昆明医科大学学报2021,42(3):1-4 Journal of Kunming Medical University DOI:10.12259/j.issn.2095-610X.S2*******
CN53-1221/R
DC-Chol阳离子脂质体佐剂对流感疫苗免疫效果的影响
刘艳红，赵祥月，谢青昕，普梦笛，鲁卫东
(昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，云南昆明650500)
［摘要］目的观察阳离子脂质体DC-Chol修饰的四价流感疫苗的免疫原性。方法采用薄膜分散结合冻融-冻干法制备DC-Chol脂质体，检测其包封率。将小鼠分为七组，为DC-Chol脂质体疫苗组(250wg/只、500p,g/只、750^g/只、900pg/只)、PBS组、中性脂质体组、疫苗原液组(»=3)，通过MTT法确定DC-Chol脂质体的最佳剂量。将小鼠分为四组，DC-Chol脂质体组、疫苗原液组、中性脂质体组以及PBS对照组，腹腔免疫小鼠，于第7天、14天、28天处死，MTT法和T淋巴细胞表面标记实验检测小鼠淋巴细胞增殖情况观察免疫原性。结果MTT实验表明，DC-Chol修饰脂质体的最佳用量为500憾/鼠(P<0.05);T淋巴细胞表面标记实验显示，DC-Chol阳离子脂质体能明显增强脾淋巴细胞数(P<0.05)o结论与中性脂质体相比，DC-Chol阳离子脂质体作为四价流感疫苗的佐剂具有良好的免疫增强作用。
［关键词］脂质体；DC-Chol；流感疫苗；细胞免疫
［中图分类号］R392［文献标志码］A［文章编号］2095-610X(2021)03-0001-04
Influence of DC-Chol Cationic Liposome Adjuvant on the Immune Effect of Tetravalent Influenza Vaccine
LIU Yan-hong,ZHAO Xiang-yue,XIE Qing-xin,PU Meng—di,LU Wei-dong {School ofPharmaceutical Science and Yunnan Key Laboratory ofPharmacology f ar Natural Products,Kunming Medical University,Kunming Yunnan650500,China)
［Abstract］Objective To study the immunogenicity of the tetravalent influenza vaccine modified by cationic liposome DC-Chol.Methods DC-Chol liposomes were prepared by thin film dispersion-freeze-thaw—freeze-drying method,and the encapsulation rate was determined.The mice were divided into ven groups,DC-Chol liposome vaccine group(250pg/mou,500pg/mou,750^ig/mou,900p.g/mou),PBS group,vaccine stock solution group,neutral liposome group(n二3)Determine the optimal do of DC-Chol liposomes by MTT method.The mice were divided into4groups,DC-Chol liposome group,vaccine stock solution group,neutral liposome group and PBS control group.Mice were immunized through the peritoneum
and sacrificed on the7,14, and28days.The proliferation of mou lymphocytes was detected by MTT method and T lymphocyte surface labeling experiment to study its immunogenicity.Results The MTT experiment showed that the optimal do of DC-Chol modified liposomes was500|ig/rat(P<0.05);T lymphocyte surface labeling experiments showed that DC-Chol cationic liposomes significantly incread the number of splenic lymphocytes(P<0.05).Conclusion Compared with neutral liposomes,DC-Chol cationic liposomes as an adjuvant of tetrovalent influenza vaccine has good immune enhancement effect.
［Key words］Liposome;DC-Chol;Influenza vaccine;Cellular immunity
［收稿日期］2020-12-10
［基金项目］云南省生物医药重大科研专项基金资助项目(2018ZF006)
［作者简介］刘艳红(1995~)，女，云南大理人，在读硕士研究生，主要从事颗粒型疫苗佐剂研究工作。
［通信作者］鲁卫东，E-mail：130****************
2昆明医科大学学报第42卷
接种疫苗被认为是世界范围内预防感染最经济的措施。一种有效的佐剂对于提高疫苗接种效率是非常必要的。脂质体是磷脂双分子层包裹水相而构成的类球状微囊，按电荷性质可分为中性脂质体、阴离子脂质体和阳离子脂质体⑴。其中阳离子脂质体比阴离子和中性脂质体更有效，可延长在注射部位抗原的停留时间，增加抗原提呈，并诱导更强的免疫反应炉可。
DC-Chol（30-［N-（N‘，N'-二甲基氨基乙烷）-氨基甲酰基］）是胆固醇衍生物，含有一个叔胺基团。DC-Chol毒性相对较小凶，通常与脂质二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）结合使用炉7〕。胆固醇是经典脂质体配方的主要成分，被阳离子衍生
物（DC-Chol）取代，形成PLUSCOM®，可有效吸附抗原4。］。ISCOMs作为佐剂，以多种方式增强免疫反应，通过抗原提呈细胞对微粒优先摄取，
PLUSCOM在诱导抗原特异性CD8T细胞反应方
面与经典ISCOMs一样有效。
本研究以四价流感病毒裂解疫苗原液作为模
型药物，探讨DC-Chol修饰脂质体作为载体对该疫苗的免疫增强效果。研究中选择市售疫苗原液
和PBS作为对照组，比较DC-Chol脂质体作为疫
苗佐剂的免疫增强效果。同时还对DC-Chol脂质
体中DC-Chol用量与免疫原性的量效关系进行了初步研究，为阳离子脂质体佐剂的开发奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1流感疫苗均由江苏沃森生物技术有限公司提供。H1N1批号SA2018002,H3N2批号SB 2018002,B（V）批号SC2018001,B（Y）批号SC22018 0060
1.1.2实验动物SPF级昆明种小鼠，雌性，6~8周龄，体重18~22g，由昆明医科大学实验动物中心提供［合格证号为SCXK9（滇）2005-0008］o
1.13主要试剂大豆卵磷脂（北京美亚斯磷脂技术公司）；胆固醇（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；DC-Cholesterol（Avanti Polar Lipids, USA）;MTT（北京博奥拓达科技有限公司）；Antimou CD4PE、Anti-mou CD8a FITC（e Bioscience, USA）O
1.2方法
七夕的意思1.2.1DC-Chol脂质体的制备采用薄膜分散法和冻融-冻干法财。将胆固醇（80mg）和大豆磷脂（300mg）溶于无水乙醇，减压旋转成膜；在水化的脂质体混悬液中加入DC-Chol水浴静置，加入一定量流感疫苗原液，制备脂质体冻干粉。
1.2.2DC-Chol脂质体包封率检测高速离心取上清液，通过Lowry蛋白法［闵计算包封率。
1.2.3DC-Chol脂质体量效关系研究小鼠随机分为七组，每组3只，不同剂量DC-Chol脂质体组（250、500、750、900ng/只）、PBS组、疫苗原液组、中性脂质体组，抗原剂量为6憾/只。腹腔免疫后第7天处死，通过MTT法呵测定刺激指数（SI）确定最佳DC-Chol剂量。
1.2.4DC-Chol脂质体细胞免疫原性研究在方法1.2.3确定最佳用量的基础上制备脂质体进行免疫实验。小鼠随机分为PBS组、疫苗原液组、中性脂质体组、DC-Chol脂质体组，每组9只，腹腔免疫，于第7天、14天、28天处死，MTT方法检测各组SI值，流式细胞术检测T淋巴细胞表面标记。
1.3统计学处理
采用SPSS17.0软件进行统计分析，多组间比较通过单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1DC—Choi脂质体包封率结果
蛋白含量测定的标准曲线为Y=0.0032X-0.0009，相关系数R2=0.9984，在10~100jig/mL 范围内有良好线性关系。DC-Chol流感疫苗脂质体包封率结果，见表1。
表1不同含量的DC-Chol阳离子脂质体的包封率Tab.1Encapsulation efficiency of DC-Chol cationic liposomes with different contents
DC-Chol含量（pg/鼠）包封率（％）
25059.17
50070.44
75068.78
9006&78
2.2DC-Chol脂质体量效关系研究
检测结果显示，与PBS组、疫苗原液组相比较，剂量分别为250、500、750、900憾的DC-Chol组差异
有统计学意义（P<0.05），表明DC-Chol脂质体有较好的免疫原性，见图1；500、750、900憾组三个剂量组间比较差异无统计学意
第3期刘艳红，等.DC-Chol阳离子脂质体佐剂对流感疫苗免疫效果的影响3
图1不同剂量DC-Chol7d时的SI
Fig.1SI of different dos of DC-Chol on7d
与PBS比较，*P<0.05；与原液比较，#P<0.05o
义(P>0.05)，选择500憾/鼠为DC-Chol修饰脂质体疫苗的最佳用量。
2.3DC-Chol修饰流感疫苗脂质体细胞免疫原
性研究
2.3.1脾淋巴细胞增殖实验DC-Chol脂质体组与中性脂质体组、疫苗原液组、PBS组比较差异有统计学意义(P<0.05)，且SI值高于各组，说明DC-Chol阳离子脂质体能有效刺激脾淋巴细胞增殖，产生较早较强的免疫原性，增强细胞免疫，见图2。DC-Chol脂质体组7d时刺激小鼠脾淋巴细胞增殖的强度最大，
诱导细胞免疫的水平最高，但其14〜28d SI值稍有上升，说明抗原刺激机体时产生的抗体不会一直存在于机体中，部分会通过以代谢或排泄的方式排出体外，但仍然有细胞免疫原性的存在即记忆细胞。
电信客户图2—个免疫周期的SI
Fig.2SI of an immune cycle
与PBS比较，*P<0.05；与原液比较，#P<0.05o
2.3.2T淋巴细胞表面标记实验由图3可知，DC-Chol脂质体组与中性脂质体组、疫苗原液组、PBS组比较差异有统计学意义(Pv0.05)，说明DC-Chol阳离子脂质体可增强细胞免疫；免疫相同周期时，DC-Chol组28d与14d的CD4+/CD8+值进行比较差异有统计学意义(PV0.05)，随着时间的
4
3
2
1
■PBS■原液
■中性■DC-Chol -#* lillil1428
图314d、28d时CD4+/CD8+比值
Fig.3CD47CD8+on4d28d
与PBS比较，字<0.05；与原液比较，#P<0.05o
延长，DC-Chol修饰的脂质体疫苗对脾淋巴细胞的刺激强度增加，有延长免疫时间的作用。
3讨论
阳离子脂质体已成为新一代的疫苗佐剂和给药系统。Yifan Ma[14]通过制备不同表面电荷密度的阳离子脂质体，作用于C57小鼠，采用ELISA 方法和流式细胞术发现阳离子脂质体能诱导更强的免疫反应，证实了阳离子脂质体的免疫调节作用主要是由于其表面电荷密度，而不是阳离子脂质体的浓度。Brunel等口将DC-Chol用于乙型肝炎疫苗，结果表明DC-Chol具有免疫调节作用，能诱导BALB/c小鼠的Thl和Th2型免疫反应。Rui等MG开发了一种由肺炎球菌表面蛋白a和阳离子DC-Chol脂质体组成的肺炎球菌鼻腔疫苗，用小鼠肺炎链球菌感染模型验证了该疫苗的有效性。DC-Chol脂质体能同时诱导
体液免疫和细胞免疫，诱导产生IgGl和IgG2a；DC-Chol脂质体还能诱导粘膜免疫叶⑻。阳离子脂质体能够运载不同种类的药物或作为疫苗载体，且到目前人们仍然不断开发其应用潜力。阳离子脂质体的毒性在一定程度上限制了它的应用，未来需要更加深入研究其结构和作用机制，设计出更加低毒高效的阳离子。
本实验中制备的DC-Chol脂质体疫苗包封率均在50%以上。选择PBS、市售流感疫苗原液以及中性脂质体作为对照组，在一个免疫周期内DC-Chol脂质体的SI值始终高于其他组，提示DC-Chol流感疫苗脂质体冻干粉在体内可产生细胞免疫，延长免疫时间，具有明显的佐剂效果。该实验为今后研究DC-Chol脂质体佐剂提供了初步参考，未来还需对其作用机制和安全性方面深入研究
。
4昆明医科大学学报第42卷
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