伊马替尼耐药CML患者ABL基因激酶区突变检测
宋其芳;瞿燕春;杨红宇;王宏
【摘 要】目的 研究伊马替尼(imatinib,IM)治疗慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)耐药患者ABL酪氨酸激酶区突变情况.方法 用巢式PCR扩增对IM治疗耐药的56例CML患者骨髓样本ABL基因激酶区序列,通过测序和序列同源性检索分析ABL激酶区突变情况.结果 56例患者检出突变17例,其中14例为点突变,包括T3151、N358D、F359V、T389A、P441L、E450OK、S410G、F486S;3例检测出插入突变c.1423-1424ins 35bp(P.CA75YfsX11).慢性期患者突变12例(28.6%),加速期、急性期突变者分别为4例和1例..IM急变期、加速期患者突变率高于慢性期,但差异无显著性(χ<'2>=0.253,P>0.05).结果 ABL基因激酶区点突变是CML患者对IM耐药的重要原因,通过检测ABL基因激酶区突变有助于预测IM疗效并及时调整治疗方案.
【期刊名称】《临床检验杂志》
民国作家
【年(卷),期】2011(029)003小博士
十年歌【总页数】3页(P185-187)
【关键词】伊马替尼;慢性粒细胞白血病;突变;激酶区
【作 者】宋其芳;瞿燕春;杨红宇;王宏
【作者单位】暨南大学生命科学技术学院抗体工程研究中心,广州,510632;广东省中医院肿瘤科,广州,510120;暨南大学生命科学技术学院抗体工程研究中心,广州,510632;暨南大学生命科学技术学院抗体工程研究中心,广州,510632
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【正文语种】中 文
【中图分类】R733.72
慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)主要特征是持续表达BCR-ABL融合基因。此融合基因的产物可激活一系列下游信号通路而导致CML的发生，已成为CML治疗的重要靶标。伊马替尼(imatinib,IM)可竞争性结合ABL酪氨酸激酶催化部位的ATP结合位点，导致该激酶失去活性,诱导肿瘤细胞凋亡，用于治疗CML已取得比较满意的效果。然而，应
什么是湿热用IM治疗的部分CML患者用药不久即发生耐药，主要原因是BCR-ABL激酶区发生点突变。由于不同位点突变导致对IM耐药程度不同，因此对激酶区进行突变检测变得越来越重要[1]。本研究收集了56例发生IM耐药的CML患者骨髓或外周血，用巢式PCR扩增ABL基因激酶区的基因片段，探讨此区域突变与IM耐药的关系。
1 对象和方法
1.1 研究对象 收集2008年～2010年在广东省中医院就诊的56例CML患者49份骨髓及23份外周血标本，患者均经IM治疗，多数标本是在耐药发生时采集。其中慢性期(chronic pha,CP)患者42例，加速(accelerated pha,AP)/急变期(blast pha，BP)14例；患者年龄分布1～10岁5例，10～20岁2例，21～40岁35例，40岁以上14例。CP、AP、BP患者IM疗效、耐药的诊断均符合《血液学诊断及疗效标准》[2-3]。
1.2 RNA提取 取1～2 mL骨髓或2～3 mL外周血, EDTA抗凝; 2 000 r/min 离心10 min，取200 μL中间层细胞，按Invitrogen PureLinkTM RNA Mini Kit说明书操作提取RNA，紫外分光光度仪测定260 nm、280 nm处吸光度(A)值，计算RNA量。
数学计算题100道1.3 逆转录合成 按照TaKaRa PrimeScriptTM RT-PCR Kit说明书操作进行逆转录。
1.4 激酶区扩增 巢式PCR扩增BCR-ABL融合基因，引物序列为Primer A：5′-TTCAGAAGCTTCTCCCTGACAT-3′和Primer B：5′-TGAGGCATCTCAGGCACGTC-3′。反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 150 s，共35个循环；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。用内引物扩增ABL激酶区,引物序列为Primer C：5′-CCAAAGCGCAACAAGCCCAC-3′和Primer D：5′-ACAGCCCCACGGACGCCTTG-3′。反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共32个循环；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。50 μL反应体系中含100 ng模板DNA，5 μL 10×buffer，dNTP各0.2 mmol/L，MgCl2 2 mmol/L，引物各0.5 mol/L，ExTaq DNA聚合酶1 U(Tiangen公司)。
1.5 测序及序列比对 产物由Invitrogen公司纯化并用3730测序仪(美国应用生物技术公司)测序，测序结果与参考序列(NCBI序列号：NC_000009.11)进行序列同源性比较,分析突变情况，判断相应氨基酸。
2 结果
2.1 ABL基因激酶区点突变的检出结果 在IM耐药患者中共发现14个点突变，分别为T315I(4例)、N358D、F359V(2例)、T389A、P441L、E450K、S410G、F486S(3例)。S4
10G为未报道突变。
2.2 ABL基因激酶插入突变的检出情况 3例IM耐药患者检测到插入突变c.1423-1424ins 35 bp(p.C475YfsX11),序列见图1。
注：a、b，箭头为356 bp插入起始点；c，箭头之间为356 bp插入序列。图1 3例IM耐药患者中ABL基因激酶区突变
2.3 S410G突变在蛋白质三维结构的位置以及对蛋白质功能的影响 用SIFT(sorting intolerant from toletant)[4]预测S410G点突变对蛋白质的影响，结果S410G点突变对蛋白质功能产生影响， P=0.02；通过三维结构预测，得到正常及突变蛋白质结构，突变位于 activation loop区域的α-螺旋上，此区域的功能是控制酪氨酸激酶的活性，故突变可能影响酪氨酸激酶活性。见图2。
注：a，正常蛋白质结构，绿色区域是Ser410位置；b，突变后蛋白质结构，绿色区域是Gly410位置。图2 突变前后蛋白质三维结构图
2.4 ABL激酶突变在CP、AP、BP患者中的分布 12例CP患者(28.6%)、4例AP患者(36.4
%)、1例BP患者检出突变，后2组患者突变率(35.7%，5/14)高于CP患者(28.6%，12/42)，但无显著性差异(χ2=0.253，P>0.05)。
3 讨论
IM是目前治疗CML的分子靶向药物，但其在临床应用不久就发现耐药现象。耐药的发生机制包括[5]：(1)BCR-ABL融合蛋白的ABL基因激酶区发生突变，IM结合位点酪氨酸激酶结构域空间构象发生改变，导致IM不能竞争性结合融合蛋白；(2)BCR-ABL融合蛋白过度表达，超过了IM的竞争结合能力；(3)BCR-ABL融合基因基因组拷贝数的扩增，也会导致BCR-ABL融合蛋白的过度表达核型改变,例如del(7q)等；(4)CML克隆的增生不完全依赖BCR-ABL基因，还存在其他基因异常，如多药耐药基因的异常等。可能上述一种或多种机制一起作用导致耐药，但约50%的耐药是由于BCR-ABL融合蛋白的ABL激酶区突变引起的。因此，及时发现耐药突变情况，改用其他的治疗方案十分必要。本研究采用巢式PCR对发生IM耐药的56例CML患者BCR-ABL融合基因上ABL激酶区进行扩增。第一步PCR保证了扩增的ABL激酶区位于BCR-ABL融合基因上，而第二步PCR特异性扩增整个该激酶区，即包含第217到517位氨基酸。
本次研究的IM耐药患者中，有14例患者检测到点突变，3例患者检测到35 bp的插入。其中，T315I突变可以破坏IM与BCR-ABL蛋白的结合[6]，是目前最难克服的耐药突变，也是报道最多的点突变之一；而N358D、F359V、T389A、E450K、P441L、F486S并不破坏IM与BCR-ABL蛋白的结合，但可通过改变ABL激酶的空间构象,阻碍IM与之结合[6-7]；其中1例未报道突变S410G，通过SIFT以及蛋白质三维结构预测S410G点突变对蛋白质功能产生的影响，得知突变位于 activation loop区域的α-螺旋上，此区域的功能是控制酪氨酸激酶的活性，因此推测突变可能对酪氨酸激酶调控起作用。2008年后，在CML Ph+患者中关于C475YfsX11突变报道越来越多[8]，但国内尚无报道。本实验在耐药患者中检测到3例C475YfsX11突变，此类突变由于在ABL外显子8～9之间插入35 bp，造成插入位置后移码突变，使翻译自插入点开始插入10个氨基酸而提前终止翻译，这个截短的BCR-ABL蛋白由于缺少了ABL C-末端核酸序列、DNA绑定和肌动蛋白绑定结构域，从而对整个蛋白质功能产生影响。但对此还有争议[9-10]，还需要进一步的临床试验予以证实。由于本次研究样本较少，仅对56例使用IM治疗的耐药患者进行分析，为获得更多的耐药相关信息，指导临床治疗，还需扩大样本量深入研究。
4 参考文献
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