第49卷第4期Vol．49No．4山东大学学报（医学版）
JOURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY （HEALTH SCIENCES ）2011年4月Apr．2011
收稿日期：2011-01-07作者简介：陈萌（1985－），女，硕士研究生，主要从事肿瘤病理学研究。
通讯作者：李劲松（1960－），男，副教授，主要从事肿瘤病理学研究。E-
mail jinsong@sdu．edu．cn 文章编号：1671－7554（2011）04－0065－05
免疫荧光双标法在小鼠表皮干细胞分子
标记筛选中的应用
陈萌1，任宁2，刘文君1，秦晓敏1，李劲松
交通事故报警电话
1
（1．山东大学齐鲁医院病理科，济南250012；2．济南市第一人民医院病理科，济南250011）
摘要：目的
用标记滞留细胞（LRCs ）及免疫荧光双标记法进行小鼠表皮干细胞可靠分子标记的筛选。方法
选
择出生5d 的昆明小乳鼠进行腹腔注射5-溴，2-脱氧尿嘧啶（5-bromodeoxyuridine ，BrdU ），隔日注射，连续7d 。于注射后第90天进行取材，
在冰冻切片上分别进行BrdU 与整合素β1、P63和CD34的双重免疫荧光标记，观察这些标记物与BrdU 的符合度。结果90d 后小鼠皮肤上皮细胞中仍有少数阳性细胞，主要存在于毛囊的隆突部位，另有少数阳性细胞散落在基底层。免疫荧光双标的结果示，
Brdu 与整合素β1双标阳性的细胞占所有整合素β1阳性细胞的81%，占所有Brdu 阳性细胞的94%；Brdu 与P63双标阳性的细胞占所有P63阳性细胞的65%，占所有Brdu 阳性细胞的86%；Brdu 与CD34双标阳性的细胞占所有CD34阳性细胞的30%，占所有Brdu 阳性细胞的62%。结论
整合素β1与BrdU 的符合率最高，
P63其次。β1和P63是这些分子标记物中筛选干细胞最好的指标。关键词：标记滞留细胞；表皮干细胞分子标记；免疫荧光双标中图分类号：R322．99
文献标志码：A
Screening of molecular markers for epidermal stem cells in mice by the double immunofluorescence labeling technique
CHEN Meng 1，REN Ning 2，LIU Wen-jun 1，QIN Xiao-min 1，LI Jin-song 1
（1．Department of Pathology ，Qilu Hospital of Shandong University ，Jinan 250012，China ；
2．Department of Pathology ，Jinan First People's Hospital ，Jinan 250011，China ）
Abstract ：Objective
To screen reliable molecular markers for epidermal stem cells （ESCs ）in mice by using the doub-le immunofluorescence labeling technique and label-retaining cells （LRCs ）．Methods
The epidermis was labeled for 7
的词语days with 5-bromodeoxyuridine （BrdU ）in postnatal day 5（P5）mice ，followed by a trace period of up to 12weeks．The tissue of the mice was frozen and sliced in a frozen microtome after 90days．Slices were stained with polyclonal antibodies of anti-β1integrin ，P63and CD34and monoclonal antibodies of anti-Brdu ，and then obrved under a fluor-oscope．Results
After 90days ，few LRCs were found in a region of the outer root sheath adjacent to the inrtion of
the arrector pili muscle ，known as the bulge region．The percentage of double immunofluorescence cytochemically stained β1integrin-and BrdU-positive cells was 81%in all β1-positive cells ，and 94%in all BdrU-positive cells．The percentage of P63-and BrdU-positive cells was 65%in all P63-positive cells ，and 86%in all BdrU-positive cells．The percentage of CD34-and BrdU-positive cells was 30%in all CD34-positive cells ，and 62%in all BdrU-positive cells．Conclusion
Among the molecular markers ，β1integrin ，with highest accordance with BrdU ，is the best molecular
marker for ESCs ，and P63is the next best．
Key words ：Label-retaining cells ；Molecular markers for epidermal stem cells ；Double immunofluorescence labeling technique
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皮肤是人体最大的组织器官，它有很快的自我更新能力，在维持组织结构的更新和细胞内环境的稳定
及创伤后创面修复的过程中起着至关重要的作用，其关键就是由于表皮干细胞（epidermal stem cells，ESCs）的存在。标记滞留细胞（label-retaining cells，LRCs）技术是近年来发展起来的一种鉴定成体干细胞及其定位的方法，其原理是选取5-溴，2-脱氧尿嘧啶（5-bromodeoxyuridine，BrdU）作为示踪剂，利用其可与内源性胸腺嘧啶核苷竞争掺入S期（DNA合成期）单链DNA核苷酸序列中的特点，通过皮下或腹腔注射的方法，引入外源性特异抗原BrdU，在组织增殖期将BrdU标记到细胞中，一旦BrdU掺入细胞核就不会被代谢出细胞。由于成体干细胞有慢细胞周期、半保留复制以及不对称分裂等特点，通过利用特异性的抗BrdU抗体，检测到的BrdU滞留细胞即可认为是ESCs［1］。
ESCs的分离和鉴别的关键就是其表面的分子标记物，而目前学术界仍没有公认的表皮干细胞特异性标志物，因此ESCs表面分子标记物的确定是一个必要而且关键的研究环节。为此本实验选取了几种常用的分子标记物进行研究，期望获得一种或几种可靠的表皮干细胞特异性标志物，并对下一步表皮干细胞的研究建立基础。
1材料与方法
1．1实验动物昆明白小鼠，雌雄不限，10只，5d 龄，体质量（2．5ʃ0．5）g，母乳喂养，清洁级。购于山东大学动物实验中心。
1．2主要试剂BrdU粉末购自Sigma生物技术公司；BrdU抗小鼠单克隆抗体购自Santa Cruz生物技术公
财务数据分析
司；β1、P63和CD34兔抗小鼠多克隆抗体均购自北京博奥森生物公司；羊抗小鼠FITC和羊抗兔TRITC荧光二抗以及封闭用的正常羊血清（工作液）均购自北京中杉金桥生物公司。
1．3方法
1．3．1Brdu注射液配置取100mg BrdU粉末加入10mL三蒸水中，待其充分溶解后，用0．22μm 的滤膜过滤除菌，配成10mg/mL的溶液，置4ħ冰箱避光保存。
1．3．2DNA标记对10只出生5d的小乳鼠进行标记，将10mg/mL的BrdU注射液注入小鼠腹腔，每次0．1mL，每天2次，间隔12h，隔天注射，总共注射7次。标记实验完成后，于第90天处死小鼠，。，用冰丙酮固定10min，进行连续冰冻切片（切片在齐鲁医院病理科进行）。制好片后进行免疫组化分析。1．3．3免疫荧光标记选取停止标记第90天［2］小鼠的皮肤组织切片进行免疫荧光双标检测：①冰冻切片用PBS（0．01mol/L，pH7．4）冲洗3次，每次5min；②每张切片上加入2mol/L HCl50μL于37ħ孵育0．5h，以打开DNA双链，暴露DNA上的BrdU，以便与抗体结合。PBS冲洗3次，每次5 min；③除去PBS液，每张切片各滴入0．25%胰蛋白酶50μL，37ħ孵育10min，以消化DNA双链上结合的组蛋白，使抗体可以充分结合。然后PBS液冲洗3次，每次3min；④除去PBS液，每张切片滴加50μL封闭用的正常羊血清，37ħ孵育20min；⑤甩掉多余的羊血清，每张切片滴加50μL的BrdU单抗（1ʒ200）和兔抗鼠β1、P63和CD34多抗（1ʒ200）的混合一抗，置于湿盒中，4ħ冰箱内孵育过夜。
（阴性对照不加一抗，以PBS液代替）；⑥湿盒从冰箱取出后恢复室温0．5h后，PBS冲洗5次，每次5min。除去PBS液，每张切片滴加各50μL的羊抗兔TRITC二抗（1ʒ100），于37ħ温箱中孵育1h，然后用PBS冲洗3次，每次5min；⑦除去PBS液，每张切片滴加各50μL的羊抗小鼠FITC二抗（1ʒ100），于37ħ温箱中孵育1h，然后用PBS冲洗3次，每次5min；⑧除去PBS，晾干切片后，用防荧光淬灭剂进行封片。立即进行荧光显微镜观察。1．4实验结果判断①免疫荧光单标检测：BrdU 阳性细胞为胞核呈绿色；β1阳性细胞为胞膜呈红色；P63阳性细胞为胞核呈红色；CD34阳性细胞为胞浆或胞膜呈红色；②免疫荧光双标检测：检测BrdU分别与β1、P63和CD34共同染色的阳性细胞，在荧光显微镜下（ˑ200）随机选取视野，观察每组标本中的随机10个视野并计数其中的阳性细胞数及阴性细胞数，最后计算出每组标本平均阳性细胞数目及平均阳性细胞百分比。
2结果
2．1第90天切片进行整合素β1、CD34、P63和BrdU的荧光染色单标结果见图1 4。第90天整合素β1与DAPI荧光标记的结果，阳性细胞为胞膜着色（图1）；第90天CD34与DAPI荧光标记的结果，阳性细胞为胞膜或胞浆着色（图2）；第90天P63与DAPI荧光标记的结果，阳性细胞为胞核着色（图3）；第90天BrdU与DAPI荧光标记的结果，阳性细胞为胞核着色（）
陈萌，等．免疫荧光双标法在小鼠表皮干细胞分子标记筛选中的应用67图1第90天整合素β1与DAPI荧光标记的结果（ˑ200）
A：DAPI染色结果；B：整合素β1染色结果；C：合成结果。
Fig．1Double fluorescence staining ofβ1integrin and DAPI after90days（ˑ200）
A：Positive nucleus labeled by DAPI；B：Cytomembrane of epidermal cells dyed byβ1
integrin；C：Overlapping of figures A and B．
图2第90天CD34与DAPI荧光标记的结果（ˑ200）
A：DAPI染色结果；B：CD34染色结果；C：合成结果。
Fig．2Double fluorescence staining of CD34and DAPI after90days（ˑ200）
A：Positive nucleus labeled by DAPI；B：Cytomembrane or cytoplasm of epidermal cells
dyed by CD34；C：Overlapping of figures A and B．
中长导管
图3第90天P63与DAPI荧光标记的结果（ˑ200）
A：DAPI染色结果；B：P63染色结果；C：合成结果。
Fig．3Double fluorescence staining of P63and DAPI after90days（ˑ200）
A：Positive nucleus labeled by DAPI；B：Nucleus of the epidermal cells dyed by P63；
C：Overlapping of figures A and B．
2．2第90天的切片进行整合素β1、CD34、P63与BrdU的荧光染色双标结果见图5 7。由图5可见，第90天整合素β1与BrdU荧光双标的结果，阳性细胞为胞核着绿色，胞膜着红色。其中双标阳性占所有整合素β1阳性的81%，只有整合素β1阳性而无BrdU阳性占所有整合素β1阳性的8%，双标阳性占所有BrdU阳性的94%；由图6可见，第90天P63与BrdU荧光双标的结果，阳性细胞为胞核着橘红色。其中双标阳性占所有P63阳性的65%，只有P63阳性而无BrdU阳性占所有P63阳性的
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26%，双标阳性占所有BrdU阳性的86%；由图7可见，第90天CD34与BrdU荧光双标的结果，阳性细胞为胞核着绿色，胞浆着红色。其中双标阳性占所有CD34阳性的30%，只有CD34阳性而无BrdU阳性占所有CD34阳性的45%，双标阳性占所有BrdU 阳性的62%。在这3种ESCs常用的分子标记中，整合素β1与BrdU符合度最高，P63其次，CD34最低。所以整合素β1和P63是筛选ESCs最好的分子标记
。
图4第90天BrdU与DAPI荧光标记的结果（ˑ200）
A：DAPI染色结果；B：BrdU染色结果；C：合成结果。
Fig．4Double fluorescence staining of Brdu and DAPI after90days（ˑ200）
A：Positive nucleus labeled by DAPI；B：Nucleus of epidermal cells dyed by Brdu；C：Overlapping of figures A and
B．
图5第90天整合素β1与BrdU荧光双标的结果（ˑ200）
A：整合素β1染色结果；B：BrdU染色结果；C：合成结果。
Fig．5Double fluorescence staining ofβ1integrin and Brdu after90days（ˑ200）A：Positive cytomembrane labeled byβ1integrin；B：Positive nucleus labeled by Brdu；
C：Overlapping of figures A and B．
图6第90天P63与BrdU荧光双标的结果（ˑ200）
A：P63染色结果；B：BrdU染色结果；C：合成结果。
Fig．6Double fluorescence staining of P63and Brdu after90days（ˑ200）
时间流逝A：Positive nucleus labeled by P63；B：Positive nucleus labeled by Brdu；C：Overlap-ping of figures A and B．
陈萌，等．免疫荧光双标法在小鼠表皮干细胞分子标记筛选中的应用69图7第90天CD34与BrdU荧光双标的结果（ˑ200）
A：CD34染色结果；B：BrdU染色结果；C：合成结果。
Fig．7Double fluorescence staining of CD34and Brdu after90days（ˑ200）
A：Positive cytomembrane or cytoplasm labeled by CD34；B：Positive nucleus labeled by
Brdu；C：Overlapping of figures A and B．
3讨论快递哪天停运
整合素作为一类位于细胞膜表面的糖蛋白受体家族分子，它主要介导细胞与细胞外基质的黏附。在增现代奇迹
殖分化过程中，基底层细胞表面整合素表达逐渐下调直至消失，细胞也随之逐渐向皮肤表面迁徙，最终角质化、脱落。ESCs主要是通过表达整合素实现对基底膜各种成分的黏附，其中β1整合素不仅介导ESCs与细胞外基质的黏附，也调控终末分化的启动。有实验已经证实，β1整合素表达的降低会刺激ESCs离开干细胞池，向上迁移成为分化细胞［3-5］。而且人表皮角质形成细胞的增殖能力与β1整合素的表达存在着线性关系，增殖能力较强的干细胞β1整合素表达水平高于其分化的子代细胞而且能迅速黏附到细胞外基质上。有研究已经利用β1整合素的单克隆抗体，成功通过流式细胞仪进行了ESCs的分选［6］；也有研究进行大鼠皮肤的原代培养再经流式细胞仪检测β1整合素［7］。P63是肿瘤抑制因子之一，结构和功能与P53类似。Pellegri-ni等［3］发现在角膜缘的基底细胞有P63表达，而在角膜表面的暂时增殖细胞没有P63表达，因而认为P63也是ESCs的标志物之一。
本研究结果表明，β1整合素和P63是与BrdU 符合度最高的两种分子标记，阳性细胞重合的百分数分别达到了94%和86%。目前分离ESCs所用的抗原标记可利用其表面或胞内特异性抗原的单抗，如本实验中涉及到的表皮干细胞标记物整合素β1、P63和CD34，但它们中的任意单一指标在除外ESCs的其他皮肤细胞中也有一定程度的表达（表达百分数可参见本实验的实验结果）。因而在使用单一的分子标记进行标记时，分选所得的ESCs纯度较低。根据本实验结果，我们可以把β1整合素与β整合素的表达水平和细胞的增殖能力呈正相关，P63能够区分ESCs和暂时增殖细胞。选用P63同时对ESCs进行鉴定，可以有效的克服单独应用β1整合素的缺陷，从而建立一种新的分离在体模型中ESCs的技术方法，获得纯度高、数量多的ESCs。
综上所述，本研究结果提示在所选的几种ESCs 分子标记中，整合素β1和P63是筛选干细胞最好的指标。通过β1整合素和P63双重标记实现对ESCs的初步筛选。但是筛选出的细胞能否证实全部都是ESCs或者又有多少比例是ESCs还有待进一步深入研究。
参考文献：
［1］Albert M，Foster R，Vogel J，et al．Murine epidermal la-bel-retaining cells isolated by flow cytometry do not ex-press the stem cell markers CD34，Sca-1，or Flk-1［J］．
Invest Dermatol，2001，117（3）：943-948．
［2］Rachel W，Caroline E．Identification of label-retaining-cells in mou endometrium［J］．Stem Cells，2006，24
（2）：1529-1538．
预备党员转正发言［3］Pellegrini G，Dellambra E，Golisano O，el al．P63identi-fies keratinocyte stem cells［J］．PNAS，2001，18（6）：
3156-3161．
［4］Suzuki Y，Yanagisawa M，Yagi H，et al．Involvement of beta1-integrin up-regulation in basic fibroblast growth fac-tor and epidermal growth factor-induced proliferation of
mou neuroepithelial cells［J］．Biol Chem，2010，285
（24）：18443-18451．
［5］Pikula M，Kondej K，Jaskiewicz J，et al．Flow cytomet-ric sorting and analysis of human epidermal stem cell can-didates［J］．Cell Biol Int，2010，34（9）：911-915．
［6］赵志力，杨蓉娅，张华，等．细胞外基质对表皮干细胞缝隙连接介导的细胞间通讯的影响［J］．中国美容医学，2009，18（6）：832-836．
［7］李延仓，李孝建，沈雁，等．表皮干细胞体外培养体系的初步研究［J］．中华损伤与修复杂志，2008，3（5）：565-571．
（编辑：刘霞）
