百日咳PT、FHA和Prn血清抗体检测方法的建立及验证
徐颖华 骆鹏 王丽婵 卫辰 侯启明 张庶民
中国药品生物制品检定所血清室（北京 100050数学是谁发明的）
摘要: 目的 建立定量检测抗PT、FHA和Prn抗体的ELISA方法。方法 分别应用纯化的百日咳毒素（PT）、丝状血凝素（FHA）和百日咳粘附素（Prn）作为包被抗原，百日咳血清抗体国际参考品为标准品，建立定量检测抗PT、FHA和Prn抗体的ELISA方法。结果 建立了三种定量检测ELISA方法，并进行方法学验证，结果显示定量检测抗PT抗体的ELISA方法的最低检测限度为1.31IU/ml，批内和批间变异系数分别为9.99%和11.55%，回收率为97.19%；检测抗FHA抗体方法的最低检测限度为1.02IU/ml，批内和批间变异系数分别为11.01%和12.76%巨变，回收率为101.20%；检测抗Prn抗体方法的最低检测限度为0.51IU/ml，批内和批间变异系数分别为9.00%和11.18%，回收率为107.83%；本研究建立的ELISA与国外同类方法对30份血清样本分析，检测结果无显著性差异。应用上述建立的三种ELISA法检测分析三组份无细胞百日咳疫苗基础免疫接种后免疫原性分析。结论 本研究建立的百日咳血清抗体检测ELISA方法的准确度高和重复性好，无需特殊仪器，适合于广大实验室的开展，可用于无细
胞百日咳疫苗接种后效果观察和百日咳流行病学研究。
关键词 百日咳，酶联免疫吸附实验，定量检测，无细胞百日咳疫苗
Development and validation of ELISA assays for determination of rum antibody against pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, pertactin of B. pertussis
XU Ying-hua, LUO Peng，WANG Li-chan, WEI Chen, HOU Qi-ming, ZHANG Shu-min (Department of Serum, National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijing 100050, China)
Abstract
Objective To develop three ELISA methods for quantitative determination of IgG antibody against pertussis toxin (PT), filamentous hemagglutinin (FHA), pertactin (Prn) in human s
erum, respectively. Method Purified PT, FHA and Prn and international reference pertussis rum were ud as coating antigen and standard for development of three ELISA assays. Results Three ELISA assays had been established for determining anti-PT, FHA and Prn antibody, respectively. The limit of quantification of the assays had been demonstrated for anti-PT antibody with 1.31IU/ml, for anti-FHA antibody with 1.02IU/ml, for anti-Prn antibody with 0.51IU/ml. The average intra-assay coefficient of variation of three assays was 9.99%、11.01%和9.00%.The average inter-assay coefficient of variation of three assays was 11.55%、12.76%和11.18%, respectively. The average recovery rates of three assays were 97.19%、101.20%和107.83%, respectively. Three antibody levels in 30 rum sample were detected by ELISA methods developed in this study were not difference significantly in comparison with that of similar method from other country. The methods were applied for immunogenicity analysis of three-component acellular pertussis vaccine in the clinical trial. Conclusion Three quantitative ELISA methods had been demonstrated to be simple, accurate and reproducible. Which were ud for evaluation of immunogenicy of acellular pertussis vaccine and investigation of pertussis epidemiology.
Key words: Pertussis, ELISA, Quantitatively analysis, Acellular pertussis vaccine
百日咳是由百日咳杆菌引起的一种严重急性呼吸道传染病，传染性较强，人群普遍易感，其中尤以婴幼儿多见，是严重威胁人类健康的主要传染病之一[1]。百日咳毒素（pertussis toxin, PT）、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin, FHA）和百日咳粘附素（pertactin, Prn）是百日咳杆菌生产过程中产生的生物活性物质, 与百日咳杆菌粘附和定居在宿主呼吸道的上皮细胞、引起患者临床症状有关，是百日咳杆菌致病的重要毒力因子[2]。同时PT、FHA和Prn还具有较强的免疫原性，能刺激机体免疫系统产生特异的保护性抗体，至今，已被世界上很多国家作为无细胞百日咳疫苗的组成成分[3]。本实验目的是建立定量检测抗PT、FHA和Prn抗体的酶标免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)方法，并进行方法学验证，应用于无细胞百日咳疫苗临床试验免疫原性评价，为无细胞百日咳疫苗的质量控制、百日咳诊断和流行病学研究提供物质基础。
材料和方法
1 试剂
包被抗原PT、FHA和Prn本室保存；WHO百日咳血清抗体参考品(NIBSC 06/140)（含抗PT-IgG, 335IU/ml；抗FHA-IgG, 130IU/ml和抗Prn-IgG, 65IU/ml），羊抗人辣根过氧化物酶标记抗体为美国Jackson公司产品，96孔酶标板为德国Greiner朗读者文章精选公司产品，底物OPD为美国Sigma公司产品，其他试剂为国产分析纯。
2 ELISA检测方法的建立
应用方阵滴定法分别确定PT、FHA和Prn包被抗原的最佳工作浓度，将包被抗原用PH9.6碳酸盐缓冲液稀释至以上确定的包被浓度，以100 μl/孔包被ELISA板，4研究性学习报告℃过夜。然后在已包被有百日咳抗原的酶标板中加入等体积一系列不同稀释度浓度（1:100-102400）抗体参考品，用于确定各种抗体检测方法的检测线性范围，以抗体参考品不同稀释度为横坐标（河北社保查询X动态感值），其相应的吸光度值（Abs）为纵坐标（爱情攻略Y值），应用美国Molecular Devices酶标仪Softmax Pro软件分析进行四参数拟合绘制标准曲线。
3 方法学鉴定
3.1最低检测限度
应用已建立的三种网络安全资料ELISA方法分别测定系列倍比稀释的WHO百日咳血清抗体参考品（抗PT-IgG抗体最低浓度稀释至0.16IU/ml、抗FHA-IgG抗体最低浓度稀释至0.06IU/ml和抗Prn-IgG抗体最低浓度稀释至0.03IU/ml）样品，检测方法的最低检测限度。
3.2准确度
在未接种百日咳疫苗的0-3月健康婴儿血清中分别添加已知的抗PT抗体167.5 IU/ml（或抗FHA抗体65IU/ml，抗Prn抗体分别为32.5IU/ml），再进行ELISA检测，每种抗体至少检测10份样品，计算抗PT （或FHA和Prn）抗体含量，根据公式（回收率（%）=测得值/真实值×100%）最后得出回收率。
3.3精密度（重复性试验）
选取含抗PT抗体高（167.5IU/ml）和低（83.8IU/ml）浓度的溶液（或抗FHA抗体浓度溶液分别为65 IU/ml和32.5 IU/ml，抗Prn抗体溶液分别为32.5IU/ml和16.3IU/ml）各10份样品，重复测定3次，计算批内变异系数和批间变异系数，评价方法的精密度。
3.4 与国外同类方法比较
应用已建立的三种定量检测百日咳血清抗体的ELISA方法和国外疫苗生产厂家提供的三种经验证定量检测百日咳血清抗体同类方法测定30份血清样本，配对t检验分析检测结果。
4 应用研究
应用已建立的三种定量检测百日咳血清抗体的ELISA方法，对进口三组份无细胞百日咳疫苗用于基础免疫接种婴幼儿的免疫原性进行分析。免疫接种前采集血清样品稀释10倍，免疫接种后采集血清稀释200倍，超出检测范围的样本，将其稀释再进行检测，最后根据标准曲线，样本的吸光度值及各自的稀释倍数，计算出样本中相应的抗体含量。
结果
1 ELISA方法标准曲线的建立
应用方阵滴定法确定了ELISA方法中各种抗原PT、FHA或Prn的包被最佳工作浓度分别为3 μg/ml，以抗体参考品8个不同稀释度（1:400-51200）为横坐标（X值），其相应的吸光度值（Abs）为纵坐标（Y值），应用酶标仪Softmax Pro软件拟合各种ELISA方法四参数标
准曲线，获得曲线的四参数方程。检测抗PT抗体的ELISA方法标准曲线四参数方程为：X＝589.57×｛（3.642－Y)/[1+（Y-0.037）1/0.794]｝，R2为0.999；检测抗FHA抗体的方法标准曲线四参数方程为：X＝980.34×｛（2.807－Y)/[1+（Y-0.057）1/0.869]｝，R2为0.995；检测抗Prn抗体的方法标准曲线四参数方程为：X ＝619.23×｛（2.816－Y)/[1+（Y-0.072）1/0.982]｝，R2为0.988；这些结果也证实了百日咳抗体参考品浓度与相应吸光度值之间在检测范围内有良好的线性关系，表明了这些ELISA检测方法的可靠性。
