【⼲货】NCBI中使⽤Primer-BLAST⼯具进⾏引物设计和特异性检验⼀、关于Primer-BLAST
Primer-BLAST，在线设计⽤于聚合酶链反应（PCR）的特异性寡核苷酸引物。这个⼯具整合了
⽬前流⾏的Primer3 软件，再加上NCBI 的Blast 进⾏引物特异性的验证。
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Primer-BLAST 免除了⽤另⼀个站点或⼯具设计引物的步骤，设计好的引物程序直接⽤Blast 进
⾏引物特异性验证。并且，Primer-BLAST 能设计出只扩增某⼀特定剪接变异体基因的引物。
Primer-BLAST 有许多改进的功能，这样在选择引物⽅⾯⽐单个的⽤Primer3 和NCBI BLAST 更
加准确。
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⾸先登录NCBI官⽹
点击进⼊BLAST导航页⾯，在Specialized BLAST板块中找到Primer-BLAST，点击进⼊。
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⼆、Primer-BLAST界⾯
紫薯汤圆Primer-BLAST 界⾯包括了Primer3 和BLAST 的功能。提交的界⾯主要包括三个部分：target
template（模板区）, the primers（引物区）, 和specificity check（特异性验证区）。跟其它的
BLAST⼀样，点击底部的“Advanced parameters”有更多的参数设置。
（1）模板（Template）
在“PCR Template”下⾯的⽂本框，输⼊⽬标模板的序列，FASTA 格式或直接⽤Accession
Number。Primer-BLAST 就会根据你输⼊的序列设计特异性引物，并且在⽬标数据库（在
specificity check 区选择）是唯⼀的。
（2）引物（Primers）夏天诗
如果你已经设计好了引物，要拿来验证引物的好坏。可以在 Primer Parameters 区填⼊你的⼀条
或⼀对引物。并且选择好验证的⽬标数据库（在specificity check 区选择）。根据需要可设置产
西山镇物的⼤⼩，Tm 值等。
（3）特异性（Specificity）
在 specificity check 区，选择设计引物或验证引物时的⽬标数据库和物种。这⼀步是⽐较重要
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的。这⾥提供了4 种数据库：RefSeq mRNA, Genome (lected reference asmblies),
帆的意思Genome (allchromosomes), and nr (the standard non-redundant databa)。
前两个数据库是经过专家注释的数据，这样可以给出更准确的结果。特别是，当你⽤NCBI 的参
考序列作为模板和参考序列数据库作为标准来设计引物时，Primer-BLAST 可以设计出只扩增某
⼀特定剪接变异体基因的特异引物。
lected reference asmblies 包括以下的物种： human, chimpanzee, mou, rat, cow, dog, chicken,zebrafish, fruit fly, honeybee, Arabidopsis, 和 rice。Nr 数据库覆盖NCBI 所有的物种。
三、⼀些Tips
1，在任何时候都要优先使⽤参考序列的Gi 号或Accession 号（尽量不要Fasta 格式的序列）。
另外，确保你的序列是最新版本的（在填Accession Number 时后⾯不加版本号就会⾃动拿最新的序列）
2，就算你对整个序列的某部分感兴趣（如某条染⾊体上的某个区域），你也应该优化使⽤Gi号或Accession 号。因为NCBI 会⾃动读取该序列的⼀些注释数据，对引物的设计更加有利。3，尽量使⽤没有冗除的数据库（如refq_rna 或 genome databa），nr 数据库包括了太多的冗除的序列，会⼲扰引物的设计。
4，请指定⼀个或⼏个PCR 扩增的⽬标物种。如果不指定在所有的物种搜索，将会使程序变得很慢，引物的结果也会受其它不相关的物种影响。
