泡菜发酵过程中真菌群落结构研究及优势真菌菌群变化分析
孟霞;裴乐乐;张安;张亚豪;张文学罚抄
【摘 要】18S rRNA clone library is constructed and ARDRA technology is applied for the green vegetable pickle sample, in order to investigate fungal diversity.The results show that 744 obtained positive clones distributed in 11 taxa.The predominant fungus is Debaryomyces in the whole fermentation process.Pichia is the predominant fungus in the fermentation of the 15th day and Kodamaea ohmeri is the predominant fungus in the fermentation of the 81th day.The main predominant fungi are Candida and so on.The results of qPCR are consistent with the clone library, which further illustrate the accuracy of the clone library.The results can not only reflect the difference of fungal structure in the same green vegetable pickle sample, but also can make u of the advantages of free culture techniques.It could provide certain theoretical basis for rearch and application of pickle and other fermented food.%采用构建18S rDNA克隆文库及ARDRA分型分析对发酵过程中青菜泡菜样品进行研究,了解其真菌的多样性.结果表明:所得到的744个阳性克隆子
分布于11个类群,其绝对优势真菌Debaryomyces贯彻整个发酵中期,Pichia在发酵第15天为绝对优势菌,Kodamaea ohmeri在发酵第81天为绝对优势菌,检测到的主要优势真菌有Candida等.荧光定量qPCR的结果与克隆文库基本吻合,进一步说明了克隆文库的准确性.此结果不仅能够较全面、真实地反映同种原料泡菜发酵过程中真菌的群落结构及差异,而且能发挥免培养技术的优势,可为泡菜等发酵食品的研究应用提供一定的理论基础.
【期刊名称】《中国调味品》
【年(卷),期】2017(042)003
【总页数】6页(P49-54)
【关键词】泡菜;真菌;ARDRA;18S rDNA克隆文库;qPCR
【作 者】孟霞;裴乐乐;张安;张亚豪;张文学
【作者单位】四川大学 轻纺与食品学院,成都 610065;四川大学 轻纺与食品学院,成都 610065;四川大学 轻纺与食品学院,成都 610065;四川大学 轻纺与食品学院,成都 610065;四川大学 轻纺与食品学院,成都 610065
什么是公式【正文语种】中 文
【中图分类】TS255.54
泡菜是我国传统特色发酵制品，距今已有3000多年的历史［1］。在中国的泡菜发展史中，四川泡菜原料蔬菜的种植气候、水土，制作工艺技术，发酵容器，产业的地位等，都应值得历史记载，中国泡菜首推四川泡菜，四川泡菜堪称“国粹”［2］，被誉为“川菜之骨”。
泡菜古称葅，是指为了便于长时间存放而经过发酵的蔬菜。它是一种利用蔬菜本身携带的微生物或人为添加发酵剂，并加入少量食盐进行发酵而制成的产品。泡菜中含有多种维生素、矿质元素和丰富的膳食纤维。泡菜不仅是佐餐佳品，而且还具有刺激食欲，健胃消食，改善肠道环境，促进胃肠健康，通便缓泻等功能［3］。
泡菜中微生物多样性研究一般采用传统分离培养，由于生态环境中可培养的微生物仅占总数的0.1%～10%［4］，所以，传统分离培养方法不能客观、全面地反映微生物多样性。近年来，由于免培养技术的发展，可直接从分子水平上来研究环境样品中的微生物区系［5
］。燕平梅等［6］通过对泡白菜卤水中优势微生物的分离鉴定进行了抗菌特性研究；张伟［7］对自然发酵泡菜过程中主要化学成分的变化以及微生物菌落长势变化进行了研究；梁新乐等［8，9］应用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术对泡菜中的微生物群落结构进行了初步研究，揭示了传统泡菜中微生物的多样性。
本文采用先进的分子生物学手段，结合四川泡菜的发酵特点，运用构建18SrDNA克隆文库、酶切分析技术及qPCR技术，研究分析同种原料泡菜中的真菌群落结构，这有助于改善现有四川泡菜发酵工艺，从而为改良泡菜生产工艺，提高生产效率提供理论依据，对于泡菜发酵机理的研究、实现传统泡菜企业综合效益的提高具有重要意义。英雄的泪
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1.1 样品收集
收集了四川省李记酱菜调味品有限公司的青菜泡菜液（发酵初、中期窖池原液），把样品取回后立即密封保存于－20℃备用。
1.2 实验试剂
E.Z.N.A Water DNA Kit基因DNA组提取试剂盒（Sangon），2×Taq PCR Master Mix（TIA
NGEN），PCR产物纯化试剂盒（Sangon），DH5α-感受态细胞（TIANGEN），T-载体PCR克隆试剂盒（Sangon），HaceⅢ酶和Hinf酶（TAKARA，日本）以及SYBR GREEN I（Amresco）。
1.3 实验仪器
高速冷冻离心机（Thermo Scientific，美国）；TCR-312PCR仪（TECHNE，英国）；DYY-5电泳仪（北京六一，中国）；凝胶成像仪（Bio-Rad，美国）；气浴摇床（HZQ-X100，中国）；LightCycler实时荧光PCR仪，Light Cycler Nano（瑞士Roche公司）；Thermo核酸测定仪（NANODROP 2000，美国）。
生孩子朋友圈报喜文字1.4 实验方法
1.4.1 样品总DNA的提取
采用E.Z.N.A Water DNA Kit基因DNA组提取试剂盒（Sangon）提取真菌样品总DNA，具体步骤详见说明书。纯化后用于PCR扩增。水豆腐怎么做好吃
1.4.2 真菌18SrDNA全序列扩增
PCR扩增引物为18SrDNA通用引物EF3（5＇-TCCTAAATGACCAAGTTTG-3＇）和EF4（5＇-GGAAGGARTGTATTTATTAG-3＇），均由上海生工生物有限公司合成。扩增目的片断大小为1500bp［10］。
扩增程序如下：先94℃预变性5min；再94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共30次循环；最后72℃延伸10min。扩增体系（50μL）：DNA模板4μL，上游引物（10μmol/L）和下游引物（10μM）各2μL，2×Taq PCR MasterMix 25μL，无菌超纯水17μL。
1.4.3 PCR产物切胶回收
用2.0%的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，采用PCR产物回收试剂盒（Sangon）纯化PCR产物，具体步骤详见说明书。
1.4.4 克隆文库的构建
客服坐席将纯化后的PCR产物与pMDTM-19-T vector载体连接，转化入大肠杆菌DH5α-感受态细胞（TIANGEN）中，采用Amp-X-gal-IPTG抗性筛选平板选择具有氨苄青霉素抗性的白色转
化子构建16SrDNA与18SrDNA克隆文库。
对选择的阳性克隆子PCR产物进行检测，用限制性内切酶HaceⅢ和Hinf对PCR产物进行酶切分型，酶切图谱相同的为同一个分类操作单元（OUT，operational taxonomic unit）［11］。克隆子数量占总克隆子数大于30%的OTUs为绝对优势菌，大于10%的为主要优势菌，5%～10%之间的为次要优势菌。从每个OTU类型中挑取1个代表克隆子送至上海生工进行测序。
1.4.5 18Sr DNA系统发育分析
将测序所得序列通过去除嵌合体后，在Ribosomal RNA Databa数据库进行对比，选择相似最大的序列为分类结果。利用Mega 5.0软件，采用邻接法（Neighbor-Joining）建构系统发育树，自展数为1000，Bootstrap检验系统树。
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1.4.6 数据统计分析
采用覆盖率Coverage C［12］评价同种原料泡菜真菌克隆文库的库容情况：Coverage C＝［1－（n1× N－1）］×100%，N代表文库中克隆子总数，n1代表文库中仅出现1次克隆
子的数量。依据上述OUT分类结果，用软件Sigma Plot Porable计算稀释度，以克隆字数量为横坐标，OUT数量为纵坐标，并采用Shannon-wiener index，Pielou index和Sorenn similarity index评价泡菜样品真菌的多样性、均匀度和相似程度，并通过生态学软件Biodap进行统计分析［13］。
1.4.7 荧光定量qPCR分析
用荧光定量qPCR方法来定量检测青菜发酵过程中的绝对优势真菌的变化趋势。qPCR用的仪器是Light Cycler Nano，瑞士Roche公司。绝对优势真菌Debaryomyces的qPCR扩增引物为Derba F1（5＇-CTTTCGCCCTGTGGTGTTTG-3＇）和Derba R1（5＇-GCGTCAAAAAAAGAACAACACC-3＇），将Debaryomyces（登录号KM586972.1）18SrDNA序列与其他属的酵母菌18SrDNA序列（从GenBank数据库获取）用CLUSTAL X多序列比对软件进行比对，然后通过Primer Premier 5.0引物设计软件进行设计，所设计的引物特异性先用BLAST在线验证（http：//bi.v/tools/primer-blast/），最后采用普通PCR和荧光定量PCR相结合的方法验证qPCR引物的特异性［14，15］。扩增程序如下：第一步，95℃10min；第二步，40个循环，包括95℃15s，66℃30s，72℃20s；
第三步，延伸76℃10s。扩增体系（10μL）：DNA模板1μL，上游引物（10μmol/L）和下游引物（10μmol/L）各0.2μL，SYBR GREEN Real-time PCR Master Mix 10μL，无菌超纯水8.6μL。梯度稀释质粒，制作质粒的标准曲线（用熔解曲线来检测产物特异性和引物二聚体）。qPCR的扩增效率计算公式E＝10（－1/slope）－1［16］。
2.1 青菜发酵过程中真菌18SrDNA基因克隆文库评价
为了研究同种原料泡菜中真菌生物多样性，本文构建了发酵过程中（1，3，15，21，31，64，81天）青菜泡菜的真菌18SrDNA克隆文库，最终获得744个阳性克隆子。通过菌液PCR验证，挑选的阳性克隆子，经ARDRA分析，共有36个OTUs，同源性≥97%的序列选取1个代表序列，作为同一个类群。最终选11个不同基因型的序列，与Genbank数据库中相似序列的同源性为98%～100%。样品的真菌克隆文库的Coverage C（覆盖率）分别为99.16%，99.37%，100%，99.11%，99.24%，100%，98.06%，所有样品的克隆文库容量值都达到98%以上，这表明其库容值较大，文库的覆盖程度较高，文库具有较好的代表性。随着样品真菌阳性克隆子数的增加，真菌酶切类型OTU逐渐增加，Rarefaction曲线趋于平缓，并最终均达到了平台期，见图1，这说明文库中的克隆数已经反映了泡菜中绝大部分的真菌多样性。
