doi：10.3969/j.issn.2095-3887.2021.03.002
安"牛线粒体DNA分析及系统进化研究
曹梦丽"，丁考仁青$，马忠涛$，裴杰％，包鹏甲"，石红梅$，梁春年"，阎萍"，郭永光&，郭宪1
(1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃省耗牛繁育工程重点实验室，兰州730050；
2.甘南藏族自治州畜牧工作站，合作747000；
乙酰辅酶A羧化酶3.临夏县农产品质量检验检测中心，临夏731800)
摘要：安格斯牛与R牛杂交所产F i W牛显示出较高的杂交优势，不仅耐高寒、耐粗饲，而且弥补了R 牛生长慢的缺点。为了解安W牛的线粒体结构特性，从二代测序数据中组装了安W牛［Angus cattle (Bos ta&r&s;3)X Gannan yak(Bos grunniens；早)］完!整的线粒体基因组。结果表明：安W牛基因组大小为"6320bp，包含13个PCGs、22个tRNAs、2个rRNAs及1个控制区(D-loop);0L长度为31bp (6049-6079)，介于tRNA-Asn和tRNA-Cys之间；4种碱基含量分别为33.7%A、25.8%C、13.2%G 和27.3%T；此外，发现其基因组序列与前人发表的R牛线粒体全基因组序列基本一致，系统发育分析表明，安W牛与雪多R牛、麦洼R牛、娘亚R牛、玉树R牛及青海高原R牛关系最为密切。该研究结果可为R牛杂交改良或W牛生产提供基础数据和技术参考。
关键词：安W牛；高通量测序；种间杂交；线粒体DNA；进化分析
中图分类号:S823.2文献标识码:A文章编号:2095-3887(2021)03-0007-05
Analysis of M itochondrial DNA and Systematic Evolution of t he Hybrid of A ngus Cattle(Bos taurus;^)!
Gannan Yak(Bos grunniens;!)
CAO Mengli1,DINGKAO Renqing2,MA Zhongtao2,PEI Jie1,BAO Pengjia1,SHI Hongmei2,
LIANG Chunnian1,YAN Ping1,GUO Yongguang3,GUO Xian1
(1.Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences,Chine Academy of Agricultural Sciences,
Key Laboratory of Yak Breeding Engineering of Gansu Province,Lanzhou730050,China;我眼中的母亲
2.Gannan Tibetan Autonomous Prefecture Animal Husbandry Workstation,Hezuo747000,China
3.The Center of Agricultural Product Quality Inspection and Testing in Linxia County,Linxia731800,C
hina)
Abstract: The F1generation of yak produced by the cross between Angus cattle and yak shows a higher hybridization advantage, not only tolerant to cold and roughage,but also to make up for the shortcomings of slow growth of yak.In order to understand the mitochondrial structure characteristics of Anpian cattle,this study asmbled the complete mitochondrial genome of the hybrid of Anpian cattle[Angus cattle(Bos taurus;8)e Gannan yak(Bos grunniens;!)]from the cond-generation quencing data. The results showed that the genome size was16320bp,containing13PCGs,22tRNAs,2rRNAs and1D-loop.The OL length is 31bp(6049-6079),which is between tRNA-Asn and tRNA-Cys.The contents of the four bas are33.7%A,25.8%C,13.2% G and27.3%T,respectively.In addition,its gene arrangement consists with tho of previously published mi t ochondrial genomes of the Bos.Phylogenetic analysis indicated that this hybrid was the most cloly related to Xueduo,Maiwa,Niangya,Yushu and
收稿日期：2021-01-23
基金项目：财政部和农业农村部-国家现代农业产业技术体系(CARS-37)；中国农业科学院创新工程(CAAS-ASTIP-2014-LIHPS-01)
作者简介：曹梦丽(1996-)，女，在读研究生，研究方向为动物遗传育种与繁殖通信作者：郭宪(1978-)，男，研究员，博导，研究方向为动物遗传育种/动物繁育原理与技术；郭永光(1975-)，男，高级畜牧师，研究方向为畜牧与农产品检测Qinghai Plateau yaks.The rearch results provide basic data and technical reference for yak hybrid improvement or yak production.
Keywords:Anpian cattle;high-throughput quencing;interspecific hybridization;mi t ochondrial DNA;evolutionary analysis
耗牛是分布于青藏高原及其毗邻地区的特有牛种,
不仅能给当地牧民提供肉、乳、毛绒等一些生产生活资
料，还可作为役用，因此耗牛被称为“高原之舟”和“全能
家畜”⑴。研究发现，耗牛与黄牛相比，其肉脂肪含量低、
蛋白质含量高，富含多种维生素和矿物质元素⑵，但其产
肉能比其牛种低⑶。牛有生发肉
用性能的特性，个物种地理分布范围内，广
泛应用于其牛品种，产生的应及
生产能等多于种。牛与耗牛所产F i牛高的杂交优势，有高的产肉性能。牧条件下，安編牛不仅高寒耐粗饲的
优点，而且还耗牛生长速度慢、产肉性能低的缺
⑷DNA是分子生物学研究中的重要分
之一⑸，可用于动物遗传多及其起源的研究⑹，
是良好的。研究中，用二代
牛的因，其
和分析，牛的DNA特，为耗牛杂牛生产提供和
1材料与方法
1.1样品采集
牛 于藏
牙利吉乡尼玛龙村(北纬34.64。，东经102.46。)，参试牛(12月龄)健康无染性疾病低温保存，带回实验
室于-80°C保存。
1.2基因组DNA提取与测序
采用动物血液基因组DNA提取试剂盒(Tiangen)提
取安編牛基因组DNA，用NanoDrop2000超微量分光光
度计检测DNA浓度和纯度，低温存。2020年8月，运
送至西安晶迪格生物科技有限公司按照Illumina公司提
供的标准用量为2.27Gb，读150bp，测序文库片段大小为350bp。
1.3测序数据的质控
原始测序数据中会包含接头信息、低质量碱基及未测出的碱基(以N表)，这些信息会续的信息分析造成很大的干扰，通过精细的过滤将这些干扰信息去除掉，最终得到的数据即为有效数据(Clean Bata或Cl
ean reads)，该文件的数据格式与raw data完全一样。米用CLC Genomics Workbench vl0(CLC Bio,Aarhus, Denmark&软件默认参数设置，对raw data进行校准。
1.4数据处理与分析
借助MITObim vl.9软件［7］，对安編牛线粒体基因组进行组装，参数采用默认设置；组装所需初始参照序列采用前人发表的耗牛(Bos grunniens)全线粒体基因组序列(GenBank登录号JQ692071)叫线粒体基因组注释在GENEIOUS Rll(Biomatters Ltd., Auckland,New Zealand)软件中进行。蛋白编码基因、运RNA、RNA及区于其与众多同种因组的比对，若某些基因众多中存差异，则采用流注释方案。同时，借助MITOS Web Server】9"预测结果进行二次验用MEGA7软件⑩采用邻接法构建系统发，研究物种的
2结果与分析
2.1安7牛线粒体全基因组注释信息
安編牛线粒体基因组全长16320bp(GenBank登录号:MT649467)，包含13个蛋白编码基因(PCGs)、22个tRNAs、2个rRNAs及1个控制区(CR)。与前人发表的耗牛线粒体全基因组序列排列相同［11-14］，具体线粒体基因1
安編牛线粒体基因排列紧凑，部分有间隔及重叠现象，其中最大基因间隔存在于Cytb与tRNA-Thr之间，长5bp；最大基因重叠在ATP8与ATP6之间，长40bp。基因成具有A+T偏向(33.7%A,25.8#C, 13.2%G,27.3%T)。编码基因(PCGs、tRNAs&rRNAs)片段总长度15399bp，占基因组总长度的94.36%。13个PCG大分以ATA ATG始，以TAA、TAG 不全终T终22个tRNA的范围为60bp(tRNA-SerAGN)至75bp(tRNA-LeuUUR)，总长度1509bp;2个rRNA分别长957bp(12S rRNA)和1571
bp
(16S rRNA)。控制区长度为890bp.，轻链复制起点6079)，介于tRNA-Asn和tRNA-Cys之间。具体线粒体(Origin of L-strand replication,OL)长度为31bp(6049〜基因组注释见表1。
表1安#牛线粒体基因注释
基因位置/bp长度/bp编码链起始密码子终止密码子基因间隔/bp D-loop1-8908900 tRNAPhe891-95767+0
12S rRNA958-1914957+0 tRNA-Val1915-198167+0
16S rRNA1982-35521571+0 tRNA-Leu3553-362775+0
ND13630-4586957+ATG TAA2 tRNA-Ile4586-465469+-1 tRNA-Gln4652-472372--3 tRNA-Met4726-479469+2
ND24795-58381044+ATA TAG0 tRNA-Trp5837-590367+-2 tRNA-Ala5905-597369-1
tRNA-Asn5975-604874-1
OL6049-607931-0 tRNA-Cys6081-614767-1
tRNA-Tyr6148-621568-0
COX16217-77611545+ATG TAA1
tRNA-Ser7759-782971--3 tRNA-Asp7834-790269+4
COX27904-8587684+ATG TAA1
tRNA-Lys8591-865767+3
ATP88659-8859201+ATG TAA1
ATP68820-9500681+ATG TAA-40 COX39500-10280781+ATG T-1 tRNA-Gly10284-1035269+3
ND310353-10698346+ATA T0 tRNA-Arg10700-1076869+1
ND4L10769-11065297+ATG TAA0
ND411059-124361378+ATG T-7 tRNA-His12437-1250670+0 tRNA-Ser12507-1256660+0 tRNA-Leu12568-1263770+1
ND512638-144581821+ATA TAA0
ND614442-14969528-TTA CAT-17 tRNA-Glu14970-1503869-0
Cytb15043-161821140+ATG ACA4 tRNA-Thr16187-1625569+5
tRNA-Pro16255-1632066--1
2.2物种间进化关系分析比对，提取13个蛋白质编码基因比对结果，通过MEGA7
从GenBank下载现有39个牛属（Bos）和野牛属软件通过邻接法构建系统发育树（图2），研究物种间进（Bison）的线粒体全基因组，与安骗牛线粒体基因组进行化关系。结果显示，安骗牛（GenBank登录号MT649467）
与雪多耗牛（Ge+B*+.登录号MK124956）、麦洼耗牛（GenBank登录号KX232523）、娘亚耗牛（GenBank登录号MN319467）、青海高原耗牛（GenBank登录号IKR011113）、玉树耗牛（GenBank登录号MIK704512）关系最为密切。此外，本研究发现耗牛与野牛没有形成两个单独的进化枝，这可能是由于耗牛与野牛之间一直存在杂交!25y17的原因所致。
70
94
20万以下的车
8+
100 100
100
100
100
100
0.01
Bos gr&"()ns breed Huanhu yak MK124955
Bos gr&"()ns breed Sunan yak MH921427
Bos grwie ns breed Pali yak KR052524
Bos grunniens breed Qilian yak MK922355
Bos grunniens breed Seron yak MK780192
Bos grunniens breed Datong yak KJ463418
Bos grunniens breed Pamir yak MK922356
Bos grunniens breed Sibu yak Mn398192
Bos grunniens breed polled yak KM658599
Bos grunniens breed Tianjun yak MN163006
Bos mutus KY829451
grunniens breed Xueduo yak MK124956
grunniens breed Maiwa yak KX232523
Bos grunniens breed Niangya yak MN319467
Bos taurus(Angus calltle;&)x Bos grunniens(Ganana yak;!)MT649467|
1Bos grunnies breed Qinghai Plateau yak KR011113
Bos grunnies breed Yushu MK704512
「Bos taurus(Jery cattle;&)x Bos grunniens(Ganana yak;!)MN163007
100Bos grunnies breed Gannan KJ704989
98Bos grunnies breed Jinchuan yak JQ846022
夏天的画Bison bison GU946976
100_Bison priscus KX269111
■Bos jaianicus JN632605
Bos frontalis MK279400
1001—Bos gaurus JN632604
—
—Bison bonasus KX553933
•Bison schoetensacki KU886087
Bos taurus breed Ukrainian grey cattle GQ129208
Bos taurus breed Uruguayan native cattle MN510465
Bos taurus breed Heck cattle HM045018
Bos taurus breed Hungarian grey cattle GQ129207
—Bos primigenius JQ437479
■Bos indicus breed Kasargode cattle MF667930
^Bos indicus breed Crossbred cattle MF667932
indicus breed Sahiwal cattle KX759625
indicus breed Nandan cattle KT033901
indicus breed Wayanad cattle MF667931
indicus breed Vechur cattle MF667929
indicus breed Nellore cattle AY126697
indicus breed Trinkel cattle MK335920
100
94
100
100
100斗
93Bos
[+os
、Bos
81
68
64
67
>os
>os
图2基于安％牛13个蛋白质编码基因构建的邻接法系统发育树
3讨论
键盘按键图
哺乳动物线粒体DNA分子为双链闭合环状，长度在1.5-1.7kb之间，是一套相对独立于细胞核的遗传信息，属母系遗传。线粒体DNA在牛上的研究与应用，主要是通过对线粒体DNA变异产多态
的研究，牛的进化、分相互关系，于、系进化、物与分化，为叫本通过牛的线粒体基因组，长16320bp+与耗牛线粒体因成一致⑴-⑷，均含有13个PCGs、22个tRNAs、2个rRNAs及1个D-loop区，序列的碱基组成也基本一致；碱基的插入/缺失主要发生在D-loop区，可能由于，变异速度相对较快；分析了安骗牛与39个牛属和野牛属各的进化关系，，安編牛与雪多耗牛、麦洼耗牛、娘亚耗牛、青海高原耗牛、玉树耗牛关系最为密切，耗牛与野牛没有形成2个单独的进化枝，这可能与一直致于通过杂交野牛
先进事迹标题耗牛的产特性有关培叫
线粒体是物动的能
者，它无论在生理上还是病理上都有着至关重要的作用m 通过对多植物的雄性不育研究，在线粒体因
中发现了很多与胞质雄性不育相关的基因和片段閃。另外，线粒体基因缺失与男性不育症有密切关系呵。杂交K牛不仅保持了P牛耐寒、耐粗饲的优良特点，而且生产性能也有了极大的提高。而K牛雄性不育是K牛杂种优势推广的瓶颈，对此，很多学者也做了相关研究，多集中在核基因上[20)23]o关于线粒体基因是否与K牛雄性不育有关还需做进一步研究。
冬季时间参考文献
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《中国草食动物科学》面向全国读者开展免费阅读
为广大科研人员提供良好的文献查阅平台，《中国草食动物科学》于2013年在教育部科技发展中心的“中国科技论文在线”网站上面向全国读者开展免费阅读。同时，本刊于2013年开始应用DOI，意为“数字物品身份证符”。由于DOI的全球唯一性，在科技文献中如果给出被引参考文献的DOI，通过DOI可以直接定位到被引参考文献上，这样就提高了被引文献的表现度，以及论文的扩散力和影响力。
