，片厚度为30 μm。按照尼氏染液的说明书进行操作，以脊髓前角运动神经元内尼氏体被染成蓝紫色为成功着色的标准。光镜下观察各组大鼠脊髓前角运动神经元胞体形态结构的变化情况。
1. 6 免疫印迹检测各组大鼠脊髓BDNF 和NGF 蛋白
提取各组大鼠位于脊髓腰骶膨大处的蛋白，采用BCA 蛋白试剂盒进行蛋白定量。以40 μg上样量，10μl上样体积配置上样体系，进行S D S-PAGE 凝胶电泳。依次经过转膜，封闭，一抗为兔抗BDNF（1∶200）和NGF（1∶200）、小鼠抗GAPDH （1∶10 000），4℃孵育过夜，兔/小鼠抗IgG-HRP
二抗，37℃孵育1 h，最后采用ECL 发光，进行目的蛋白条带的标识。采用Quantity One 软件对反应条带进行分析，以目的条带和GAPDH 条带的灰度比值作为目的蛋白的相对表达水平。
1. 7 统计学处理
实验数据以x±s表示，用SPSS 17. 0 软件进行数据处理，组间比较用单因素方差分析，两两比较采用q检验。
2 结果
2.1 坐骨神经传导速度和波幅
电针治疗4 周后，AS 组（图1A ）坐骨神经传导速度和波幅明显低于AST 组（图1B ）（P ＜0.05）（表 1）。
2.2 脊髓前角运动神经元尼氏染色
光镜下，可见脊髓前角运动神经元中尼氏体着色为蓝紫色、呈斑块状。模型组脊髓前角运动细胞中尼氏体数量较少，前角运动神经元胞体肿胀，可见部分尼氏体溶解、结构不完整（图2A ）。AS 组和AST 组尼氏体数量明显增多，相对于AS 组（图2B ），AST 组尼氏体呈规则的斑块状、着色较均一、
结构较规整，胞核大多居中，偶见核移位现象（图2C ）。采用IPWIN60 分析结果显示AST 组和AS 组尼氏小体的数量明显多于模型组（P ＜0.05）（图2D ）。2. 3 脊髓BDNF 和NGF 蛋白的表达
BDNF 和NGF 蛋白的免疫印迹条带（图3A ）和定量分析结果（图3B ）显示，AST 组大鼠脊髓内BDNF
3 讨论
神经元的胞体是其结构和功能的中心，只要胞体完好无损，神经元则可维持正常的生理功能、神经纤维就可保持旺盛的再生能力。SNI 后发生了一系列的改变，最早是损伤远端神经纤维的Wallerian 变
表1 AS 和AST 组坐骨神经传导速度和波幅的比较(n =6，x ±s )Tab 1 Conduction velocity and amplitude of sciatic nerve
in AS and AST groups (n =6，x ±s )
Group Conduction velocity （m/s ）
Amplitude （mV ）AS group 2.59±0.62 1.23±0.128AST group
7.24±0.54*
2.95±0.136*
*
P ＜0.05 vs AS group
2A
2B
2C 图2 脊髓前角运动神经元尼氏染色结果，×400。*P ＜0.05 vs 模型组。A ：模型组；B ：AS 组； C ：AST 组；D ：定量分析图.
图3 免疫印迹检测脊髓BDNF 和NGF 蛋白，**
P ＜0.01 vs AST 。A ：脊髓BDNF 和NGF 蛋白的表达；B ：定量分析图.
Fig 2 N issl staining results of motor neurons in the anterior horn of the spinal cord ，×400. *
P ＜0．05 vs Model group. A ： Model group ；B ： AS group ；C ： AST group ；D ： Quantitative analysis of histogram.Fig 3 D etection of BDNF and NGF protein in spinal cord by West
ern blotting. **P ＜0.01 vs AST group. A ： BDNF and NGF protein
expressions in spinal cord ；B ： Quantitative analysis of histogram.
Conduction velocity (m/s)Conduction velocity (m/s)
B
1.0
2.0
3.0
3.02.01.00-1.0-2.00
A
A m p l i t u d e (m V )
A m p l i t u d e (m V )
1.0
2.0
3.0
3.02.0
1.00-1.0-
2.00
图1 AS(A)和AST(B)组大鼠坐骨神经传导速度和波幅
Fig 1 Conduction velocity and amplitude of sciatic nerve
in AS(A) and AST(B) groups 和NGF 蛋白表达量高于AS 组和模型组（P ＜0.01）。
性，继而出现近端背根神经节神经元和脊髓前角神经元的影响[8]。因此研究近端神经元的胞体结构与功能变化，对SNI 的治疗及预后具有十分重要的理论意义。
尼氏体是细胞质中的一种嗜碱性物质，广泛存在于各种神经元，主要由平行排列的粗面内质网和
M
AS
AST
2D
M AS AST
14
121086420碧海青天的意思
R e l a t i v e n u m b e r o f t h e N i s s l b o d i e s
*
*
核糖体组成[9]。尼氏体的主要功能是合成蛋白质，包括合成更新细胞器所需的结构蛋白、合成神经递
质所需的酶类以及肽类的神经调质等，从而为神经活动提供所需的能量[10]。研究显示尼氏体大而数量多，则神经细胞合成蛋白质的功能较强；相反当神经细胞受到损伤时，尼氏体则会发生肿胀甚至溶解，其数量会减少甚至消失[11]。本研究结果显示，AST组脊髓前角运动神经元中尼氏体呈规则的斑块状，即“虎斑”样，结构较规整，并且数量明显多于AS和模型组。说明脱细胞支架联合电针可有效阻止脊髓前角运动神经元损伤、促进其功能的恢复。推测其机制可能为脱细胞支架使离断的轴突得以延续，在电针的联合作用下，使得轴浆运输得以恢复，细胞膜内离子运输趋于平衡，主要的神经营养因子（neurotrophic factors，NFs）转运至靶器官，发挥了神经营养作用，从而对SNI 所致的脊髓前角运动神经元的损伤起到了保护性作用。
NFs是一类具有生物活性的蛋白质或多肽家族。神经损伤后，NFs可发挥促进轴突生长、调节突触可塑性以及促进神经元再生等功能[12]。BDNF是神经营养因子家族中重要的成员之一，参与了神经的发生、神经元的增殖与分化以及神经再生和退变等多种的神经生物学过程，是维持和修正特定神经元的形态结构以及发挥特定功能的关键因子[13]。应激状态下，BDNF主要来源于周围的施万细胞或者肌细胞；周围神经损伤后，BDNF蛋白及其mRNA迅速增加，使其轴突再生加快[14]。有研究证实BDNF在周围神经损伤后的数天表达水平开始增加，这种高水平表达的BDNF可延续到8 周左右，在调节神经可塑性、减少细胞死亡以及诱导神经再生的过程中发挥了重要的作用[15]。Wang等[16]在体外实验中可见BDNF 对神经再生和功能恢复有显著的促进作用。
NGF为具有多种生物活性的多肽类物质，对损伤的神经具有营养、促进再生及修复的作用。近年来的研究证实轴突切断以及脊髓损伤可诱导脊髓前角运动神经元重新表达NGF受体，与NGF结合后可发挥对神经元的保护作用，其机制可能与NGF可稳定细胞膜内钙离子水平、降低氧化损伤，从而提高脊髓前角运动神经元中mRNA转录功能有关[17]。
本研究采用免疫印迹检测各组大鼠脊髓内BDNF和NGF 蛋白的表达情况。实验结果显示，AST 组大鼠脊髓内BDNF和NGF蛋白的表达量均高于模型和AS组，表明脱细胞支架联合电针能够明显提高脊髓内BDNF和NGF的表达，从而减少或阻止轴突离断对脊髓内神经元的损伤。
电针治疗SNI，具有安全、经济、有效等特点。研究表明电针既可疏通经络、活血化瘀，又可加速局部炎性水肿消退以及促进坏死产物消除，从而改善损伤神经组织局部的微环境，进而对损伤神经发挥修复再生的作用[18]。根据临床经验和文献总结，本研究选取环跳和阳陵泉2穴作为电针取穴的部位。此2穴均位于足少阳胆经上，符合针灸学中的循经取穴、局部取穴的原则。其中环跳位于近髋关节处；阳陵泉位于坐骨神经的分支腓总神经上。两者周围为臀大肌、股二头肌、腓肠肌和胫骨前肌，因此此2穴是能够同时刺激穴位以及神经-肌肉的最佳点。本研究结果发现电针治疗4 周后，AST组大鼠坐骨神经传导速度和波幅明显高于AS组、脊髓前角运动神经元中尼氏体形态规整、“虎斑体”清晰可见且尼氏体数量以及脊髓内BDNF和NGF蛋白表达量明显多于AS和模型组。
综上，AS联合电针不仅可增加大鼠坐骨神经传导速度及波幅、还可阻止脊髓前角运动神经元中尼氏体的肿胀与溶解、上调脊髓内BDNF和NGF蛋白的表达，对SNI 所致的脊髓前角运动神经元损伤有保护作用，但其具体的信号转导机制仍需进一步深入的研究。
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（下转第43页）
计学意义，与既往文献研究获得较好的一致性。说明在MDCT后处理技术的联合应用中可以准确评估支气管解剖参数；CT后处理技术可以获得足够支气管信息，为实验动物气管插管、临床纤支镜、支气管内支架植入或气管重建等提供准确判断，为患者提供有效的保障；也是各类临床及实验研究的基础。
本研究中CT重建技术测量所得支气管各种径线值未与贵州小型猪进行尸体解剖标准对照是主要不足之处，但CT后处理技术可以多次重复进行；且已有研究显示，在CT上测量所得数据是可靠的[7-10]。综上所述，MDCT重建技术的综合使用可以准确显示支气管及其周围组织结构关系，并准确测量支气管各种径线值，为建立贵州小型猪支气管正常解剖模型提供相应的背景数据。
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