中国预防兽医学报
Chine Journal of Preventive Veterinary Medicine
第43卷第2期2021年2月
V ol.43No.2Feb.2021
doi ：10.3969/j.issn.1008-0589.202006001
猪链球菌三价灭活疫苗免疫佐剂的筛选
赵旭东1，陈坤鹏1，孔美萍3，薛
云1，王
臣1,2，董发明1,2，赵战勤1,2*
（1.河南科技大学动物科技学院兽医生物制品工程实验室，河南洛阳
471003；2.河南科技大学动物科技学院河南省高等学校
环境与畜产品安全重点学科开放实验室，河南
洛阳
471003；3.赛彼科（上海）特殊化学品有限公司，上海
201799）
摘要：为筛选适用于新型猪源链球菌（SS ）灭活疫苗的佐剂，本研究以SS1Z1株、SS2Z2株和SS7Z7株为
抗原，分别配制ISA201VG 双相油乳佐剂疫苗（简称ISA201疫苗）、GEL 02PR 水溶性聚合物佐剂疫苗（简称GEL 疫苗）、IMS1313N VG 水溶性纳米佐剂疫苗（简称IMS1313疫苗）、矿物油佐剂疫苗（简称油疫苗）、氢氧化铝胶佐剂疫苗（简称铝胶疫苗）共5种佐剂的三价灭活疫苗。豚鼠和仔猪安全性试验结果表明：油佐剂疫苗的副反应较大，其余疫苗的副反应较小。仔猪免疫保护试验结果显示：二免14d 后利用约为1LD 100的SS2Z2株对仔猪经耳缘静脉攻毒，ISA201疫苗、GEL 疫苗对仔猪的保护率均为100％，油疫苗和铝胶疫苗保护率分别为60%、40%，IMS1313疫苗组的保护率为0；利用1LD 100SS1Z1株攻毒后，ISA201疫苗、GEL 疫苗、油疫苗、铝胶疫苗和IMS1313疫苗对仔猪的保护率分别为100％、80％、80%、60%和0。综上结果表明，ISA201疫苗免疫仔猪能产生最高的抗体水平，同时提供了最高的保护效力，且副反应较小，确定ISA201为开发链球菌灭活苗的首选佐剂。
本研究为SS 三价灭活疫苗的研发奠定了基础。
关键词：猪链球菌；疫苗；佐剂中图分类号：S852.61
文献标识码：A
文章编号：1008-0589（2021）02-0178-08
Screening of immune adjuvant for trivalent inactivated vaccine of
Streptococcus suis
ZHAO Xu-dong 1,CHEN Kun-peng 1,KONG Mei-ping 3,XUE Yun 1,WANG Chen 1,2,
DONG Fa-ming 1,2,ZHAO Zhan-qin 1,2*
(1.Laboratory of Veterinary biologics Engineering,College of Animal Science and Technology,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China;2.Key-Disciplines Lab of safety of environment and Animal Product,College of Animal Science and Technology,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China;3.SEPPIC Shanghai Chemical
Specialties Co.Ltd (SSCS),Shanghai 201799,China)
Abstract :The objective of this study was to screen for the immune adjuvant for novel trivalent inactivated vaccine of Streptococcus suis (S.suis ).The trivalent inactivated vaccine was compod of S.suis rotype 1Z1strain,rotype 2Z2strain and rotype 7Z7strain as antigens,and the immune adjuvants screening here included:ISA201VG biphasic oil emulsion adjuvant (referred as ISA201vaccine),GEL 02PR water-soluble polymer adjuvant (referred as GEL vaccine),mineral oil adjuvant (referred as oil vaccine),aluminum hydroxide adjuvant (referred as Alh vaccine)and IMS1313N VG water-soluble nano adjuvant (referred as IMS1313vaccine).The safety trial results of guinea pigs and piglets showed that the side effects of mineral oil
收稿日期：2020-06-01
基金项目：国家自然科学基金项目（U1704117、31672530）作者简介：赵旭东（1991-），男，河南洛阳人，硕士研究生，主要从事家畜传染病及其疫苗研究.*通信作者：E-mail ：*******************
*Corresponding author
赵旭东，等.猪链球菌三价灭活疫苗免疫佐剂的筛选第2期
链球菌是乳酸杆菌目链球菌科链球菌属的一种
革兰氏阳性球菌，其抗原结构比较复杂，包括属特
异、群特异及型特异3类抗原。Lancefield根据群特
异性多糖抗原的差异，将链球菌分为20个血清群A~V（缺I和J），常见的为A~G群，但也有较多分离株不能判定群[1]。动物病原菌以B群、C群、不定群
较多，感染人的多为A群。猪链球菌病（Swine strep⁃tococcosis）是由几个血清群链球菌引起猪的疫病的总称，以败血症、脑膜炎、关节炎、淋巴结炎为主要发病特征。在我国猪群中，链球菌是分离率最高的细菌性病原[2]，链球菌C、D、E、L、S群也都曾导致我国猪链球菌病的流行[3]，如1976年在四川暴发猪链球菌病，病原为C群马链球菌兽疫亚种，直到上个世纪90年代后期，该病仍持续报道。但近年来，在我国猪群中猪链球菌（Streptococcus suis，SS）已取代传统的C群链球菌成为导致该病发生的主导血清群[4]。根据荚膜抗原的差异，SS可分为33个血清型（1~33型和1/2型，缺32）及相当数量无法定型菌株。SS1、SS2、SS7是猪的常见致病血清型，其中SS2最为重要，可感染人而致死，是重要的人-兽共患病原菌[5]。1998年在江苏，2005年在四川曾分别发生过严重的人-猪共患链球菌病事件。
目前，预防猪链球菌病的有效方法主要是接种
疫苗。其中佐剂是影响疫苗免疫效果的关键，良好
的佐剂可以增强机体对抗原的免疫应答，提高疫苗
的免疫效果。但是，国内在猪链球菌病疫苗佐剂的
研发比较滞后，还停留在白油、铝胶等传统佐剂的
使用上。另外，我国传统的预防猪链球菌病疫苗为C群马链球菌兽疫亚种的ST171株活疫苗（铝胶佐剂），与当前流行株SS2等抗原型完全不符；近年来上市的猪链球菌病灭活疫苗，如猪链球菌病灭活疫苗（马链球菌兽疫亚种XS株+猪链球菌2型LT株+猪链球菌7型YZ株，白油佐剂）、猪链球菌病蜂胶灭活疫苗（马链球菌兽疫亚种BHZZ-L1株+猪链球菌2型BHZZ-L4株）等，也分别存在与流行血清型不完全相符、白油佐剂副反应较大等问题。本研究室前期分别比较了几种新型佐剂在副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗和猪丹毒杆菌灭活疫苗中的使用效果[6-7]。本研究中以新分离的SS1、SS2型和SS7强毒菌株为抗原配以5种不同佐剂制成灭活疫苗，在豚鼠模型上对疫苗的安全性进行初步评价后，免疫仔猪进行疫苗安全性与免疫效力的评价，以期筛选出更适于猪链球菌灭活疫苗的佐剂，为后期猪链球菌病多价灭活疫苗研发奠定基础。
1材料与方法
1.1菌株及实验动物SS1Z1株、SS2Z2株和SS7 Z7株由河南科技大学兽医生物制品工程实验室分离、鉴定[8]；6周龄~8周龄SPF级雌性豚鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；3周龄~4周龄健康易感仔猪购自河南省伊川县农村散养户；健康易感仔猪标准：猪群近两年未发生过链球菌病，无链球菌病临床症状，未免疫链球菌相关疫苗，试验中所有仔猪均采集血清，经SS抗体ELISA检测试剂盒检测为阴性。
1.2主要试剂TSA（Trypticsoyagar）和TSB（Tryptic⁃soybroth）为美国BD公司产品；无支原体新生牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；Montanide TM ISA201VG双相油乳佐剂（简称ISA201）、Mon⁃tanide TM GEL02PR水溶性聚合物佐剂（简称GEL）、Montanide TM IMS1313VG N水溶性纳米佐剂（简称IMS1313）购自赛彼科特殊化学品（上海）有限公司；
adjuvant vaccine was most obvious and the rest were little.The immunoprotection trial results of the piglets showed that after14 days of cond immunization,piglets were intravenously challenged with1LD100S.suis2-Z2strain,both ISA201vaccine and GEL vaccine showed protection rate was100%meanwhile oil vaccine,Alh vaccine and IMS1313vaccine showed protection rate was 60%,40%and0,respectively.The other group piglets were intravenously challenged with1LD100S.suis1-Z1strain,and the results showed that ISA201vaccine,GEL vaccine,oil vaccine,Alh vaccine and IMS1313vaccine provided100%,80%,80%,60%, and0protective efficacy.Due to high saf
ety,easy of injection,rapidly immune respons,high levels of antibodies,and100% protection efficacy for piglets,ISA201was the best of the5adjuvants and could be the optimal adjuvant for the development of an inactivated vaccine against swine streptococcosis.This study provides the support and reference for the further lection of adjuvants for inactivated porcine streptococcal vaccine.
Key words:Streptococcus suis;vaccine;adjuvant
179
中国预防兽医学报2021年
矿物油佐剂Marcol-52（简称油）为美国埃克森美孚公司产品；氢氧化铝胶佐剂（简称铝胶）为美国通用化学集团公司产品；SS ELISA抗体检测试剂盒购自武汉科前生物股份有限公司。
1.3疫苗的制备根据参考文献[9]制备SS1Z1株、SS2Z2株和SS7Z7株灭活菌体抗原：将Z1株、Z2株和Z7株分别接种于含新生牛血清（终浓度10％）TSA平板上，37℃培养24h~48h后挑取单菌落传代培养一次，挑取培养好的单菌落到含新生牛血清（终浓度10％）的TSB液体培养基振荡培养18h~22h。收获3种菌液后，分别单独灭活。按菌液总量的0.3％加入甲醛溶液，在37℃灭活48h。经检验合格完全
灭活后，菌液通过中空纤维超滤器浓缩去除上清。制备成SS1 Z1株、SS2Z2株和SS7Z7株灭活菌体抗原。
将3种抗原液按1 1 1的比例混合均匀，根据参考文献[9]制备三价油佐剂疫苗和铝胶佐剂灭活疫苗；同时，按照佐剂说明书分别制备其三价ISA201佐剂疫苗、GEL佐剂疫苗和IMS1313佐剂疫苗。5种佐剂疫苗中每种抗原的灭活前活菌含量均为2.0×109cfu/mL。
1.4豚鼠安全性试验分别通过腿部肌肉注射途径和背部皮下注射途径测定5种佐剂疫苗的安全性。将48只豚鼠随机均分为6组，8只/组。1~5组又分为2个小组（4只/组）。豚鼠分别腿部肌肉和背部皮下免疫5种佐剂疫苗（0.4mL/只），第6组注射无菌PBS作为对照组（0.4mL/只）分组同上。观察、记录其临床症状、注射部位以及死亡情况。连续观察14d，观察期结束后迫杀所有豚鼠，检查接种部位的病变以及疫苗残留情况。最后，综合评分，判断疫苗接种副反应的严重程度。
1.5仔猪安全性试验将30头仔猪随机均分为6组（5头/组），利用制备的猪链球菌病ISA201疫苗、GEL 疫苗、IMS1313疫苗、油疫苗和铝胶疫苗共5种佐剂疫苗分别对应一组仔猪经颈部肌肉注射（2mL/头）。同时设立一组注射无菌PBS为空白对照。测定接种前及接种后1d~7d的体温变化，并观察、记录临床症状，以及死亡情况。连续观察14d，观察期结束后迫杀各组仔猪，检查接种部位的肉芽肿形成以及疫苗残留情况。最后，综合评分，判断疫苗接种副反应的严重程度。
1.6仔猪免疫保护试验本试验分2个批次进行，第1批次试验方法如下。将30头仔猪均分为6组（5头/组），分别免疫ISA201疫苗、GEL疫苗、IMS1313疫苗、油疫苗和铝胶疫苗共5种疫苗，其余一组为注射PBS对照组。每组仔猪均经颈部肌肉注射免疫（2mL/头），首免后间隔21d采用相同的方法进行二免。在首免前、首免后21d、首免后35d分别对每组仔猪采血并分离血清，通过ELISA检测试剂盒测定SS1、SS2、SS7的抗体水平。在首免后35d利用1LD100（100%致死剂量）对所有仔猪经耳静脉注射接种Z2株（LD100为1.6×108cfu/mL）菌液2mL。每日观察并记录发病死亡情况至14d，死亡仔猪立即剖检并进行细菌的分离鉴定，剩余仔猪于攻毒后14d 全部迫杀并检查组织器官病变情况。最后，统计分析各组免疫保护情况。第2批次整体操作同第1批，只是将攻毒菌株换为Z1株（LD100为1.5×109cfu/mL）菌液。
2结果
2.1疫苗的豚鼠安全性试验结果观察记录豚鼠安全性试验期间的临床症状及死亡情况，注射部位的炎症、坏死以及疫苗残留情况。结果显示，ISA201疫苗经2种接种途径免疫均产生了中等程度的炎症反应。铝胶和IMS1313疫苗副反应均较小。油佐剂疫苗经肌肉注射时产生大量的残留，但皮下注射时残留较少。GEL疫苗经2种途径接种均产生严重的炎症反应。另外，通过皮下注射途径接种GEL疫苗的4只豚鼠，其注射部位均发生了不同程度的化脓情况，而经腿部肌肉注射途径接种GEL疫苗的4只豚鼠均无该情况（表1、表2），其原因有待进一步研究和分析。结果表明：5种佐剂疫苗在豚鼠上虽然都
能产生不同程度的副反应，但均在安全范围内，可以开展后续猪体试验。
2.2疫苗的仔猪安全性试验结果利用制备的5种佐剂疫苗分别对每组5头仔猪经颈部肌肉接种（2mL/头）。结果显示，5种佐剂疫苗组仔猪的精神状态和食欲均正常，均未发生腹泻、呕吐和死亡现象。接种前和接种后1d~7d的体温测定显示，5种佐剂疫苗组仔猪在接种后24h，油疫苗、GEL疫苗和ISA201疫苗组仔猪出现了一定程度的体温升高，但在接种后48h均恢复正常（表3）。观察期结束后，解剖并观察各组仔猪的注射部位，发现铝胶疫苗组、GEL疫苗组和IMS1313疫苗组仔猪的接种部位均无明显的疫苗残留现象，也无肉芽肿的形成，
180
赵旭东，等.猪链球菌三价灭活疫苗免疫佐剂的筛选第2期
与对照组相比无肉眼可见的差异。但是，ISA201疫苗组有轻微肉芽组织增生，而油佐剂疫苗组仔猪的接种部位有明显的疫苗残留现象，同时有比较严重的肉
芽肿形成。结果表明：新型佐剂（ISA201、GEL、IMS1313）疫苗在仔猪上的副反应要小于传统佐剂（油）疫苗。
表15种佐剂疫苗的豚鼠安全性试验结果（腿部肌肉注射）
Table1Safety asssment of five different adjuvant vaccines on guinea pigs（intramuscular injection）
疫苗组别Vaccines types
油疫苗Oil vaccine
铝胶疫苗Alh vaccine
GEL疫苗GEL vaccine
ISA201疫苗ISA201accine
IMS1313N疫苗IMS1313vaccine
PBS对照PBS control 豚鼠编号
Numbers
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
精神状态
Mental state
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
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-
-
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食欲
Appetite
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腹泻
Diarrhea
-
-
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-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
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-
-
-
-
呕吐
Emesis
-
-保险销售
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-
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-
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-
-
-
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-
-
肿胀程度
Swelling
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
炎症坏死
Inflammatory
necrosis
+++
+++
+++
+++
+
+
+
+
+++
+++
+++
+++
++
++
++
++
+
+
+
+
-
-
-
-
疫苗残留
Vaccine
residue
++
++
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-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
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-
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-
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-
死亡
Death
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-
-
-
-
-炒鸭肉
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
综合得分
Score
24
8
16
12
4
注：1.精神状态：“-”为正常，“⊕”为沉郁，“+”为兴奋；2.食欲情况：“-”为正常，“+”为采食减少；3.腹泻情况：“-”为未出现腹泻，“+”为出现腹泻；4.呕吐情况：“-”为未出现呕吐，“+”为出现呕吐；5.接种部位肿胀程度：“-”为正常，“+”为出现组织肿胀；6.接种部位坏死程度：“-”为正常，“+”为出现炎症坏死；7.接种疫苗残留量：“-”为无残留，“+”为出现疫苗残留；8.以上各项，症状程度按“-”无症状，“+”、“++”、“+++”分别表示有症状轻微、中度和严重，“⊕”同理“+”；9.死亡情况：“-”为存活，“+”为死亡；10.按照1个“+”或1个“⊕”得1分的方法计算综合得分，表示组豚鼠出现接种反应的严重程度。
Note:1.Mental state:"-"is normal,"⊕"is depresd,"+"is excited;2.Appetite:"-"is normal,"+"is reduced feeding;3.Diarrhea:"-"means no diarrhea,"+"means diarrhea;4.Emesis:"-"means no vomiting,"+"means vomiting;5.The degree of swelling at the inoculation site:"-"is normal,"+" indicates swelling;6.Necrosis degree of inoculation site:"-"is normal,"+"indicates necrosis;7.Vaccination residues:"-"means no residues,"+"resi⁃dues;8.All above symptoms"-"is normal,"+","++","+++"indicate mild,moderate and vere,respectively;"⊕"similar"+";9.Death:"-"means sur⁃vival,"+"means death;10.Calculate the overall score according to the method of1point given by a"+"or"⊕",indicating the verity of vaccination reac⁃tion in guinea pigs.
2.3仔猪免疫保护试验结果
2.3.1免疫仔猪血清抗体检测结果通过SS的ELI⁃SA试验测定各疫苗免疫组和对照组仔猪的抗体水平。结果显示，对SS1，首免后21d，ISA201疫苗组、铝胶疫苗组、GEL疫苗组、IMS1313疫苗组、油疫苗组仔猪血清抗体水平均极显著高于免疫前和对照组（p<0.01）。二免后14d（首免后35d），ISA201疫苗组、GEL疫苗组、IMS1313疫苗组和油疫苗组抗体水平极显著升高（p<0.01），铝胶疫苗组有所升高但差异不显著（p>0.05），且ISA201疫苗组与其余4组相比抗体水平差异极显著（p<0.01）。对于SS2，5个疫苗组首免后21d的抗体水平均有极显著的升高（p<0.01），ISA201疫苗组、油疫苗组、IMS1313疫苗组二免后抗体水平也有极显著的升高（p<0.01），GEL疫苗组和铝胶疫苗组抗体水平显著高于首免后（p<0.05），ISA201疫苗组二免后与GEL疫苗组、油疫苗组、铝胶疫苗组抗体水平差异极显著（p<0.01），与IMS1313疫苗组差异显著（p<0.05）。对于SS7，其统计学结果与SS1结果较为一致。
181
中国预防兽医学报2021年
表25种佐剂疫苗的豚鼠安全性试验结果（背部皮下注射）
Table2Safety asssment of five different adjuvant vaccines on guinea pigs(subcutaneous injection)
疫苗组别Vaccines types
油疫苗Oil vaccine
铝胶疫苗Alh vaccine
GEL疫苗GEL vaccine
ISA201疫苗ISA201accine
IMS1313N疫苗IMS1313vaccine
PBS对照PBS control 豚鼠编号
Numbers
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
精神状态
Mental state
⊕
⊕
⊕
⊕
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
食欲
Appeptite
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腹泻
Diarrhea
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-
-
-
-
-
-
-
-大岭山公园
-
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-
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-
-
-
-
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呕吐
Emesis
-
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-
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-
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-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-学跳舞一步一步教视频
肿胀程度
Swelling
-
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-
+
+
+
+
+
+
+
+
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-
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-
-
炎症坏死
Inflammatory
necrosis
+
+
+
+
+
+
+
+
+++
+++
+++
+++
++
++
++
++
+
+
+
+
-
-
-
-
疫苗残留
Vaccine
residue
+
+
+
+
-
-
金沙遗址门票
-
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-
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死亡
Death
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-
-
-
-
综合得分
Overall Score
12
4
16
12
4
表35种佐剂疫苗的仔猪安全性试验结果（肌肉注射）
Table3Safety asssment of five different adjuvant vaccines on piglets（intramuscular injection）
疫苗组别Vaccines types
油疫苗Oil vaccine
铝胶疫苗Alh vaccine
GEL疫苗GEL vaccine
ISA201疫苗ISA201accine 仔猪编号
Numbers
8
5
20
15
26
3
4
13
29
30
7
12
21
19
23
2
10
14
16
27
精神状态
Mental state
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
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食欲
Appetite
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体温
Temperature
+
+
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-
-
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-
+
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+
+
+
+
+
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+
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腹泻
Diarrhea
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城南旧事读后感500字-
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男猴女牛-
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呕吐
Emesis
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肉芽肿
Granulomas
+++
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+++
+++
+++
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+
+
+
+
疫苗残留
Vaccine residue
+++
+++
+++
+++
+++
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死亡
Death
-
-
-
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-
-
-
-
-
-
不准打架
-
-
-
-
-
-
-
综合得分
Overall score
35
5
10
注：同表1。Note:The same as Table1. 182
