各大银行利率表蜱叮咬动物携带细菌V3～V4区的检测与分析
刁沛文;宋春玲;胡阳;郭鑫宇;刘慧婷;柏慧;李倩;王春仁;常巧呈
【摘 要】为了解被硬蜱叮咬动物携带细菌的种类特点,对采自被硬蜱叮咬的1头牛、1只羊和2匹马的血液,提取DNA并进行PCR扩增,获得16S rDNA的V3～V4片段,应用Illumina HiSeq 2500测序平台进行深度测序,并对病菌进行多样性进行分析.结果共检测到18属致病菌.其中包括6类人兽共患病菌(假单胞菌属、金黄色葡萄球菌属、链球菌属、立克次氏体属、分支杆菌属和不动杆菌属)和2类蜱传病原(类考克斯氏体属和立克次氏体属).通过二代测序技术探讨了蜱叮咬的动物血液携带细菌的特点,为动物蜱传疾病的深入研究提供参考.
【期刊名称】《黑龙江八一农垦大学学报》
【年(卷),期】2018(030)004
【总页数】5页(P37-41)
【关键词】蜱;动物;二代测序技术;人兽共患病菌;蜱传病原
【作 者】刁沛文;宋春玲;胡阳;郭鑫宇;刘慧婷;柏慧;李倩;王春仁;常巧呈
【作者单位】黑龙江八一农垦大学,大庆163319;黑龙江八一农垦大学,大庆163319;黑龙江八一农垦大学,大庆163319;黑龙江八一农垦大学,大庆163319;黑龙江八一农垦大学,大庆163319;黑龙江八一农垦大学,大庆163319;黑龙江八一农垦大学,大庆163319;黑龙江八一农垦大学,大庆163319;黑龙江八一农垦大学,大庆163319香植球
【正文语种】中 文
【中图分类】Q969.1
随着我国动物养殖业的飞速发展，动物传染病逐渐呈现出非典型性症状和混合感染的表现，许多病例仅靠临床和病理学方法很难确诊。目前，动物病原微生物实验室检测经常使用的方法主要包括病原学诊断、血清学诊断和分子生物学诊断。
分子生物学方法包括核酸杂交法、PCR及其衍生技术，如二代测序技术。高通量测序技术能全面分析菌群结构，以简单快速、高分辨率、高通量的优势深入研究特定环境下的菌群结构、功能代谢特点等，有效鉴定宏基因组，是对传统测序技术一次创新性的改革。随着
测序技术不断地推进，高通量测序技术给临床相关的菌群研究提供了更优化的鉴定方法，获得对物种层面更深的理解[1]。
16S rRNA基因在基因序列分析中应用最多。16S rRNA序列保守性高于酶基因，因为rRNA具有独特性和重要性等特点，结构特殊并保守，所以对影响其结构的突变具有抵抗性。而且，16S rRNA基因在细菌中普遍存在，适用于所有细菌的分析。国内外的文献中对细菌16S rDNA基因的可变区V3~V4区有所报道[2-4]，但是基于16S rDNA基因的可变区V3~V4对被蜱叮咬的动物血液中的细菌研究的文章未见报道。研究旨在通过二代测序技术检测蜱叮咬的动物携带细菌的V3~V4区序列，对蜱传细菌进行分析。
1 材料
1.1 血液样品
于2016年，采集大庆市绵羊（DS） 、大庆林甸奶牛（LC）、大庆市一场二矿马（DYH）和大庆卧里屯马（DwH）各1份血液样品。这四个动物体表均发现有大量硬蜱的寄生，吸食大量血液，动物表现为贫血、消瘦、发育不良、皮毛质量下降，且被叮咬部位皮肤发生水肿出血。
1.2 主要试剂颈椎病耳鸣
DNA提取试剂盒（血液/组织/细胞基因组提取试剂盒），购自TIANGEN公司；高保真DNA聚合酶（High-Fidelity DNA Polymera），购自 Hieff CanaceTM公司；普通试剂均为国产分析纯。
燕读音
2 方法
2.1 血液DNA的提取
根据TIANGEN公司DNA提取试剂盒说明书提取。取50 μL冷冻的羊、牛血液各1份，马血液2份。提取的DNA羊、牛、马4个样本DNA分别标记DS、LC、DwH和DYH，并标记好时间，用透明胶带贴好保存至-20℃环境中，备用。
2.2 16S rDNA基因V3~V4区高通量测序
2.2.1 引物及反应程序
将4份样本DS、LC、DwH和DYH基因组DNA的16S rDNA基因V3~V4区进行深度测序，样
品名称分别标注为（DS、LC、DwH、DYH）。选用通用引物：338F 5′-ACT CCT ACG GGA GGC AGC A-3′和 806R 5′-GGA CTA CHV GGG TWC TAA T-3′。反应体系（总体积为 50 μL）：Buffer 10 μL，Q5 High-Fidelity DNA 聚合酶 0.2 μL，High GC Enhancer 10 μL，dNTP 1 μL，338F（10 mol·L-1）1.5 μL ，806R（10 mol·L-1）1.5 μL，DNA 模板 60 ng，用 ddH2O 补足至 50 μL。反应程序：95℃预变性5 min；然后进行15个循环，每个循环包括95℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min。最后一个循环结束后72℃7 min。PCR产物浓度检测合格后，经1.8%琼脂糖凝胶电泳及凝胶成像系统检测其目的片段。
2.2.2 建库测序及生物信息学分析汤圆制作方法
（1）建库测序将上述PCR产物纯化，定量和均一化形成测序文库，对建好的文库进行文库质检，质检合格后，用Illumina HiSeq 2500平台进行测序。深度测序得到的原始图像数据文件，经碱基识别（Ba Calling） 分析转化为原始测序序列（Sequenced Reads），结果以FASTQ（简称为fq）文件格式存储，其中包含测序序列（Reads）的序列信息以及其对应的测序质量信息。
（2）生物信息学分析应用FLASH v1.2.7进行拼接；使用Trimmomatic v0.33软件对Raw Tags过滤得到高质量的 Tags数据（Clean Tags）；最后使用UCHIME v4.2软件，鉴定并去除嵌合体序列，Alpha多样性分析。物种注释及分类学分析。使用Mothur（version v.1.30）软件，对样品Alpha多样性指数进行评估。应用QIIME（version 1.8.0）软件中的UCLUST对样品进行聚类，并基于Silva（细菌）分类学数据库对OTU进行分类学注释，利用QIIME软件对各分类水平上的物种丰度进行统计分析，再利用R语言工具绘制样品各分类学水平下的群落结构图。
3 结果与分析
3.1.1 Alpha多样性分析
DS、DY H、DwH 和 LC 分别获得了 289，216、258、267个OTU，4份样品的辛普森指数与香浓多样性指数均表现正常，稀释性曲线（Rarefaction Curve）表明样品序列测序量充分（图1）。菌群覆盖率均在99.94%以上，以上数据表明检测结果可靠，样品Alpha多样性分析各指数见表1。
图1 样品稀疏曲线Fig.1 Sample rarefaction curve
表1 大庆4份动物样品Alpha多样性分析指数Table 1 Alpha diversity analysis index for 4 animal samples in Daqing样品名称 OTU/个 辛普森指数香浓多样性指数菌群覆盖率/%DS 289 0.05 3.54 99.97 DYH 216 0.18 2.65 99.95 DwH 258 0.05 3.50 99.95 LC 267 0.08 3.11 99.94
3.2 物种注释及分类学分析
3.2.1 OTU聚类
Venn图表示，4份动物血液样品的OUT总数为335，其中DS的OUT总数为289；LC的OUT总数为267；DYH的OUT总数为216；DwH的 OUT总数为258。共有OTU为132个，DS、LC、DYH和DwH特有的OUT分别为3个、5个、19个和2个。4份动物血液样品交叉共有的OUT占绝大多数，结合表5进行分析：2类蜱传病原考克斯氏体属和立克次氏体属，以及除链球菌属外的5种人兽共患病菌均为4份动物血液样品所共有。
图2 OTU分析Fig.2 OTU analysis
3.2.2 物种聚类
从界到属各等级中，DS、DYH、DwH和LC分别有26 000条、29 000条、51 000条和39 000条以上tags数被注释，说明测序结果是准确可靠的，见于表2。
中队长职责3.2.3 蜱体内细菌群落组成分析
濮怎么读音门水平上，样品隶属11个细菌门，按丰度大小排序，前四位依次是变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、硬壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）如图3。其中变形菌门的丰度最高。
表2 大庆4份动物样品各等级OTU物种统计结果Table 2 Statistical results of OTU species of 4 animal samples in Daqing样品名称 界 门 纲 目 科 属 种DS 1 10 20 33 52 82 9 DwH 1 9 18 31 49 77 8 DYH 1 10 23 35 53 80 7 LC 1 11 23 36 57 86 8
秋水庄子原文及翻译图3 大庆4个动物样品各水平物种分布柱状图Fig.3 Histogram of species distribution at each level of 4 animal samples in Daqing
