基于Miq测序的长江中游枯水季水体菌群结构
梁杰超;季斌;陈威;宋宏娇;姚嘉雄;龚喜平;肖曹帆;刘扬
【摘 要】采用基于16S rRNA基因的Illumina Miq测序方法,对长江中游枯水季冬季的水质及水体细菌群落多样性进行系统分析.研究发现,所测长江水段当季属于《地表水环境质量标准》(GB 3838—2002)Ⅲ类水.长江中菌群多样性高,变形菌门(Proteobacteria,44.9％)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria,32.9％)以及丛毛单胞菌科(Comamonadaceae,30.6％)分别在门、纲、科上为优势菌.除此之外,长江水体中大量的优势菌科与生物除氮相关,其中具有好氧反硝化功能的丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)相对丰度最大,对于控制水体中氮素的污染指标,促进水体自净修复有积极的作用.PICRUSt功能预测分析表明水体中菌群在碳水化合物代谢和氨基酸代谢方面功能最强.在菌种关联网络中,拟杆菌属(Bacteroides)、黄杆菌属(Luteolibacter)、Pudarcicella等在共存网络菌群中具有正相关的关系,可以抑制微囊藻的生长.研究揭示了长江枯水季的水质与其微生物群落结构的内在关系,可以为长江枯水季饮用水源地水质安全保障提供理论依据.
【期刊名称】《科学技术与工程》
【年(卷),期】2019(019)014
【总页数】6页(P84-89)
【关键词】长江;枯水季;水质;微生物多样性;丛毛单胞菌;黄杆菌属
【作 者】梁杰超;季斌;陈威;宋宏娇;姚嘉雄;龚喜平;肖曹帆;刘扬
【作者单位】武汉科技大学城市建设学院,武汉430065;武汉科技大学城市建设学院,武汉430065;武汉科技大学城市建设学院,武汉430065;武汉科技大学城市建设学院,武汉430065;武汉科技大学城市建设学院,武汉430065;武汉科技大学城市建设学院,武汉430065;武汉科技大学城市建设学院,武汉430065;武汉科技大学城市建设学院,武汉430065
【正文语种】日记200字左右中 文
【中图分类】Q938.8
长江流域丰富的水资源为长江流域经济社会发展发挥了重要作用。长江干流水质总体以Ⅲ类为主，水质符合或优于Ⅲ类标准的河长占比呈现上升趋势[1]。武汉市处于长江中游，其
城市水源地主要来源于长江。长江水质随季节变化而变化，由于枯水季或冬季水位较低、水量少、水流流动性差[2]导致枯水季的水质状况远不及丰水季。除Cl-、总溶解性固体(TDS)及浊度外，温度、pH、NO3-、总磷溶解氧(DO)均表现出显著的季节差异性[3]，因此对饮用水安全造成一定的隐患。
植物或藻类与细菌的关系十分密切[4], 而细菌在水体中各种化合物的分解和循环中起着不可或缺的作用[5]，因此，细菌群落能够反映特定水体的水质状况。随着季节的变化，水体的菌群结构也会发生化[6]。方法英文
基于上述分析，拟探索长江中游枯水季的水质与其微生物群落结构的内在关系。通过Illumina Miq测序[7]，在细菌群落结构分析的基础上进行关联网络进行分析及代谢功能预测。研究旨在探寻菌群结构组成与水质的内在关联，为饮用水源地水质安全保障提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 样品采集处理及水质分析方法
水样于2017 年12月27日采集于武汉市临江大道武汉轮渡中华路码头(东经114.295°，北纬30.559°)长江沿岸(当日长江水位为2.20 m)，平行取样得到三个样本JD09-1、JD09-2以及JD09-3。水样取回后2 h之内完成水质指标监测，其中COD(化学需氧量)、TN(总氮)和的检测按照标准方法执行，F-、Cl-、和由离子色谱法测定(DIONEX—ICS—600)。水质指标进行三次测定取平均值并计算标准差。利用孔径0.2 μm的滤膜抽滤100 mL水样以得到富含微生物的滤膜并于-80 ℃保存[8]。
1.2 DNA提取及Miq测序
采用OMEGA E.Z.N.A.试剂盒提取微生物组的总DNA，通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，同时采用紫外分光光度计对DNA进行定量[9]。对目标片段PCR扩增[10]，扩增产物回收纯化并进行荧光定量，MiSeq测序等步骤。PCR扩增采用NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶，扩增区域为V4-V5区[9]。PCR扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳检测，采用AXYGEN公司的凝胶回收试剂盒对目标片段进行切胶回收。使用MiSeq测序仪进行2×300 bp 的双端测序，相应试剂为MiSeq Reagent Kit V3 (600 cycles)。
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1.3 测序结果分析
测序原始数据采用滑动窗口法作初步筛查，对通过初筛的双端序列进行配对连接。分析过程先利用QIIME软件对序列进行聚类分析，调用USEARCH检查并剔除嵌合体序列[11]。所获得的JD09-1、JD09-2、JD09-3的测序量分别为49 758、46 701、56 686。将获得的序列按97%的相似度进行操作分类单元(operational taxonomic units, UTO)划分。使用QIIME软件，对OTU丰度矩阵中每个样本的序列总数在不同深度下随机抽样，以每个深度下抽取到的序列数及其对应的OTU数绘制稀疏曲线和丰度等级曲线。将获取的OUT与Greengenes数据库比对[12]，获取菌群分类学信息和组成。通过PICRUSt进行功能预测分析[13]，将菌群分布信息映射到KEGG基因功能谱数据库中以预测样本功能类群。菌群关联网络的创建借助Mothur软件，计算丰度优势属之间的Spearman等级相关系数(ρ)，对其中ρ>0.6且P<0.01的优势属构建关联网络，并导入Cytoscape软件进行可视化[14]。
2 结果
2.1 典型水质指标红薯粉怎么做好吃
水质检测结果如下：COD为(32.38±5.32) mg/L、TN为为为(0.89±0.15) mg/L、TP为0.21±0.06 为(0.13±0.04) mg/L、F-为(0.023±0.010) mg/L、Cl-为(0.78±0.14) 为(1.65±0.23)
汽车玻璃水冻了怎么办 mg/L。pH为7.20±0.06。水样属于《地表水环境质量标准》(GB 3838—2002)Ⅲ类水。
2.2 样品测序可操作分类单元划分及菌群多样性分析
图1 各样本菌群稀疏特性曲线分析与各样本丰度等级曲线Fig.1 Rarefaction curve analysis of bacterial communities from each sample and curves of the abundance levels of each sample
样本JD09-1、JD09-2以及JD09-3经过Miq平台测序，分别获得了18 566、18 585、19 667个细菌有效序列，经Greengenes数据库比对得到OTU数量分别为1 489、1 677、1 720。稀疏曲线结果如图1(a)所示：三条样品稀疏曲线均趋于平缓，说明测得样品序列深度能够有效反映菌群结构多样性。丰度等级曲线如图1(b)所示，JD09-3样本的折线更为陡峭且更长，表明JD09-3样本中菌群丰富度更高。
丰富度估计指数(Chao1和ACE)和多样性指数(Simpson和Shannon)可以反映样本的Alpha多样性[15]，如表1 所示。JD09-3 样本菌群Simpson 指数和Shannon 指数均高于其余两个样本，说明JD09-3样本中群落多样性更高，其与丰度等级曲线分析结果一致[16]。
表1 各样本细菌群落多样性指数Table 1 Diversity index of bacterial communities in each sample样本编号SimpsonChao1ACEShannonJD09-10.9881 9231 8918.20JD09-20.9881 8451 847 8.17JD09-30.9891 9062 0398.33
2.3 细菌群落的物种分布及功能预测
为在门、纲、目、科、属五个水平上对样本中核心菌群结构的分布进行考察[17]，结果如表2所示。
表2 各样本OTU 划分及分类地位鉴定结果统计Table 2 OTU classification and taxonomic status identification样本编号门纲目 科属 种JD09-123579412717961JD09-222538812117660JD09-324559313220375
法律作文样本序列包含至少21个不同的细菌门，如图2(a)所示。JD09样本中主要优势门依次为变形菌门 (Proteobacteria, 44.9%)、放线菌门 (Actinobacteria,24.6%)、拟杆菌门(Bacteroidetes, 17.1%)。其他观门类相对丰度较低，包括蓝细菌门(Cyanobacteria, 9.4%)、疣微菌门(Verrucomicrobia, 1.9%)，浮霉菌门(Planctomycetes, 0.8%)等。
在纲水平上，如图2(b)所示，发现样本中β-变形菌纲(Betaproteobacteria，32.9%)在变形菌门中具有绝对竞争优势，其余样本中主要有放线菌纲(Actinobacteria,18.1%)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria 8.4%)和黄杆菌纲(Flavobacteriia，8.1%)等。
闪烁的青春进一步细分发现JD09样品中细菌隶属于23个目，其中伯克霍尔德氏菌目(Burkholderiales, 31.8%)相对丰度最大，如图2(c)所示，而在科物种分类中丛毛单胞菌科(Comamonadaceae，30.6%)占据绝对优势，说明丛毛单胞菌在长江中下游水体中具有竞争优势。
图2 各样本在门、纲、目、科水平上细菌群落丰度分布Fig.2 Taxonomic classification of bacterial quencing at phylum， class， order and family level
通过PICRUSt 功能预测分析[13]，得到的各功能类群在各样本中的丰度分布，结果如图3所示。说明三个水样的菌群功能具有相似性，在碳水化合物代谢和氨基酸代谢方面功能最强，而在核苷酸代谢，萜类化合物与多酮类化合物的代谢方面较弱。
2.4 关联网络分析
典型共存菌属关系网络如图4所示。微囊藻(microcystis)作为蓝藻的一个属，是富营养化水体中最常见的物种[18, 19]。黑色节点为典型的菌属，菌属之间红色连接线表明菌属之间是正相关的关系，而绿色连接线表明菌属之间是负相关的关系。由图4可知:拟杆菌属(Bacteroides)、黄杆菌属(Luteolibacter)、Pudarcicella等在共存网络菌群中具有正相关的关系，这方面与三峡水库的菌群结构类似[20]。说明这些菌是水质较好水体的指示菌。拟杆菌属(Bacteroides)和黄杆菌属(Luteolibacter)等细菌的生长可以抑制微囊藻的生长，从而可以防止水华的发生。
