网络出版时间：204)-3 -43 D /) 网络出版地址：h/p s ://kns. cnki. nePkcms/6ePil/C4. 1073. R. 20210322. 0919. 04). html
SPIN1通过调控上皮-间质转化促进胃癌细胞的迁移、浸润
吕蓓蓓D 刘海亭2 3，陈旭7，王亚文5宋琳1，高鹏4
接受日期：2624-D-63
作者单位:1山东第一医科大学附属省立医院病理科，济南250921
5山东大学医学院病理学系，济南256612
3山东大学齐鲁医院病理科、J 乳腺外科，济南256610
作者简介：吕蓓蓓，女，博士，主治医师。E-mail ：1—;1曲984@126.
aom
高 鹏，男，教授，博士生导师，通讯作者。E-mail ：3aopexv
@ shu. eXu. co
摘要：目的明确SPIN ）在胃癌细胞系中的表达情况及其对
胃癌细胞迁移s 浸润的作用，初步探究其可能的分子机制。 方法qRTACR 检测SPIN ）在5种胃癌细胞系中的表达情
况；TansweU 小室实验观察过表达及沉默SPIN ）后细胞迁移
和侵袭能力的变化;Western blot 法检测过表达及沉默SPIN ） 后上皮-间质转化（epithe/al-menchymal transi/on , EMT ）
相关蛋白的表达变化。结果SPIN ）在转移性胃癌细胞系
SGC770）中表达量最高，过表达SPIN ）可以促进胃癌细胞的
迁移及浸润能力，沉默SPIN ）可以抑制胃癌细胞的迁移及浸 润能力。过表达/沉默SPIN ）后可以导致Slug 表达上调/下
调及CAodinA 表达下调/上调。结论 SPIN ）与胃癌的浸 润、转移密切相关,SPIN ）通过正向调控Slug 导致CAodinD
表达下调进而促进EMT 进程，从而促进胃癌细胞的迁移、浸 润。
关键词：胃肿瘤；迁移；浸润;SPIN ）；上皮-间质转化
中图分类号:R 735.2 文献标志码：B
文章编号：100） -7399（2021）03 -034） -04
doi : 3 4.1 3 3 2 5/j. cnki. cjcep. 244 1.43. 44 1
胃癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，最新研究数 据显示其病死率位居第3位［］。由于其症状隐匿，难以早期
发现，胃癌患者确诊时多已为中晚期2年生存率不足24% , 严重危害国民的身体健康。浸润与转移是导致胃癌患者死
亡的主要原因。目前关于胃癌浸润、转移的分子机制仍不明 确。SPIN ）又名Spind/n ），是SPIN/SSTY 基因家族的主要成
员，1997年Oh 等J ］首次报道其为从卵母细胞向胚胎过渡过 程中在小鼠中表达的主要母体转录物，在配子发生中发挥重 要作用。此外其还是一种Tudor 结构域蛋白，能够识别组蛋
白H3第四位赖氨酸甲基化（H3K4me3），通过与其结合从而 影响表观遗传调控〔一5 *。近年研究表明.SPIN-在多种人类 恶性肿瘤如卵巢癌、肺癌、肝癌及乳腺癌中高表达J 「7，提示
SPIN ）可能是一个重要的癌基因，参与肿瘤的发生和发展。
但迄今为止,SPIN ）在胃癌中的表达水平、生物学功能和调
控的分子机制仍不清楚，本文从细胞水平探究SPIN ）对胃癌 迁移、浸润的作用，并初步探究其可能的分子机制。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂本实验所用胃癌细胞株MKN45、
BGC823、SGC790）、AGS 及HGC27细胞购自中国科学院细胞
库上海肿瘤研究所。细胞培养基（RPMIA640）购自Invka-
gen 公司，胎牛血清FBS 购自Gibco 公司，胰蛋白酶、双抗、
PBS 干粉、DMSO 购自索莱宝公司，细胞转染试剂Turkofeet
购自Thermo 公司，细胞转染试剂X-tremeGENE sidNA Trans
fection Reagent 购自Roche 公司，实时荧光定量PCR 试剂盒
购自Roche 公司，Tansweli 小室购自美国Corning 公司，Ma-
umei 基质胶购自美国BD 公司，引物购自济南博尚公司, SPIN ）抗体购自 PateinWch 公司（D53-D-AP ） , vimentin 、
Zefl 、ZoA 、P -catenin 、Snaii 、Slug 、CAudinD 和 P -actin 单克隆
抗体购自Santa Cruz 公司。
132 方法
1.0.C 细胞培养和转染 常规用RPMID644 （ Hyckne 公
司，USA ）和D%胎牛血清（Gibco 公司，USA ）在37 t ,5%
CO 5孵箱中培养。本课题组前期已构建SPIN ）过表达质
粒J ］，通过锐博公司人工合成靶向SPIN ）的干扰序列（k
SPIN1、。然后将SPIN ）过表达质粒和E-PPIN ）及相应的对
照分别转染至胃癌细胞株BGC343 ，使SPIN -表达上调/下
调。质粒转染时选用Turkofeet 转染试剂,siRNA 及对照转染 选用X-tremeGENE 转染试剂。表叔
1.4.0 RNA 提取和qRTACR 检测 （））培养箱取出细胞
后弃去培养基，用PBS 清洗3次，根据贴壁细胞的数量酌情
加入适量的T/zoi 裂解细胞；根据试剂盒说明书的步骤提取
细胞内总RNA，然后使用反转录试剂盒（TOYOBO ）将RNA 反转录为cDNA，后续进行qPCR 验证。（2）使用Roche Uni
versal SYBR Green Master 进行实时荧光定量PCR 检测，D
I^L 反应体系:SYBR Green （2 x ） 5 ^L, F primer （ 30 ^m ）0. 9
|±L,R primer （34 |±m ）0. 9 ^L, 1DNA - ^o,Npcka-Eree Wa
ter 补足）0 |±L 。（3）反应条件：95 t D min,95 t ）5 s,60
t - mm，合计44个循环。（4）结果分析：选用GAPDH 为内
参，每个样本的C-值为4个复孔的C-平均值，AC- = C-（目 的基因--Ct （GAPDH -，以相对表达量=2- A C 计算。
1.0.2 Western blot 法 分别收集实验组和对照组的细胞
沉渣，然后加入混合好的RAA 裂解混合液（RIPA : PMSF =
D0 :）），摇床孵育34 mW （置于冰上、。孵育结束后4 t 离
心25 mix （12 000 r/mix ） °收集上清液于新的EP 管中。检 测总蛋白浓度，然后将每个样品及蛋白marker 上样至U%
SDS-CAGE 凝胶电泳，电泳5 h 之后转膜至PVDF 膜，采用
5%封闭液（O mLTBST+5 p 奶粉）封闭2 -洗膜后将膜放
于一抗4 t 摇床孵育过夜，再次洗膜后放于二抗（、:5 000 稀释）室温孵育、-最后滴加显影液显影、拍照。
1.2.4 Tracswel i 实验（U 迁移实验：培养箱取出转染24 h
后的胃癌细胞，胰酶消化后计数，实验组和对照组各取5 X制作电子贺卡
U 4个细胞用240 pl 无血清培养基悬浮后加入普通Trac-
swek 小室内，沿小室外孔加入640 p L 含10%胎牛血清的
RPMID240培养基，孵箱内孵育24 h 后观察结果。（5）浸润 实验:Tracswel i 小室内提前均匀加入稀释好的基质胶（培养 基：基质胶=4 :）），凝固后即可使用。其余步骤与细胞迁 移实验的操作步骤相同，细胞数增加至8 XU 4个。（3）24 h
后，将小室内的培养基吸出，用棉签小心擦净小室内膜面未 穿出的细胞。将小室置于800 p L4%多聚甲醛中，固定穿出
外膜的细胞20 mm，然后用结晶紫溶液染色U mm，小心用 双蒸水冲洗、棉签擦净，显微镜下拍照计数。（4）分析结果： 在倒置显微镜下，实验组及对照组随机选取3个视野分别计
数穿过小室的细胞数，计算其平均值，然后进行统计分析。
1.3 统计学分析 使用GmphPaP Pksm 5及SPSS 20. 0软
件进行统计学分析，使用h 检验分析两组间的差异。P <
2. 25为差异有统计学意义。2 结果2.1
5种胃癌细胞系中SPIN1的表达量 通过qRT-PCR
检测5种胃癌细胞系中SPID ）的相对表达量，结果显示在胃
莎士比亚情诗癌细胞系中,SPIN ）在转移性胃癌细胞系SGC790）中的表达 量最高，在HGC27的表达量最低（图）A ） °
2.2
转染 SPIN1 质粒及 si-CPIN1 后 BGC823 中 SPIN1 的
表达量 在胃癌细胞系BGC853中转染SPIN ）质粒后，与转 染PCDNA 3.）的对照组相比,SPIN ）的表达量明显升高（图补语和状语的区别
）B ），转染w-SPIN ）后，与对照组相比,SPIN ）的表达量明显
降低（图）C ）° 2.3
SPIN1表达对胃癌细胞BGC823迁移及浸润能力的影
响 Tmnswel i 实验结果表明，过表达SPIN ）后,BGC823细胞 穿透Tmnswel i 小室底滤膜的细胞数比对照组明显增多（P <
0.05），提示迁移、浸润能力增强。而相比于对照组.w-SPINl
组中BGC853细胞穿透Tmnswel i 小室底滤膜的细胞数明显 减少（P<0.05，图5），提示细胞迁移及浸润能力降低°
2.4
SPIN1 对上皮-间质转化（epithelial-menchymal
transition , EMT ）的调控作用 通过Western blot 法检测过
表达/沉默SPIN ）后BGC853细胞中EMT 相关蛋白vimec-
kn 、Zeb ）、ZoA 、B-catein 、SnaigS/g 及 C/uPixD 的表达水平
变化。结果表明，与对照组相比，过表达SPIN ）后Slup 表达
上调，CmuUibA 表达下调；干扰SPIN ）后S/g 表达下调,
C/uUmA 表达上调，其余蛋白未见明显变化（图3）°
3讨论
胃癌是导致中国癌症死亡的主要原因之一，尽管化疗是
中晚期胃癌患者主要的治疗手段，可适当延长患者总生存
期，但化疗的不良反应突出，且易导致耐药。随着对胃癌发
生、发展分子机制的深入研究，胃癌的分子靶向治疗越来越 受到临床的关注。目前针对胃癌的靶点主要包括EGFR 、
HERN 、VEGF 、VEGFR 、mTOc-MET 、HGF 等，除应用曲妥珠单
抗使得少数HERL 阳性晚期胃癌患者部分获益外，其他靶
向药物的临床疗效不尽人意。因此，寻找在胃癌发生、发展 中敏感和特异的基因改变，并研究其发挥作用的分子机制,
对胃癌的临床诊治及提供抗癌药物的新靶点等方面均具有
重要的理论和实际意义。
越来越多的证据表明.SPIN ）是个新颖的癌基因，在肿 瘤的发生、发展中起重要作用〔5-59-5]，但在胃癌中尚未见相 关研究。本实验首先在细胞水平验证了 SPIN ）在胃癌细胞 系中高表达，且在淋巴结转移细胞系SGC740）中表达量最
高，结果提示SPIN ）可能与胃癌的浸润、转移密切相关。转 移和浸润是恶性肿瘤的基本特征，胃癌的远处转移和浸润深
度是影响患者预后的重要因素。后续我们将在临床样本水
平进一步探究SPIN ）表达与胃癌患者预后的关系。接下来
*琵蚤 V N a m
INIdS
图1 SPIN1在5种胃癌细胞系中的表达及BGC833细胞中过表达及干扰效率验证：A •各胃癌细胞系中SPIN 1的表达；B •转染SPIN1后
BGC825细胞中SPIN 1的表达变化，*…P<2.62 1 ;C .转染W-SPIN 1后BGC825细胞中SPIN 1的表达变化，…P<2.0
1
A 浸润SPIN1PCDNA3.1
迁移
浸润O-7PID1NC
迁移
B
挑战者联盟第三季
图2过表达及干扰SPIN1后对BGC823细胞迁移及浸润能力的影响：A.过表达SPIN1组；B.OWPIN1组
图7过表达及干扰SPIN1后对EMT相关蛋白Slug及Claudin1表达的影响:A.过表达SPIN1；B.干扰SPIN1
为了明确SPIN1在胃癌迁移、浸润中的作用，本实验以BGC823细胞为研究对象进行了Transoelt实验。结果表明过表达SPIN1可以促进胃癌细胞的迁移、浸润，而沉默SPIN1表达可以抑制胃癌细胞的迁移、浸润，进一步验证了SPIN1在胃癌浸润、转移中发挥重要作用。
目前对SPIN1发挥促癌作用的分子机制研究尚在初始阶段，下游只有少数靶基因被报道，更为广泛的分子调控机制仍待研究。EMT是肿瘤侵袭、转移的重要机制之一，在胃癌的浸润、转移中发挥重要作用J4]o肿瘤细胞通过发生EMT，失去上皮极性而获得间质特性，主要表现为细胞黏附分子如E-cadhe/u、ZoW等表达减少，而vimentin、纤维结合蛋白等细胞骨架蛋白表达上调，同时与EMT相关转录因子Snait家族表达异常增加等〔⑴o Sluy是Snait锌指家族的转录因子之一，是EMT的重要标志物，在多种恶性肿瘤中表达升高[4]，且与胃癌的不良预后密切相关〔⑶o本实验结果表明，在胃癌细胞系BGC823细胞中过表达/沉默SPIN1可以上调/下调Sluy的表达，提示SPIN1可能通过调控Sluy表达促进EMT进程。ClauPin-S是紧密连接蛋白Claudius家族的成员之一，是重要的细胞间连接蛋白，与EMT的发生密切相关，研究发现ClaudioW在胃癌组织中表达明显降低，具有抑制胃癌细胞生长、侵袭和转移的功能〔⑷o本实验结果显示, SPIN1过表达可以抑制ClaudioW表达，而沉默SPIN1可以上调Claudi
百弊丛生oW表达，表明SPIN1参与调控ClaudioW的表达。Ma/inez-EshuPa等23研究发现Claudin-S是上皮细胞中Snait 家族因子的直接下游靶基因。因此我们推测SPIN1对Clav-P-W的调控作用可能是通过SOiy实现的。在后续的研究中我们将继续深入研究这一分子机制。
综上所述，本实验选用胃癌BGC823细胞为研究对象，初步探讨了SPIN1在胃癌迁移、浸润中的作用及其对EMT 的调控作用，为胃癌的发生、发展及转移评估提供了新的标志物，其更深入的分子机制有待进一步探索。
参考文献：
[1]B/y F,Fe/ay J,Soepomata/m I,et aO Glohat cancer statistics
2013:GLOBOCAN estimates of incideuce anP moUalitg wo/Pwido for36cancers—55countries J].CA Cancer J Clin,225,68
(6)：394-424.
[2]OP B,Hwang S Y,Soltor D,et aO Spindlin,a major1X181^/0-
Vanscript exp/sU—tUo mou Puring tUo transition from oocyte
to embryo]J].Developmeut,1997,104(2)：293-543.
[3]Sn X,ZPn G,Ding X,et ah Molec/lar basis unPe/ying Pistono
H3lysiue-c/inino metPylatiou patteru/aPout by Spip/Ssty repeats
of Sp-dl-UJ].Geuos Dev,2014,23(7-：622-736.
[4]ZPang X,ZPn G,Sn X,et ah Nucleolar localization siyuat anP
Pistono metPylatiou/aPor function is repuireU for SPIN1to promote
rRNA geue expression[J].Bioc/em BionPys Ros Commun,2018,
545(1)：325-332.
J5/Song Q,Ji Q,Xiao J,et ah miRW09inhibits Puman non-smal t-celt lung cancer pmgmssiou by Pirectly ta/et—g SPIN5J].Mot
TPor Nucleic Acids,245,13：154-163.
J]ZPao M,Bn Y,Feug J,et aO.SPIN1triggers ad n orma-lip—me-tadolism an/epPancos tumor growtU—liver cancer[J].Cancer Lett,2020,470:54-73.
J ]CPeu X,Wang Y W,Xing A Y,eh hi.Suppression of SPID1-mo-PiateP PI3K-Wkt pathway by miRW89i/c/asos c/emousitivitp—
breast cancer[J].J PatPot,2416,239(4)：459-472.
玫瑰的诗句
[8]CPeu W,ZPang Y,Wang H,et aO LIDC04473/miR274y-Pp
/yulatos esophagea-spnamous celt carcinoma via ta/eting SPIN1
to weadeu tUo ePect of/OiotPe/py[J].J Celt Bioc/em,2019,
120(9)：14562
-14572.
网络出版时间：206--3-43D/4网络出版地址：h/p s://Pkcms/6ePil/C4.1073.R.20210322.0916.022.html 三阴型乳腺癌中AR、SOX10、EGFR和PD-1的表达及临床意义
李杰1，李诗4，李芳2，刘月平2
摘要：目的探讨三阴型乳腺癌(triple neya/ve breast cane-er,TNBC)中AR、S0X10、EGFR及PDA)的表达及与预后的关系。方法收集557例TNBC患者的临床病理资料，采用免疫组化法检测TNBC中AR、S0X10、EGFR及PDA)的表达，并复习相关文献。结果557例TNBC中ARpSOXD和EGFR的阳性率分别为16.0%、63.6%和74.7%,AR阳性患者肿瘤直径较小且不易发生转移(P均＜0.005):SOX14与EGFR表达与KiA7增殖指数、组织学类型、分级相关(P均＜0.005)。PDA)阳性率为37.9%,PDA)表达与肿瘤大小和Ki-67增殖指数相关(P均＜0.005)，且阳性者多不表达AR，多伴S0X14和EGFR阳性。PDA)阴性者的无进展生存期(papressionAree survivai,PFS-比阳性者长，AR和SOX14的表达与患者生存期相关。结论TNBC中AR通常阴性,S0X14和EGFR阳性,PD-L)表达与AR、SOX10、EGFR 相关,PDA)、AR和SOXD的表达和TNBC的PFS相关，有望成为治疗TNBC的新靶点。
关键词：乳腺肿瘤；三阴型;AR；SOXD；EGFR；PDA)
中图分类号:R737.9文献标志码：B
文章编号：D0)-7399(202))03-0344-04
doi:34.18315/jki.cjcep.207).03.024
乳腺癌是全球女性发病率最高的恶性肿瘤，病死率位居第2位，具有高度的异质性，其中ER、PR、HERA均阴性的 乳腺癌称为三阴型乳腺癌(triple neya/ve breast cancer,
接受日期：2224-D-08
作者单位：河北医科大学第四医院1乳腺中心、7病理科，石家庄256002
作者简介：李杰，男，硕士，主治医师。E-maii：***********TNBC)，占乳腺癌的15%~20%。由于TNBC发病年龄早，转移潜能大，无阳性治疗的“靶点”，恶性程度较高［D，患者中位总生存时间(overall shrvivai,OS)仅为D-D个月。随着对TNBC的研究进一步深入，发现管腔雄激素受体型(kc minai andropen receptor,LAR)是以高表达雄激素受体(an-dapen receptor,AR)为特征的分子亚型J］，临床病理特征是否与患者预后相关，研究结论并不完全一致。SOXD(Sry-reAwf HMg-Eox gene D)是一种DNA转录结合分子1］，有研究表明SOXD在TNBC的形成和发展起重要作用1］。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)在非小细胞肺癌中报道较多，但在乳腺癌中检测的必要性和
用药指导价值并未得到充分论证。由于TNBC组织学分级高、突变负荷高，免疫相关的基因被大量激活，有望成为免疫获益的亚型之一［］,AR、SOXD及EGFR或许可以成为潜在的治疗方向。本文采用免疫组化法检测TNBC中AR、SOX10、EGFR及PDA)的表达，探讨其临床病理特征与预后的关系，为TNBC的治疗与预后提供参考。
天津大学图书馆1材料与方法
H材料收集2002年-月~2018年D月河北医科大学第四医院乳腺中心存档的557例临床病理资料及预后随访资料完整的TNBC，其中手术标本3D例，穿刺标本204例。患者均为女性，中位年龄5)岁(23~83岁、，中位随访时间 74个月(6~D4个月、。
1.2方法标本均经D%中性福尔马林固定，石蜡包埋, HE染色，由两名病理医师进行诊断。兔抗人AR(EPD0)-SOX14(EP273)、EGFR(EP22)及免疫组化EnVisWn法试剂盒，均购自福州迈新公司。AR和SOXD阳性定位于细胞核,EGFR阳性定位于细胞膜或细胞质。PD-L1(SP144)试剂
[9]Fang Z,Cao B,Liao J M,ei ah SPIN1promotes tumo/oexesis bp
blocking the uL18(universal large/bosomal suUuui-proteiu18--MDM2-p55pathway io humao caucer[J].E/fe,2418,7:e51275. 19]郝美玲，程玉，刘海旺，等.胃癌中ANP表达与BMP信号通路相互作用对细胞侵袭、转移的影响[J].临床与实验病理学杂志，2929,36(1)：31-15.
[11]Lamoxil l e S,Xu J,Deauch R.Mokcolas mechanisms of efitheli-
ai-mexchymai tauitWo J].Na-Rev Mol Cell BWi,2414,15
(5)：173-196.
12]王晓萌，杜建层，丁洋，等.Slug在调控宫颈鳞状细胞癌上皮-间充质转变中的意义J].临床与实验病理学杂志，2412, 28(9)：975-97&[13]Lee H H,Lee S H,Soag KY,ei ah Evalua/ox of Slug expressiox
is uful for prefic/ng lymph node meWstasis and suaival io pa-tiexU with gastric caucerJ].BMC Caucer,2917,17(1)：679. [14]Towes-Maniuez A C,Gallarko-Eera J F,Lag-Holguiu AN,e aO
CAuPiu-66x33000)cell idvasivexess through cAudiu-S io AGS hu-mao aPexocaainoma gastric caucer cells J]Exp Cell Res:2417, 359(1)：224-235.
[15]Manihez-Estada O M,Culkres A,Soriauo F X,e ah The Uau-
sc/ptiox factors Slug and Snail act as repressors of CAudiu-S ex- pressiox io ef/he/al cells J].Biochem J,2006,394(Pt2)：249
-457.
