巨噬细胞特异性表达载体的构建及鉴定
李晓缘;尹洪超
【摘 要】目的 构建巨噬细胞特异性白喉毒素受体过表达载体并检测其在巨噬细胞中的表达情况.方法 将白喉毒素受体基因Hbegf克隆入pcDNA3.1载体中扩增Hbegf与BGHpolyA尾片段,与克隆入pUCm-T载体中的巨噬细胞特异性启动子相连接,分别转染巨噬细胞与其他细胞,通过荧光定量PCR鉴定其表达情况.结果 特异性表达载体通过测序以及酶切鉴定构建成功,在巨噬细胞中的表达高于未转染的巨噬细胞以及转染的非巨噬细胞.结论 构建了巨噬细胞特异性表达人白喉毒素受体载体,瞬时转染后可在巨噬细胞中特异性表达白喉毒素受体,为动脉粥样硬化易损性斑块的建立以及斑块内与凋亡相关的其他研究提供了一定依据.
【期刊名称】《医学研究杂志》
【年(卷),期】2018(047)011
【总页数】4页(P29-32)
【关键词】pUCm-T载体;pcDNA3.1载体;人白喉毒素受体;细胞凋亡;动脉粥样硬化
【作 者】李晓缘;尹洪超
【作者单位】张忠厚81670430 中国医学科学院/北京协和医学院基础医学研究所病理系;81670430 中国医学科学院/北京协和医学院基础医学研究所病理系
【正文语种】中 文
【中图分类】Q782
白喉毒素(DT)是白喉杆菌产生的细菌外毒素，由535个氨基酸组成，相对分子质量为62000[1,2]。它通过阻止延长因子2在核糖体内促进多肽链延长而抑制蛋白质合成造成细胞死亡，具有极强的细胞毒性[2]。白喉毒素受体广泛分布于哺乳动物细胞表面，但是只有人类与少数灵长类动物体内的白喉毒素受体才对白喉毒素具有敏感度，有研究证明，白喉毒素无法对小鼠细胞产生作用[3]。所以可以通过将人类的白喉毒素转移到小鼠细胞表面，实现白喉毒素诱导小鼠细胞凋亡的目的。
清道夫受体(scavenger receptor，SR)是一类主要位于巨噬细胞表面的糖蛋白，至少存在5种不同类型即SR-A、CD36、SR-C、CD68和LOX-1。其中SR-A能与氧化型低密度脂蛋白(
给女儿的生日祝福OX-LDL)结合，并介导其内移，使巨噬细胞转变成泡沫细胞，因而与动脉粥样硬化(As)的关系极为密切[4]。有研究表明，SR-A在巨噬细胞泡沫化的过程中表达量明显升高[5]。通过将SR-A启动子区域的增强子片段，启动子核心区片段，与目的基因相连接构建过表达载体，可实现目的蛋白在巨噬细胞以及巨噬细胞源的泡沫细胞中特异性表达[5～7]。
本研究将人类白喉毒素受体与清道夫受体SR-A启动子区构建过表达载体，通过白喉毒素作用实现巨噬细胞的特异性凋亡，为动脉粥样硬化的研究奠定了基础。
材料与方法
1.主要试剂和仪器：高保真聚合酶(日本TaKaRa公司)，DL1000 marker，DL10000 marker，胶回收试剂盒(日本TaKaRa公司)，pUCm-T载体，大肠杆菌菌株E.coli.DH5α，T4DNA连接酶(日本TaKaRa公司)，DNA纯化试剂盒(日本TaKaRa公司)，pcDNA3.1载体，限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅤ、SaLⅠ、HindⅢ(NEB公司)，质粒提取试剂盒(日本TaKaRa公司)，内毒素清除剂，质粒大提试剂盒(中国天根公司)，质粒转染试剂(美国Origen公司)，1640培养基，胎牛血清，双抗，总RNA提取试剂盒(中国天根公司)，反转录酶(日本TaKaRa公司)，SYBY-green MIX(日本TaKaRa公司)，普通PCR MIX(康为世纪)。PCR扩增
蝶泳
合同授权委托书仪，荧光实时定量PCR仪，电泳仪，化学发光成像仪，二氧化碳培养箱，台式高速冷冻离心机。
2.实验方法：(1)从GenBank及UCSC中查到SR-A增强子与启动子区域，向其两端延伸得到一段4700bp的序列，根据该序列设计引物，上游引物：5′-CCCCTAGGCTGACATTCCATC-3′，下游引物：5′-GGAAATGACACATTCCTGCGT-3′。以实验室已构建带有SR-A沉默子，增强子，启动子区域质粒PJC13-SR为模板进行普通PCR扩增，反应条件为： 94℃ 预变性1min，98℃变性10s，68℃退火/延伸反应 6min，共30个循环。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物并对产物进行DNA测序。(2)pUCm-T-SR-A载体的构建：将SR-A增强子与启动子区域的PCR产物进行纯化，加尾：将纯化产物与Taq酶mix等量混匀，72℃反应40min，将加尾产物再次纯化，通过T4连接酶与pUCm-T载体连接，转化大肠杆菌E.coli.DH5α，37℃培养 16h，挑取蓝斑过夜摇菌后提取质粒，PCR鉴定及测序分析，成功构建pUCm-T-SR-A载体。(3)从GenBank中查到人类白喉毒素受体基因(Hbegf)CDS序列，设计引物：上游引物：5′-CGGGATCCATGAAGCTGCTGCCGTCGG-3′，下游引物：5′-CGGATATC TCAGTGGGAATTAGTCATGCC-3′。该基因的上下游引物分别加了BamHⅠ与EcoRV酶切位点，以人CDNA为模板进行普通PCR扩增，反应条件为：
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94℃ 预变性1min，98℃变性10s，68℃退火/延伸反应 45s，共30个循环。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物并对产物进行DNA测序。(4)pcDNA3.1-Hbegf载体的构建：将Hbegf的PCR产物纯化后用BamHⅠ与EcoRⅤ进行酶切再纯化，将质粒pcDNA3.1-Hbegf用BamHⅠ与EcoRⅤ也进行双酶切线性化，T4连接酶连接双酶切后的基因Hbegf和线性化载体pcDNA3.1-Hbegf，转化大肠杆菌E.coil.DH5α，37℃培养16h，挑取单个菌落，过夜摇菌后提取质粒，PCR鉴定以及测序分析，成功构建pcDNA3.1-Hbegf。(5)根据pcDNA3.1-Hbegf序列设计引物:扩增加有BGHpolyA 尾基因Hbegf，上游引物：5′-ACGCGTCGACATGAAGCTGCTGCCGTCGG-3′，下游引物：5′-CCCAAGCTTTGGTTCTTTCCGCCT-3′。该基因的上下游引物分别加了SaLⅠ与HindⅢ酶切位点，以构建好的pcDNA3.1-Hbegf为模板进行普通PCR扩增，反应条件为：94℃ 预变性1min，98℃变性10s，68℃退火/延伸反应 1min，共30个循环。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物并对产物进行DNA测序。(6)pUCm-T-SR-A-Hbegf-BGHpolyA载体的构建:将Hbegf-BGHpolyA的PCR产物纯化后用SaLl与HindⅢ进行酶切再纯化，将质粒pUCm-T-SR-A也进行双酶切线性化，T4连接酶连接双酶切后的基因Hbegf-BGHpolyA和线性化载体pUCm-T-SR-A，转化大肠杆菌E.coil.DH5α，37℃培养16h，挑取单个菌落，过夜摇菌后提
取质粒，PCR鉴定以及测序分析，成功构建pUCm-T-SR-A-Hbegf-BGHpolyA。(7)使用转染试剂，根据一定比例，将质粒分别转染巨噬细胞RAW264.7与肥大细胞RBL-2H3，提取总RNA，反转录为cDNA，采用SYBY-green荧光染料定量PCR法对样品中基因Hbegf的表达水平进行测定和比较分析。上游引物：5′-CCTATGACCACACAACCATCC-3′，下游引物：5′-CATGCCCAACTTCACTTTCTC-3′。反应体系为25μl：SYBY-green Mix 12.5μl，cDNA模板1μl，上下游引物(10mmol/L)各1μl，灭菌双蒸水9.5μl。扩增参数：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火/延伸30s，39个循环。计算出各样本cDNA的基因Hbegf以及内参基因β-actin的CT值，将基因Hbegf扩增Ct值与相对应的β-actin的Ct值相减得到ΔCt，在根据公式2-ΔΔCt计算得到基因Hbegf的相对表达水平。(8)将质粒分别转染巨噬细胞RAW264.7与肥大细胞RBL-2H3，提取总蛋白，通过Western blot法做Hbegf蛋白表达鉴定。
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3.统计学方法：应用SPSS 17.0统计学软件进行数据统计分析，计量资料以均数±标准差组间比较应用方差分析，两两比较采用Student-Newman-Keuls检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
1.pUCm-T-SR的构建：以已构建带有SR-A沉默子、增强子、启动子区域质粒PJC13-SR为模板高保真PCR扩增SR-A增强子与启动子，2%琼脂糖凝胶电泳在3000bp左右的位置出现与预期结果一致的目的条带(图1A)，将其回收纯化加尾后再纯化克隆入pUCm-T载体中，构建pUCm-T-SR-A载体，测序验证构建成功(图1B)。
图1 SR-A启动子区的扩增结果A.pcr扩增SR-A增强子与启动子，1～9为扩增条带，10为DL10000; B.pUCm-T载体图谱，箭头处为启动子区插入位点
转基因农作物2.pcDNA3.1-Hbegf载体的构建：以人基因组为模板扩增Hbegf基因，2%琼脂糖凝胶电泳在650bp左右的位置出现与预期结果一致的目的条带(图2A)，将其纯化回收进行酶切，克隆入载体 pcDNA3.1中(图2B)，测序验证构建成功后以该质粒为模板扩增Hbegf与BGHpolyA片段，电泳在900bp左右位置出现与预期结果一致的条带(图2C)。
图2 基因Hbegf-BGHpolyA的扩增结果A.pcr扩增目的基因Hbegf，2～13为扩增条带，1为DL1000; B.pcDNA3.1载体图谱;C.pcr扩增带有BGHpolyA的基因Hbegf， 1～12为扩增条带，13为DL1000。
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3.pUCm-T-SR-A-Hbegf-BGHpolyA载体的构建：将Hbegf与BGHpolyA基因片段纯化后与pUCm-T-SR-A质粒分别酶切再连接，用限制性内切酶EcoRⅠ与HindⅢ酶切后，2%琼脂糖凝胶电泳在3000bp与4000bp处出现预期条带，证明质粒构建成功,通过测序再次验证连接成功(图3)。
图3 EcoR/HindⅢ酶切鉴定pUCm-SR-A-Hbegf结果 限制性内切酶EcoRⅠ与HindⅢ酶切构建的pUCm-T-SR-A- Hbegf-BGHpolyA载体后电泳结果
4.质粒转染与表达验证：将构建质粒通过转染试剂分别转染细胞RAW264.7与RBL-2H3，通过Western blot法与QPCR进行表达鉴定(图4)。
图4 基因Hbegf特异性表达的鉴定结果A.通过QPCR验证巨噬细胞RAW264.7转染组白喉毒素受体的表达量明显高于未进行转染的对照组与肥大细胞Rbl-2h3转染组；B.未进行转染的对照组RAW264.7,转染组RAW264.7, 转染组肥大细胞Rbl-2h3蛋白表达情况
讨 论
动脉粥样硬化在世界的发生率逐年增高，严重危害人类的健康。现阶段的很多研究证明，
动脉粥样硬化是一种慢性炎性反应，其发病机制与很多免疫细胞以及炎性因子的调节失衡相关[8]。巨噬细胞对凋亡细胞的清理功能即胞葬作用与炎性反应相互影响，是当下的一个研究热点[9,10]。有研究证明，动脉粥样硬化中该清理功能明显受损，但受损机制还不明了[11,12]。现阶段多用小鼠建立动脉粥样硬化斑块模型，但是这种模型仍然存在很多问题，很难形成易损斑块，这在很大程度上限制了动脉粥样硬化中与凋亡细胞相关的研究[13,14]。
本研究通过将巨噬细胞特异性表达的清道夫受体启动子区域核心片段与人类白喉毒素受体基因片段相连接，成功构建具有巨噬细胞特异性的载体，通过转染实现了人类白喉毒素在小鼠巨噬细胞中的特异性表达，为动脉粥样硬化发病机制的研究提供了基础[15～17]。
参考文献
【相关文献】
1 Fratelli F,Abrahão-Neto J,Caricati AT,et al.An alternative method for purifying and detoxifying diphtheria toxin[J]． Toxin，201l，(57)：1093-1100
