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国际生物制品学杂志2020 年12 月第 43 卷第 6 期Int J Biologicals，December 2020，Vol. 43，No. 6
•论著•四价流感病毒裂解疫苗生产用毒种传代
稳定性研究
李貌王英张静刘伟芳刘宏博尹姣周辉刘云龙明平刚赵巍购物环境
武汉生物制品研究所有限责任公司流感病毒疫苗室430207
通信作者：赵巍，Email:zwei_
【摘要】目的研究四价流感病毒裂解疫苗生产用毒种的传代稳定性，确保毒种适用于疫苗生产。
方法将W H O推荐的季节性流感疫苗甲型H1N1和H3N2、乙型B V和BY病毒株(原始种子批)在鸡
胚中传代扩增，制备生产用主种子批和工作种子批毒种。按中国药典2015年版三部的要求对毒种进行
检定，包括鉴别试验、病毒滴度和血凝滴度测定、外源微生物检査等。将毒种连续传10代，用反转录
PCR扩增第2、3、4、5、10代病毒鸡胚尿囊液中的血凝素和神经氨酸酶（neuraminida,NA)的基因片
段，并进行序列测定，分析传代过程中血凝素和N A的核苷酸和氨基酸序列同源性。结果主种子批和
工作种子批毒种的抗原性均与推荐的病毒株一致。各型病毒滴度均>6.5 lg半数鸡胚感染量/ml，血凝
滴度均多1 :160。2个种子批的支原体和无菌检査结果均为阴性，主种子批外源性禽白血病病毒和禽腺
原来的我原唱
病毒检查结果亦为阴性。毒种在鸡胚中连续传代后，各型病毒株血凝素和N A的核苷酸序列同源性均
>99%，氨基酸序列同源性均为1()0%。结论四价流感病毒裂解疫苗生产用毒种具有良好的传代稳定
图片元宵节
性，可用于疫苗生产。
【关键词】流感疫苗；血凝素糖蛋白类，流感病毒；神经氨酸酶；传代稳定性
DOI：10. 3760/cma. j. cn311962-20200318-00029
Study on the passage stability of the virus eds for quadrivalent influenza virus-split vaccine production
Li Mao，Wang Y ing，Zhang J in g，Liu Wei f a n g，Liu Hongbo，Yin J iao，Zhou H u i，Liu Yurdong，
Ming Pinggang, Zhao Wei
Department o f Influenza Vaccine，Wuhan Institute o f Biological Products Co.，L td.，Wuhan 430207，
China
Corresponding author ••Zhao W ei，Email: zwei一zu@l63. com
【Abstract】Objective To study the passage stability of virus eds ud for quadrivalent influenza
virus-split vaccine to ensure their application in vaccine production. Methods The influenza A (H lN l
and H3N2) and influenza B (BV and BY) virus strains (original ed lot) recommended by WHO for
asonal influenza vaccine were pasd and amplified in chicken embryos to prepare the virus eds of
master ed lot and working ed lot. Then the virus eds were verified according to Chine
pharmacopoeia 2015 (Volume 1H ), including identification test, virus titer and hemagglutination titer
detections, and exogenous microorganism examination. Virus eds were continuously pasd to the 10th
generation. The hemagglutinin (HA) and neuraminida (NA) gene fragments of the 2nd, 3rd，4th,
5th, and l()th generation virus from chicken embryo allantoic fluid were amplified with rever
transcription-PCR and quenced to analyze the nucleotide and amino acid quence homology during
passage. Results The antigenicity of master ed lot and working ed lot virus was consistent with
the virus strains recommended. All type virus titers were >6. 5 lg 50% egg infective do/ml, and the
hemagglutination titers were ^1 :160. Mycoplasma and sterility test results were negative in both ed
lots. Exogenous avian leukosis virus and avian adenovirus were also negative in master ed lot. The HA
and NA nucleotide quence homology was >99% and amino acid quence homology was 100 % after the
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virus strains were concutively pasd in chicken embryos. Conclusion The virus eds of quadrivalent
influenza virus-split vaccine have good passage stability and can be ud for vaccine production.
【Key words】Influenza vaccines; Hemagglutinin glycoproteins, influenza virus；Neuraminida；
Passage stability
DOI ：10. 3760/cma. j. cn311962-20200318-00029
接种疫苗是预防流感最有效的措施[1]。由于流 感病毒不断通过改变其表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin,HA )和神经氨酸酶(neuraminida，NA)逃避人体免疫系统的攻击，因此流感疫苗生产用毒株必须每年更换[2]。W H O每 年公布全球流感病毒流行株，然后由相关机构向全 球疫苗厂家分发生产用原始种子[3]。鉴于流感病毒 极易发生抗原漂移，检测流感病毒株在鸡胚中的传 代稳定性是保障疫苗有效性的前提。
本研究中，我们对武汉生物制品研究所有限责 任公司(武汉公司）制备的四价流感病毒裂解疫苗生 产用毒种的传代稳定性进行了观察。
1材料与方法
1. 1毒种和鸡胚
甲型H1N1、H3N2和乙型B V流感病毒原始 种子批(P1代)来自英国国家生物制品检定所，分别 为 A/Brisbane/()2/2(>18(IVR-19())、A/Kansas/14/ 2017 (NYMC X-327 ), B/Maryland/15/2016 (NYMC BX-69A)；乙型B Y流感病毒原始种子批 来自澳大利亚墨尔本维多利亚传染病参考实验室，为 B/Phuket/3073/2U13(BVR-lB)。所有毒种均为 W H O推荐的2019—2020年北半球季节性流感病 毒流行株。
无特定病原体级鸡胚(9〜11日龄)来自北京勃 林格殷格翰维通生物技术有限公司。
1.2试剂和仪器
本研究的主要试剂和仪器见表1。
内蒙古大学研究生院1.3样品制备
将各型流感病毒P1代毒种用PBS稀释后接种 鸡胚尿囊腔，置于33〜35 °C、相对湿度60 %〜80%环境中培养48〜72 h,2〜8 °C冷却后收获血凝滴度 高于1M60的鸡胚尿囊液，制备主种子批（P2代）毒种。同法制备工作种子批（P3代）毒种以及第4 至第10代(P4—P10)毒株。
1.4种子批检定
依据中国药典2015年版三部（药典三部)[4]的要求对主种子批和工作种子批毒种进行检定。
1.4. 1鉴别试验将待检毒种稀释配制成4个血 凝单位抗原，与不同稀释度的4个型别抗血清标准 品进行反应。
表1流感疫苗生产用毒种传代稳定性研究的主要试剂和仪器
试剂/仪器来源批号
1%鸡红细胞武汉生物制品研究所有限责任公司-
pH7. 2 PBS武汉生物制品研究所有限责任公司-
RNA 提取试剂盒Viral RNA Isolation Kit成都福际生物技术有限公司-
DNA 扩增试剂盒PrimeScript™ High Fidelity RT-PCR Kit宝生物工程(大连)有限公司-
基因扩增仪德国Biomet r a公司-
水平电泳槽美国Bio-Rad公司-ImageQuant 30U凝胶成像系统美国G E公司-
甲型H1N1 抗原标准品A/BrLsbane/()2/2(>18(IVR-190)英国国家生物制品检定所18/238
甲型H1N1 抗血清标准品anti-A/B risbane/()2/2018-like(H lN l)H A rum英国国家生物制品检定所19/102
甲型H3N2 抗原标准品A/Kansas/14/2()17(NYM C X-327)英国国家生物制品检定所19/104
甲型H3N2 抗血清标准品anti-A/K ansas/l4/2017-like(H3N2)H A rum英国国家生物制品检定所19/152
乙型BV 抗原标准品B/M aryland/15/2()16(NYM C BX-69A)英国国家生物制品检定所18/100
乙型BV 抗血清标准品anti-B/Colorado/()6/2017-like rum英国国家生物制品检定所18/170
乙型BY 抗原标准品B/Phuket/3073/2()13(BVR-lB)澳大利亚治疗用品管理局2017/117B 乙型BY 抗血清标准品anti-B/Phuket/3()73/2()13-like rum澳大利亚治疗用品管理局AS425注：-•.无
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加入1%鸡红细胞，将鸡红细胞不能完全凝集 的最高稀释度定为血清的血凝抑制(hemagglutination inhibition，H I)滴度。以相应抗 原标准品作为阳性对照。若待检毒种与同型别抗血 清标准品反应的H I滴度比与不同型别抗血清标准 品反应的H I滴度高4倍以上，则认为其抗原性与 当年推荐的毒株一致。
1.4.2病毒滴度测定采用半数鸡胚感染量(50% egg infective do,EID5…)法检测。将样品 10 倍系 列稀释后接种鸡胚，培养48〜72 h。若鸡胚尿囊液 使1%鸡红细胞凝集，则判定为病毒感染阳性，以Reed-Muench法计算病毒滴度。按药典三部规定，应不低于 6.5 lgEID5,,/ml。
1.4.3血凝滴度测定采用直接血凝法检测。将 样品5倍稀释后再进行2倍系列稀释，加人1%鸡 红细胞，能使鸡红细胞完全凝集的最高稀释度即为 血凝滴度。按药典三部规定，应不低于1 :16()。
过年祝福领导
1.4.4支原体检查采用培养法和指示细胞培养法(D N A染色法）检测。按药典三部通则3301规 定，培养法中接种样品的培养基应无支原体生长；DNA染色法中样品和阴性对照的指示细胞应仅见 细胞核呈现黄绿色荧光。
1.4.5无菌检查采用薄膜过滤法检测。按药典 三部通则1101规定，应无菌生长。
1.4.6外源性禽白血病病毒及禽腺病毒检查对主种子批毒种进行检查。以相应亚型抗血清标准品 中和病毒后，接种鸡胚细胞。用酶联免疫法检测培 养物，外源病毒应为阴性。该检查委托中国食品药 品检定研究院进行。
1.5毒种的传代稳定性分析
对P2、P3代毒种及P4、P5、P1()代病毒株的鸡胚尿囊液样品进行传代稳定性分析。4个型别毒株 的H A和N A基因序列从全球共享禽流感数据库 (GISAID)获得，由生工生物工程(上海)股份有限公 司（生工公司)合成相应引物，见表2。
采用RNA提取试剂盒提取各型P2、R3、P4、P5、P l()代样品中的流感病毒总RNA，用DNA扩增试剂 盒对总RNA进行反转录和H A和/V A目的基因片 段PCR扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，送生工公司进行序列测定。利用DNAClub软件将核 苷酸序列转换成氨基酸序列，用DNAMAN软件比对 核苷酸序列和氨基酸序列的同源性。
2结果
2.1种子批检定
主种子批和工作种子批毒种的鉴别试验结果显 示，各型病毒株的抗原性均与推荐的病毒株一致。支原体、无菌检查结果均为阴性，主种子批毒种外源 性禽白血病病毒和禽腺病毒检查结果亦为阴性。病 毒滴度和血凝滴度测定结果见表3。
表3 四价流感病毒裂解疫苗生产用毒种的
病毒滴度和血凝滴度测定结果
型别
病毒滴度川8£1〇5,,/〇11)血凝滴度
主种子批工作种子批主种子批工作种子批标准不低于6. 5不低于1:160甲型H1N19.510. 01：640 1320
甲型H3N210. 110.31：160 1160
乙型BV9.511.91：320 1320
乙型BY9.29.41: 160 1160
注：EID5…：半数鸡胚感染量
2.2毒种的传代稳定性
2.2.1甲型H1N1和iVA基因扩增产物见图1，H A约为1 700 bp，A〖A约为1 500 bp，与预期相符。
表2流感病毒株血凝素和神经氨酸酶基因的序列编号、长度及引物序列
型别
血凝素基因神经氨酸酶基因
序列编号长度/bp引物序列序列编号长度/bp引物序列
甲型H1N1EPI138******** F ： CTTagcaaaagcaggggaaaataaaag
R ： CTGagtagaaacaagggtgttttttc EPI 138******** F ： CTGagcaaaagcaggagtttaaaatg
R： CTTagtagaaacaaggagttttttgaac
甲型H3N2EPI14153711762 F ： CTTagcaaaagcaggggataattct
R ： CTGagtagaaacaagggtgtttttaat EPI 14356841466 F ： CTTagcaaaagcaggagtaaagatg
R：CTGagtagaaacaaggagttttttct
乙型BV EPI12079351879 F ： CTTagcagaagcagagcattttctaat
R ： CTGagtagtaacaagagcatttttcaat EPI 12079361558 F ： CTTagcagaagcagagcatcttc
R ： CTGagtagtaacaagagcatttttcag
乙型BY EPI ”403201812 F ： CTGatgaaggcaataattgtactactc
R ： CTGtaatgatgacaagcaaacaagc EPI11403191512 F ： CTTactgaggcaaataggccaaaaatg
R ： CTGtcagaaacaatcaagttcagtaag
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进一步对扩增产物进行序列测定和比对，结果显示 各代次H A和N A核苷酸序列均一致。与GISAID 中公布的同一毒株核苷酸序列比对，同源性为100%。将5个代次样品序列测定得到的核苷酸序 列转换成氨基酸序列，与G ISAID中公布的同一毒 株氨基酸序列比对，同源性为1()()%。
bp
500
300
注：M: ENA marker: ?2、133、？4、155、？10依次为第2、3、4、5、10代
图1甲型H1N H流感病毒 A/Brisbane/(I2/2018(IVR-I9l))各代次 目的基因片段的PCR扩增电泳图A血凝素基因B神经氨酸 酶基因
2.2.2 甲型H3N2 和A/A基因扩增产物见 图2,H A约为1 700 bp,JVA约为1 500 bp，与预期 相符。进一步对扩增产物进行序列测定和比对，结 果显示各代次H A和N A核苷酸序列均一致。与 GISAID中公布的同一毒株核苷酸序列比对，同源 性为1()()%。将5个代次样品序列测定得到的核苷 酸序列转换成氨基酸序列，与G ISAID中公布的同 一毒株氨基酸序列比对，同源性为1〇()%。与美国 CDC在GenBank中公布的基因序列（编号 MK025787)和A/A基因序列（编号MK025786)比对，同源性为！()
〇%。P10代核苷酸序列与GISAID中公布的同一毒株序 列比对，同源性为1(>()%。将各代次氨基酸序列与 美国CDC在GenBank中公布的同一毒株序列（编 号CY215354)比对，同源性为10()%。
N A基因扩增产物见图3，大小约为1 5()0 bp，与预期相符。各代次的核苷酸序列均一致，与GISAII)中公布的同一毒株的核苷酸序列和美国 C D C在G enB ank中公布的基因序列（编号CY215356)比对，同源性均为1(>()%。
bp
2 500
2000
1500
1000
500
300
bp M P2 P3 P4 P5 P10
500 ■
i'-
激活手机卡000■
5001
300 ■
⑨
注：M: DNA marker; ?2、？3、？4、？5、？1()依次为第2、3、4、5、1()代
图 3 乙型流感病毒 B/Maryland/15/2()16(NYMC BX-69A)各代次 目的基因片段的PCR扩增电泳图A血凝素基因B神经氨酸 酶基因
2. 2.4 乙型BY H A和N A基因扩增产物见图 4，H A约为1 800 bp，N A约为1 500 bp，与预期相 符。进一步对扩增产物进行序列测定和比对，结果 显示各代次和N A核苷酸序列均一致。与G ISA ID中公
布的同一毒株核苷酸序列比对，同源 性为U K)%。将5个代次样品序列测定得到的核苷 酸序列转换成氨基酸序列，与G ISA ID中公布的同 一毒株氨基酸序列比对，同源性为10U%。
bp
2 500
1000
500
300
骆驼祥子推荐语M P2 P3 P4 P5 P10
注：M: DNA marker; 132、？3、？4、135、？1〇依次为第2、3、4、5、1()代
图 2甲型 H3N2 流感病毒 A/KanS as/14/2017(NYMC X-327)各代 次目的基因片段的PCR扩增电泳图A血凝素基因B神经氨
bp M P2 F3 P4 P5 P10 bp M P2 P3 P4 P5 PIO
澀
1500
1000
500
300
注：M: DNAmarker; P2、P3、P4、P5、P10 依次为第 2、3、4、5、10 伐 图4乙型流感病毒B/Phuket/3(>73/2013(BVR-1B)各代次目的基 因片段的PCR扩增电泳图A血凝素基因B神经氨酸酶基因
酸酶基因
2.2.3乙型BV基因扩增产物见图3，大小约为18(K)b p，与预期相符。经比对，P3、P4、P5、P10代的核苷酸序列均一致;P2与其他代次的核苷 酸序列同源性为"• 9%，其中1(丨54位G突变为 T，但氨基酸序列同源性仍为100%。将P3、P4、P5、3讨论
本研究中.武汉公司制备的四价流感病毒裂解 疫苗生产用P2和P3代毒种的检定结果均达到药 典三部的
要求。药典三部规定，至成品疫苗病毒总 传代不得超过5代[4]，我们对各型病毒株P2、P3、P4、P5、P10代H A和N A
的核苷酸和氨基酸序列
国际生物制品学杂志 2020 年12 月第43 卷第 6 期Int J Biologicals，December 2020，Vol. 43，No. 6• 275 •
进行比对，结果核苷酸序列同源性均大于99%，氨
基酸序列同源性均为1〇〇%，说明传代对病毒主要 抗原表位的稳定性没有影响。将各型毒株H A和 N A的核苷酸序列与GISAID中公布的原始种子基
因序列进行比对，除B V的P2代核苷酸序列同
源性为99. 9%外，其余均达100%，证明生产用毒种
具有良好的传代稳定性。
B V的P2代H A核苷酸序列与其他代次相比 有一个碱基不同，但氨基酸序列并未发生改变。与 GISAID中的序列比对发现，碱基变化发生在较低 代次，后续代次该位点的碱基与原始种子一致。推 测该型毒株碱基发生改变的原因可能是在P
C R扩 增过程中发生了突变，也不排除P2代核苷酸
发生了同义突变，但在后续传代过程中又回复到突 变前的碱基[5]。
有研究表明，近年来流行的H3N2亚型疫苗毒 株，在鸡胚中连续传代可发生氨基酸序列突变或者 H A抗原位点糖基化，这些变化有利于病毒适应鸡 胚宿主，但与同时期人群中流行毒株发生的抗原漂 移又不相同，从而导致疫苗保护效力降低>8]。美国 CDC向GenBank上传了 H3N2和B V两个亚型毒 株的全基因组序列，武汉公司毒株与其核酸序列相 比，和]V A基因相似度达到100%。由此证实 武汉公司的H3N2亚型毒株在鸡胚中连续传10代 没有发生主要抗原表位改变，从而保证了疫苗的有 效性。
综上所述，流感疫苗生产用毒种在鸡胚中连续 传代至一定代次(第1()代），其主要抗原的氨基酸序 列未发生改变，具有良好的传代稳定性；同时毒种的 检定结果均符合药典三部要求，适用于疫苗的生产。由于季节性流感病毒株每年发生变化，而原始种子 制备机构通常不直接发布毒株的全基因组序列信息，因此需要关注传代过程中各代次毒株遗传特性 相较于原始毒株的变化，建议将原始毒株的基因序 列研究列入遗传稳定性研究项目。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
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