基于Illumina MiSeq和IonS5XL测序对原料乳中
时间同步失败微生物多样性的比较分析
苟萌，，，剧柠
*
(宁夏大学农学院，宁夏银川750021)
摘要：不同的高通量测序平台各有优劣，针对研究对象选择合适的测序平台，对微生物多样性研究具有重要意义#以原料乳中的细菌为研究对象，采用Illumina MiSeq和IonS5XL两种测序平台对细菌的V4—V5区进行扩增测序，探讨两种不同的测序平台在原料乳微生物多样性应用中的适用性％结果显示：两个测序平台的原始测序数据经质控后均可满足实验需求；IonS5XL测序在不同分类水平上的注释物种数、alpha多样性、稀释曲线和物种丰度等级曲线方面的结果优于Illumina MiSeq测序，显示出原料乳中较高的群落丰富度;Illumina MiSeq测序和IonS5XL测序均检出相同的优势菌门与优势菌属；Venn图和PCA分析显示，Illumina MiSeq测序相较于IonS5XL测序具有更好的生物学重复性，在测序稳定性方面具有优势#后期如能加大平行样本的统计，针对重复性进行改进,IonS5XL测序也将在乳品微生物多样性研究中具有很大的应用空间。
关键词：16S rRNA；原料乳；Illumina MiSeq测序；IonS5XL测序
高血压用什么药中图分类号:TS201.1文章编号:1673-1689(2021)04-0067-09DOI:10.3969/j.issn.1673-1689.2021.04.008
Comparative Analysis of Microbial Community in Raw Milk by Illumina MiSeq Sequencing and IonS5XL Sequencing
GOU Meng,HU Jie,ZHANG Tongtong,JU N*n'
(College of Agriculture/Ningxia University,Yinchuan750021,China)
Abstract:Different high-throughput quencing platfOrms have their own advantages and disadvantages.An appropriate quencing platform for the rearch object is of great significance to the study of microbial diversity.Taking the bacteria in raw milk as the rearch object,Illumina MiSeq and IonS5XL quencing platforms were ud to amplify and quence the V4-V5region of bacteria,and the applicability of two different quencing platforms in the microbial diversity of raw milk was discusd.The results showed that all of the original quencing data from the two platforms could meet the experimental requirements after quality control.The results of IonS5XL q
uencing on the number of annotated species at different taxonomic levels,alpha diversity, rarefaction curve,and rank abundance curve were superior to tho of Illumina MiSeq quencing, indicating higher community abundance in raw milk.The same dominant phyla and dominant genera 收稿日期：2020-01-11
基金项目：国家自然科学基金地区科学基金项目(31760479)。
p通信作者：剧柠(1979—)，女，博士，副教授，主要从事乳品微生物及分子生物学研究’E-mail：******************
很2021年第40卷第4期^9四字成语带图
GOU Men g,et al；Comparative Ana l ysis of Microbial Commu n i t y in Raw
Milk by Illumina MiSeq Sequencing anC IonS5XL
Seque n cing
were found in both Illumina MiSeq quencing and IonS5XL quencing.The Venn plots and PCA analysis showed that Illumina MiSeq quencing had better biological repeatability than IonS5XL
quencing and had advantages in quencing stability.If the statistics of parallel samples could be incread and the repeatability could be improved,IonS5XL quencing will have great application prospects in dairy microbial diversity rearch.
Keywords:16S rRNA,raw milk,Illumina MiSeq quencing,IonS5XL quencing
原料乳指的是未经加工处理的生鲜牛乳，在富含多种天然营养物质的同时，也为微生物生长提供了绝佳的环境叫原料乳中微生物种类繁多，导致乳及乳制品在存储及加工过程中的变化具有复杂性"细菌是导致原料乳品质变化的主要微生物叫因此，研究原料乳中的细菌种类及数量对乳及乳制品的品质控制尤为重要"早期的微生物纯培养法、传统核酸扩增等技术操作复杂、检，
法满足对乳及乳制品中微生物的深入研究"量技术也二代技术，具有时效、精高、量高、成本低、作简，
环境、、品等的微生物多样性研究。
类，研究，
同因测序质量的不同，对相同本生不同的微生物多性结果［3-4］o Illumina MiSeq IonS5XL是的高通量"Illumina MiSeq测序能够使多个样品在不同同，，性，，研究醋冋、问〔力等食品，也是研究原料
乳［8-9］、菌乳问、
乳［11］以及中微生物的重要工具°IonS5XL测序平台的读长长于Illumina MiSeq平台，最长可达600bp。测序时间比Illumina MiSeq更，成本，多菌群、发酵肉问、
鲜网的微生物菌相分析，在乳及乳制品微生物研究中的应用报道较少。IonS5XL测序时效性、成本的，对原料乳中微生物：，究是乳及乳制品微生物多性的研究，为加的乳及乳制品微生物提方法依据。
作者原料乳为研究对象，采用16SrDNA扩增子技术，利用Illumina MiSeq和IonS5XL两种不同的对原料乳中微生物多性，通过OTU聚类分析alpha多样性分析、物种注释和丰度分析，探讨两种一致性，比较两种之的差异，各自的优缺及适用性，为今后乳及乳制品微生物的选择、群研究提供理论依据。
1.1主要仪器、设备及试剂
TGL-16M高速台式冷冻离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司品；C200凝胶成像系统：北京百晶生物技术有限公司产品；核酸纯定仪：德国TITERTEK BERTHOLD公司产品。
DNeasy PowerFood Microbial Kit(100)试剂盒：德国QIAGEN公司产品；TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit试剂盒：美国Illumina公司产品；AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒：美国AXYGEN公司产
品；GeneJET凝胶回收试剂盒：Thermo Scientific 公司产品；Ion Plus Fragment Library Kit48rxns建库试剂盒:Thermo Fisher公司产品。
1.2试验方法
1.2.1样"收集及预处理严格遵循无菌操作，采集宁夏银川市某乳品企业乳罐中原料乳品，
菌容器密封后放入4!车载箱，2小时内运回实验室，在4!箱中冷藏72h后品总细菌DNA的提取。
1.2.2DNA的提取在QIAGEN DNeasy PowerFood Microbial Kit(100)试剂盒的改良基础上提取总DNA，具体操作如下：10mL质原料乳在5000g、4!下离心10min，去除多上清液和脂肪，加入3mL无菌水，器菌水和菌体沉淀混匀后，5000g、4!下离心5min，去除多的上肪，加2mL PBS缓冲液，
后吸取2mL菌液，按照QIAGEN DNeasy PowerFood Microbial Kit(100)试剂盒操作说明
JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.40Issue42021
苟萌，等：基于Illumina MiSeq和IonS5XL测序对原料乳中微生物多样性的比较分析
操作，并在第(4)步(转移重悬的细胞到PowerBead Tube上)之后进行55!%10min水浴，在第(19)步(在白色滤膜中加入100!L EB溶液，13000g离心1min)改为加入80EB溶液。
将提取的DNA用1.0g/dL琼脂糖凝胶电泳和核酸纯度测定仪进行浓度和纯度检测&DBA样品混匀后平分6份，分别编号为1—6，置于-20!冰箱冻存，送样备用。
1.2.3Illumina MiSeq测序平台的检测1一3号核酸样本采用Illumina MiSeq平台进行测序&选择细菌的16S rRNA基因的V4—V5区作为目的扩增段，使用引物515F(GTGCCAGCMGCCGCGGTAA)和引物907R(CCGTCAATTCMTTTRAGTTT)进行扩增。扩增体系为(25.0p,L)：5x reaction buffer5.0|j l L, 5x GC buffer5.0p,L,dNTP(2.5mmol/L)2.0“L，正向引物(10!mol/L) 1.0p,L，反向引物(10“mol/L) 1.0!L,DNA模板2.0!L,ddH i O8.7pX,Q5高保真DNA0.3!L o PCR扩增程序为：98!预变性2min；98!15s,55!退火30s,72!延伸30s，进行25次循环；最后72!延伸5min。使用2.0g/dL琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，采用AXYGEN公司的凝胶回收对目标段进行切胶回收&将扩增收产物进行定量，使用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit试剂备测序，2.0g/dL琼脂糖凝胶电泳进行
库最终的片段选择与纯化，在Solex MiSeq2500测序平台上进行300bp测序。
1.2.4IonS5XL测序平台的检测4—6号核酸样本采用IonS5XL平台进行测序&选择细菌的16S rRNA基因的V4—V5区作为目的扩增段，将DNA 样本使用无菌水1ng/|!L。用引物515F (GTGCCAGCMGCCGCGGTAA)和引物806R(CCGT CAATTCMTTTRAGTTT)进行扩增&扩增体系为(30.0|!L)：Phusion Master Mix(2x )15.0“L，引物(2“mol/L) 3.0p,L,DNA模板10.0|j l L,H2O2.0“L。PCRrepeatly
扩增程序：98!预变性1min；98!变性10s, 50!退火30s,72!延伸30s,30个循环；最后72!延伸5min。使用2.0g/dL的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，PCR产物浓度进行混样后采用1X TAE电泳液,2.0g/dL的琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物，采用Thermo Scientific公司GeneJET凝胶收胶回收产物&使用Ion Plus Fragment Library Kit48rxns进行,Qubit定和检测后，使用IonS5XL进行400bp测序。方俊明
1.2.5测序数据优化处理与分析获得原始数据(raw data)后使用FLASH和Trimmomatic
对分别进行和，置50bp的,
平度于20bp的序后的序,
控后长度小于50bp及含N碱基的序列；将Overlap 度于10bp于0.2的序，序的Barcode和引物区分样品并序向,Barcode的为0，最引物为2，存在基的序列，最到优序。
利用Upar7.1(/upar/)在97%度下进行OTU聚类，对于优化序列，序，并在中体；Silva 数据库(www.arb-silva.de)，采用RDP classifier 对97%水平的OTU序进行分分，取OTU对的物分
息，置信度为0.7。利用Mothur1.30.2(https：// hur/wiki/Download_mothur)进行alpha多样分析，并用R语言制作曲线%丰度等级曲线%Venn图％群落柱形图主成分分(PCA)图。通过OTU的
物种注释信息并结OTU丰度
对门和属生物水平上的物种丰度结果进行物种多样性和测序重复较。
2.1测序数据预处理及质控结果比较
测序得到的最初的序列即为原始序列，其中存在一定例的干扰数据，对进行，
到有效序后进行OTU和物分类分&由两个测序平台测序数据及质控结果较(见1)可知,Illumina MiSeq测序得到的原始序低于IonS5XL测序，但同的处理后,Illumina MiSeq测序平台的有效序在序
中所占比例为89.61%，高于IonS5XL测序的76.13%的结果，说明IonS5XL测序得到的序列数据量虽然，但低质量序目较&而由-测序平台所出的平均读可以看出,IonS5XL测序的序列平均读长为410bp，高于Illumina MiSeq 测序得出的平均读长372bp。因此，虽然IonS5XL
2021年第40卷第4期K B
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表1 Illumina MiSeq 测序和IonS5 XL 测序结果统计比较
Table 1 Statistical comparison between Illumina MiSeq quencing and IonS5 XL quencing
Illumina MiSeq 146 322131 12489.61%372
IonS5 XL
250 779
190 93576.13%
410
测序平台识别出较多的原始序列数，但可能是由于 这些原始序列并非全部为高质量序列，经质控处理 后低质量序列最终被剔除。
2.2 OTU 分类地位鉴定结果比较
从门、纲、目、科、属各分类学水平下注释物种
数来看（见表2）,IonS5 XL 平台注释出的物种数目 均多于 Illumina MiSeq 平台，分别是 Illumina MiSeq
的1.6倍#1.5倍#1.6倍#1.6倍#1.9倍，总OTU 数为 Illumina MiSeq 测序的2.5倍。可见IonS5 XL 测序 能够得到更多的物种信息。
IonS5 XL quencing
表2 Illumina MiSeq 测序和IonS5 XL 测序在各分类水平上注释物种数比较
Table 2 Comparison of the annotated species numbers at each taxonomic level between Illumina MiSeq quencing and
Illumina MiSeq
148
813305791
IonS5 XL
380
1320
49
91
178
2.3 Alpha 多样性结果比较
网页美工
2.3.1多样性指数结果比较 微生物群落alpha 多
样性可由多种指数反映。不同的指数于量群落
多样性的 各 ，常用的度量指数
括侧重于 群落丰富度的Chao1指数和ace 指 数，兼顾群落均匀度的Shannon 指数和Simpson 指 数，以及反映群落 盖度的Coverage 指数。-,Chao 1或ace 指数 ，表明群落的丰富度越
高；Shannon 值越大, 群落多样性 高；Simpson
指数值越大，
群落多样性 低。 Shannon 指
数群落的丰度以及稀有OTU 更敏感，而 Simpson 指数对均匀度和群落中的优势OTU 更敏。Coverage 是指各样 的覆盖，数值
高，则样 序列被测出的 高。
指数反映
本次测序
是
样
微生物的：情
况叫Alpha 多样性指数表（见表3）显示，两个测序平
台 得 的Coverage 值均高于99.00%， 样
盖 够， 测序平台的
够反
样 的 ; Chao1指数和ace 指数 ,
IonS5 XL 平台检测到的结果分别为Illumina MiSeq 平台检测到的2.2倍和2.09倍,
性显著（！＜
0.05）, IonS5 XL 测序 测到的物种丰 度要 高于 Illumina MiSeq 测序；IonS5 XL 测序的 Shannon 指数是 Illumina MiSeq 测序的 1.32 倍,Illumina
MiSeq 测序样本的Simpson 指数是IonS5 XL 测序的 1.58倍，这
IonS5 XL 测序所得到的微
生物 可能更丰。
表3 Illumina MiSeq 测序和IonS5 XL 测序的alpha 多样性指数
Table 3 Alpha diversity index of Illumina MiSeq quencing and IonS5 XL quencing
Illumina MiSeq
128.74±14.33
137.18±13.34 2.20±0.870.18±0.0199.95±0.01IonS5 XL
282.98±52.18
313.90±19.69
2.90±0.640.12±0.06
99.87±0.03
P 值
0.00800.212 9
0.1190.009
2.3.2稀释曲线结果比较稀释曲线可直接反映
测序数量的理性，并 反映样物种的
丰 度， 平 ， 测序数 量理， 数量 生量的物种。测
序平台的释 见图1,
的
测序数据量，纵坐标代表观测到的物种数量。对
Illumina MiSeq 和 IonS5 XL 测序 得序列 样
分析，
测序度的 ，
得平，原 样
部分微生物
测 ，
测序水平可以 样微生物的多样性， 平
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苟萌，等：基于Illumina MiSeq和IonS5XL测序对原料乳中微生物多样性的比较分析
台的测序量均可满足实验要求
500010000150002000025000300003500040000
序列数
图1Illumina MiSeq测序和IonS5XL测序的稀释曲线Fig.1Rarefaction Curve of Illumina MiSeq quencing and IonS5XL quencing
2.4丰度等级曲线结果比较
丰度等级曲线的横坐标代表某分类学水平下的OTU数目排序等级，纵坐标表示该分类水平下物种数目的相对百分含量，样本曲线延伸终点的横坐标位置为该样本的物种数量，若曲线下降平缓则表明样本的物种多样性越高，而曲线下降快速陡峭则表明样本中的优势菌群所占比例很高，物种多样性较低。
随着物种等级的增加，两个测序平台得出的相对丰度均降低并逐渐趋于平缓（见图2），表明此测序水平下，均测出中分微物。而Illumina MiSeq测序得的丰度等级曲线下降比较陡b,IonS5XL测序得的曲线下降较为平缓，说明IonS5XL测序比Illumina MiSeq测序所得的物种数量多。
祝组词语
鰹
<
衩
娶
皿
西的笔顺
软
O
L
O
图2IlluminaMiSeq测序和IonS5XL测序的丰度等级曲线图Fig.2Rank abundance of Illumina MiSeq quencing and IonS5XL quencing 2・5细菌的物种分类注释结果比较
2・5・1门水平上的物种相对丰度在门水平上, Illumina MiSeq平台检测到了6个细菌门,IonS5XL 平台测13个细菌（见表2），明的物多样性组成丰富，并且IonS5XL测序覆的细菌菌群比Illumina MiSeq测序更加。分比较分类水平下Illumina MiSeq IonS5XL 测序的物种相对丰度可知（见图3），两个平台检测中的优势菌组成，且优势菌
均为变形菌门（Proteobacteria），这
致卩，6，11?。Illumina MiSeq测序IonS5XL测序所检出的菌门平均相对丰度分别为72.4% 56.6%，性并（P〉0.05）。菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）也是原料乳中常见的菌[15"17]，且两测序平台相对丰度的：性也并不显著（P>0.05）。Mareike等>16?采用传统的选性对72h中的物
所分出的菌于菌、菌菌"所的两个测序平台的优势菌"明两个测序平台分中物可靠。
悝
<
衩
娶
2 3456
■厚壁菌门
■拟杆菌门
■变形菌门
■其他
样品编号
1、2、3为Illumina MiSeq测序平台结果；4、5、6为IonS5XL 测序平台结果。
图3门分类水平下Illumina MiSeq与IonS5XL测序的物种相对丰度
Fig.3Relative abundance of predominant bacteria in phylum classification level of Illumina MiSeq quencing and IonS5XL quencing
2・5・2属水平上的物种相对丰度及差异Illumina MiSeq测序检测到123个细菌属,IonS5XL测序检测到176个细菌属（见表2）。对两个测序平台属水平上的物种丰度分（见图4）, |2021年第40卷第4期
