乏氧激活荧光探针设计、合成及应用研究进展
王彩月;张淑平
【摘 要】介绍了肿瘤细胞的乏氧情况以及常规的肿瘤细胞乏氧检测手段,然后分别从荧光探针的设计构成、荧光探针的识别机理以及荧光探针的应用等方面对乏氧激活荧光探针进行了描述和总结,概述了构成荧光探针的常用荧光团,并详细探讨了构成荧光探针的乏氧靶向基团及其应用,重点介绍了硝基类和偶氮类两类乏氧感应基团,为新型荧光探针的设计合成提供了指引思路,提供了一种更高效、精准的肿瘤细胞的乏氧检测方法.
【期刊名称】《广州化学》
【年(卷),期】2019(044)003
【总页数】7页(P65-71)
【关键词】乏氧;靶向基团;荧光探针
【作 者】王彩月;张淑平
【作者单位】上海理工大学,上海 200093;上海理工大学,上海 200093
【正文语种】中 文
【中图分类】A150.20
近几年，肿瘤的发病死亡率持续上升，严重威胁人们身体健康。据统计，恶性肿瘤死亡占居民死因的23.91%，且每年所致的花销超过2 200亿，防控形势严峻[1]。因此，开发高效的肿瘤检测手段至关重要。乏氧现象是肿瘤的一项非常重要的特征，在超过60%的实体瘤中均有发现，并且在多次治疗过程中，乏氧组织不断变化，导致肿瘤细胞随之发生一系列生物学变化，从而对放化疗产生抵抗作用。因此，精确检测并了解肿瘤内部的缺氧情况，有助于判断肿瘤的恶性程度，还有利于预测治疗的敏感性和预后，提高疗效。目前为止，已有各种方法应用于临床缺氧检测，包括正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（PET/CT），电子顺磁共振成像（EPRI）等[2-3]。其中，荧光探针技术由于简便易行、选择性好、发光可调节、非侵入性、实时可视化观测等优点，逐渐成为生物、医学等领域的主要研究方法。
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本文针对肿瘤细胞独特的乏氧环境，详细探讨了乏氧激活的荧光探针的构成及其应用，重点讨论了构成荧光探针的乏氧靶向基团，为新型荧光探针的设计提供了指引思路。
1 肿瘤细胞的乏氧过程概述
肿瘤发生是一个复杂而动态的过程，与肿瘤微环境密切相关。肿瘤微环境和肿瘤细胞的相互作用产生生长因子、趋化因子和基质降解酶等促进肿瘤的增殖和侵袭。因而，在实体瘤内，肿瘤细胞快速增殖，血管结构和功能异常，导致氧气和营养物质供应不足，产生缺氧区域，即乏氧（图1）。肿瘤乏氧导致肿瘤细胞内氧压低、体系呈弱酸性、内壁基因过度表达、还原能力增强等，从而通过多种机制导致肿瘤细胞耐药性增强，降低对放化疗的敏感性，成为肿瘤难以治愈、容易复发、侵袭和转移、前期治疗失败的重要原因，但同时肿瘤乏氧为新型荧光探针的开发指引了一条新的道路[4-5]。
吃什么补充胶原蛋白图1 肿瘤微环境[6]
2 乏氧激活的荧光探针
农资代理乏氧激活荧光探针一般由靶向基团和荧光团（连接臂）组成（图2）。当受体与客体特异性
结合，荧光团发生物理改变，如荧光强度增强或减弱，荧光发射波长蓝移或红移，根据这些变化，从而实现选择性的、高灵敏性的检测客体分子。荧光探针有多种识别机理，包括光诱导电子转移（PET）、分子内电荷转移（ICT）、荧光共振能量转移（FRET）等[7]，其中，基于PET识别机理（图3）的荧光探针由于和客体结合前后，荧光从有到无或从无到有，呈现明显的“开-关”状态，变化强烈，乏氧检测效果显著，近年来，构建基于光诱导电子转移机理的荧光探针被广泛报道。
图2 乏氧激活荧光探针分子结构
盘中餐粒粒皆辛苦
图3 荧光探针光诱导电子转移机制示意图
成功的荧光探针必须满足医学成像的若干要求，包括良好的亲水性、稳定的光稳定性、高量子产率、优异的灵敏度等，其中，荧光团的选择至关重要。目前为止，常用的荧光团（图4）主要有：罗丹明类、香豆素类、氟硼吡咯类、荧光素类、萘酰亚胺类、吖啶类和菁染料类等。近年来，由于菁染料的长波长激发而被广泛报道，因为组织穿透在该波长范围内最佳，背景荧光干扰弱。
图4 常用荧光团
2.1 乏氧靶向基团
乏氧区域的还原能力增强主要就体现为还原酶的高表达，包括硝基还原酶、醌还原酶和偶氮还原酶等，乏氧激活的荧光探针主要就是依靠探针在乏氧区域内的还原酶作用下被还原，从而产生一系列生物效应。因而实现探针良好的乏氧选择性另一要素就是乏氧靶向基团的确定，用于还原依赖的乏氧靶向基团主要有：硝基类、偶氮类以及醌类。其中，由于毒性大等原因，醌类乏氧靶向基团应用较少，本文只稍作提及。
2.1.1 硝基类
硝基是药物化学中常见且独特的官能团之一，吸电子能力强，在分子内形成局部缺电子位点，从而容易和各种生物亲核试剂发生加成、络合等化学反应。硝基类乏氧靶向基团主要是一些硝基芳环或硝基杂环化合物，其作用机理见图5，即硝基首先淬灭了芳杂环体系的荧光，然后在缺氧条件下，经还原型辅酶和硝基还原酶共同作用，被还原转变为羟胺、亚硝基和氨基化合物等细胞毒性物质，致使淬灭失效，化合物再次恢复荧光，实现乏氧显像，同时，毒性物质还可与 DNA 发生不可逆结合而杀死肿瘤细胞，达到其乏氧选择性的目的。依据硝基的乏氧还原特征，近年来，发展出多种有机小分子乏氧荧光检测探针（图5）。
图5 硝基芳杂环类作用机理
首先，硝基芳环最常用的就是硝基苄基基团。例如将硝基卞基基团和尼罗蓝染料分子相连，从而淬灭荧光团原有的荧光，而在乏氧环境下，经还原酶作用硝基被还原，还原产物在658 nm 处发出近红外荧光，实现乏氧检测[8]（图6）。
图6 以硝基、卞基为反应位点的乏氧近红外荧光探针
Hiro等[9]开发了一种新的乏氧激活荧光探针，选择半萘酚罗丹明为荧光团，连接对硝基苄基靶向基团。该探针本是无色且无荧光的，在乏氧条件下硝基被还原，释放出检测基团，并在583 nm 处激发强烈荧光，可以明显的区分肿瘤的乏氧细胞和常氧细胞，并检测细胞内pH变化，实现双向检测，如图7所示。
图7 罗丹明类乏氧荧光探针的作用机理
硝基杂环主要包括硝基呋喃类和硝基咪唑两类。其中，硝基呋喃类应用较少，目前已合成的一个探针如图8所示，将硝基呋喃和异吩恶唑酮相连，该化合物本身几乎无荧光，在乏氧
区域被还原并经重排和消除反应释放出具有强烈红色荧光的异吩恶唑酮分子，灵敏度高[10]。趁火打劫什么意思
图8 以5-硝基呋喃为反应位点的乏氧荧光探针细节描写精彩片段
经大量的研究表明，相较于其他的硝基芳杂环类化合物，硝基咪唑类乏氧靶向能力最强[11]，主要是基于硝基咪唑的强还原性代谢能力。在常氧细胞中（pO2＝21%），硝基咪唑类化合物经氧化酶作用生成自由基阴离子，并迅速再氧化成硝基扩散出细胞，而在缺氧条件下，自由基阴离子被硝基还原酶进一步还原，产物与细胞内组分结合，在乏氧区域特异性积累，起到固定损伤的作用[12]。
通过改善乏氧靶向选择性，可以增强乏氧靶向荧光探针治疗效果，因而乏氧靶向基团的设计合成显得尤为重要。首先，硝基取代位置的不同对应着不同的靶向基团，咪唑环上硝基的取代主要有2-硝基咪唑(2-N)、4-硝基咪唑(4-N)、5-硝基咪唑(5-N)及 2-甲基-5-硝基咪唑等。其中，由于 2-N类的还原电位最高，在乏氧区域最容易被还原，目前为止，关于 2-硝基咪唑类靶向基团的研究最受欢迎。再者，基于乏氧的滞留机制，增加还原中心的（如双硝基咪唑环）数量，也可以达到提高乏氧选择性效果。除此之外，还可修饰硝基咪唑连接
基团，从反应机理上增强靶向性。例如，将2-硝基咪唑和叠氮基团相连，和单胺单酰胺二硫醇配体偶联的氮杂二苯并环辛炔进行体外点击反应，同时用Tc-99m标记，可以实现快速靶向[13]（见图9）。还可以用炔烃标记2-硝基咪唑作为乏氧靶向基团，通过拉曼光谱法鉴定肿瘤缺氧，也将是肿瘤乏氧靶向检测的较为有前景的方法之一[14]。
图9 2-硝基咪唑―叠氮化物的设计构成
2.1.2 偶氮类
偶氮能够有效淬灭荧光，而偶氮还原酶是生物体系中一种重要的还原酶，在氧浓度较高的情况下会抑制偶氮的还原，而在乏氧细胞中，偶氮经偶氮还原酶作用被分步还原，形成氨基衍生物，从而恢复荧光[15]。所以，偶氮是一类良好的乏氧选择性基团。例如Chao等[16]设计的一系列Ir(Ⅲ)配合物乏氧磷光探针，即偶氮基团与Ir(Ⅲ)配合物相连，由于偶氮淬灭作用，Ir(Ⅲ)配合物没有磷光，只有在乏氧环境中，其被还原产成氨基衍生物，从而发出强的磷光信号。且磷光颜色因配合物的辅助配体不同而不同，是非常有潜力的多色乏氧磷光探针（见图10）。
图10 以偶氮为反应位点的乏氧磷光探针
2.1.3 醌类
醌类和偶氮类化合物类似，可以有效的淬灭化合物的荧光。同时，在缺氧条件下，醌类化合物容易被辅酶和特定还原酶协同作用，发生1或2电子还原成半醌或对苯二酚，所以醌类化合物也是一种良好的乏氧选择性基团[17-18]。但近几年，由于醌类化合物在生物体内毒性大等原因被逐渐提及，导致醌类乏氧靶向基团在荧光探针方面的应用越来越少。
综合竞争力2.2 其它类型荧光探针
除此之外，目前应用比较广泛的还有一种就是具有重金属的大环配合物磷光染料分子，氧气敏感度高、分析性能好、生物相容性高且成本低。其中，由于Ru、Ir、Pt等金属配合物荧光染料发射的荧光易测量，且能示踪氧分压变化，因而成为成为肿瘤乏氧模型中氧气浓度检测探针设计首选[19-20]。
3 总结和展望
迄今为止，靶向性乏氧激活荧光探针已成为肿瘤内乏氧细胞成像的有力工具，为临床判断肿瘤预后和采用干预措施提供依据，克服了传统肿瘤治疗中遇到的抗性问题，对肿瘤治疗
具有着重要意义。虽然光学成像技术独到的优势已受到广泛认可，但由于在活体组织中的应用受限，使之无法在临床上得到广泛应用。目前设计合成的乏氧激活荧光探针分子在溶解性、生物相容性、组织穿透能力等方面确实还存在不足，难以实现直接对活体成像。因此，在这方面还需要更多的研究、创新，实现肿瘤乏氧的实时无损定量测量，真正实现肿瘤乏氧检测方法的新跨越。
床头柜尺寸参考文献：
【相关文献】
[1] Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, et al. Global cancer statistics 2018： GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA： a Cancer Journal for Clinicians, 2018, 68(6)： 394-424.
[2] Stoyanova R, Huang K, Sandler K, et al. Mapping tumor hypoxia in vivo using pattern recognition of dynamic contrast-enhanced MRI data[J]. Translational Oncology, 2012, 5(6)： 437- 447.
