平足蛋白P D P N 在结直肠癌中的表达及临床意义
黄平平１，王㊀松２
(１．恩施华龙总医院医学检验中心，湖北恩施４４５０００;２．恩施州中心血站检验科，湖北恩施４４５０００
)D O I :１０．１１７４８/b j m y ．i s s n ．１００６－１７０３．２０２１．０５．０２５收稿日期:２０２１Ｇ０４Ｇ２７；修回日期:２０２１Ｇ０４Ｇ２７作者简介：黄平平，女，主管检验师，副主任.
摘要：目的㊀探讨平足蛋白(p o d o p l a n i n ,P D P N )在结直肠癌组织中的表达与结直肠癌临床指标的相关性，并阐述其表达在结直肠癌诊疗中的临床意义.方法㊀下载T C G A 数据库中结直肠癌转录组和临床组数据，分析在结直肠癌中P D P N 蛋白表达与结直肠癌患者的临床信息(年龄㊁性别㊁临床分期㊁肿瘤分级和淋巴结转移情况)的相关性.通过免疫组织化学法和组织芯片技术检测P D P N 蛋白在结直肠癌和癌旁组织中的表达.通过基因富集分析(G S E A )探究P D P N 调控结直肠癌的可能通路.结果㊀P D P N 在正常结肠组织中低表达，在结直肠癌组织中高表达(P ＜０．０１).结直肠癌患者中,P D P N 高㊁低表达组与年龄和淋巴转移差异有统计学意义(P ＜０．０５)，与性别㊁T 分期㊁N 分期，疾病分期差异无统计学意义(P ＞０．０５).组织芯片免疫组织化学法检测结果表明,P D P N 在结直肠癌中高表达.基因富集分析结果显示,P D P N 可能通过调节细胞因子受体相互作用通路㊁趋化因子信号通路㊁J A K ＧS T A T
信号通路㊁T o l l 样受体信号通路来影响结直肠癌预后.
结论㊀P D P N 检测在结直肠癌诊断中具有一定的临床应用价值，有助于结直肠癌的诊断㊁疗效评价及预后监测.关键词：平足蛋白;㊀T C G A ;㊀组织芯片;㊀免疫组织化学;㊀结直肠癌;㊀临床中图分类号:R ７３５．２;R ７３５．３㊀㊀文献标识码:A
T h eE x p r e s s i o no fP o d o p
l a n i n i nC o l o r e c t a l C a n c e r a n d I t sC l i n i c a l S i g
n i f i c a n c e H U A N GP i n g p i n g １,WA N GS o n g
２(１．M e d i c a lL a b o r a t o r y C e n t e r ,H u a l o n g G e n e r a lH o s p i t a l o fE n s h iT u j
i aa n d M i a oA u t o n o m o u sP r e f e c t u r e ,E n s h i ４４５０００,C h i n a ;２．C l i n i c a l L a b o r a t o r y ,C e n t r a l B l o o dS t a t i o no fE n s h i T u j
i a a n d M i a oA u t o n o m o u s P r e f e c t u r e ,E n s h i ４４５０００,C h i n a )A b s t r a c t :O b j e c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h ec o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ee x p r e s s i o no fP o d o p
l a n i n i nc o l o r e c t a l c a n c e r t i s s u e s a n d t h e c l i n i c a l i n d i c a t o r s o f c o l o r e c t a l c a n c e r ,a n d t oc l a r i f y t h ec l i n i c a l s i g
n i f i c a n c e o f i t s e x p r e s s i o ni nc o l o r e c t a l c a n c e r ．M e t h o d s T C G At r a n s c r i p
t i o n a la n dc l i n i c a ld a t ao fc o l o r e c t a l c a n c e rw e r ed o w n l o a d e dt oa n a l y z et h ec o r r e l a t i o nb e t w e e nP D P N p r o t e i ne x p r e s s i o ni nc o l o r e c t a l c a n c e r a n dt h ec l i n i c a l i n f o r m a t i o no fc o l o r e c t a lc a n c e r p a t i e n t s (a g e ,s e x ,c l i n i c a l s t a g e ,t u m o r g r a d e a n d l y m p hn o d em e t a s t a s i s )．T h e e x p r e s s i o no f P D P N p r o t e i n i n c o l o r e c t a l c a n c e r a n d a d j a c e n t t i s s u e sw a s d e t e c t e db y i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y a n d t i s s u em i c r o a r r a y ．G S E A g e n e e n r i c h m e n t a n a l y
s i s w a sc o n d u c t e d t o e x p l o r e t h e p o s s i b l e p a t h w a y o f P D P N r e g u l a t i n g c
o l o r e c t a lc a n c e r ．R e s u l t s E x p r e s s i o no fP D P N w a s l o wi nn o r m a l c o l o n t i s s u e s a n dh i g
h i nc o l o r e c t a l c a n c e r t i s s u e s (P ＜０．０１)．I n p a t i e n t s w i t h c o l o r e c t a lc a n c e r ,t h e h i g h a n dl o w P D P N e x p r e s s i o n g r o u p s h a d s i g
n i f i c a n t d i f f e r e n c e sw i t ha g ea n dl y m p h a t i c m e t a s t a s i s (P ＜０．０５),b u th a dn os t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c e w i t h g e n d e r ,T s t a g e ,N s t a g e a n d d i s e a s e s t a g e (P ＞０．０５)．T h e r e s u l t s o f t i s s u e m i c r o a r r a y
i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y s h o w e d t h a tP D P N w a sh i g h l y e x p r e s s e d i nc o l o r e c t a l c a n c e r ．G S E As h o w e d t h a t P D P Nc o u l da f f e c t p r o g n o s i so fc o l o r e c t a l c a n c e rb y r e g u l a t i n g c y t o k i n er e c e p t o r i n t e r a c t i o n ,c h e m o k i n es i g n a l i n g p a t h w a y ,J A K ＧS T A T s i g n a l i n g p a t h w a y ,a n d T o l l Ｇl i k e r e c e p t o r s i g n a l i n g p a t h w a y ．C o n c l u s i o n P D P N d e t e c t i o n h a sa c e r t a i n c l i n i c a la p p l i c a t i o n v a l u ei nt h e d i a g疯狂时代
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f f i c a c y e v a l u a t i o n a n d p r o
g n o s i s m o n i t o r i n g o f c o l o r e c t a l c a n c e r．
K e y w o r d s:P o d o p l a n i n;㊀T C G A;㊀T i s s u e c h i p;㊀I m m u n o h i s t o c h e m i s t r y;㊀C o l o r e c t a lC a n c e r;
C l i n i c a l
㊀㊀结直肠癌(C R C)是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，也是死亡率第三的癌症[１Ｇ２].结直肠癌在我国的发病率很高，目前获批的胃肠肿瘤靶向治疗药物种类较少，缺少有力研究结果来指导临床决策[３].因此有必要找到潜在的评价预后分子标志物和治疗靶点，以解决治疗难题.
㊀㊀平足蛋白(p o d o p l a n i n,P D P N)是I型唾液酸黏蛋白样的跨膜糖蛋白，曾用名为A g g r u s㊁P A２．２６, M２A,T１α等，可以作为淋巴内皮细胞和淋巴管生成的特异性标志物[４Ｇ５].P D P N在多种肿瘤中高表达，如结直肠肿瘤[６Ｇ７]㊁鳞状细胞癌[８Ｇ９]㊁间皮瘤[１０]等.研究表明,P D P N可作为肿瘤细胞迁移和侵袭的调节因子发挥重要作用，从而导致肿瘤进展和预后不良[１１]，然而其潜在的机制仍然未知.最新研究表明,P D P N与胃癌免疫浸润有关，可以作为一种预后性生物标志物[１２]，
但其在结直肠癌中是否与预后相关暂无文献报道.
㊀㊀本研究通过生物信息学方法分析探讨P D P N在结直肠癌中表达与预后关系，通过组织芯片技术和免疫组织化学法验证P D P N的表达，通过G S E A富集分析，探讨P D P N在结直肠癌临床病理中可能的作用机制.
材料和方法
㊀㊀１㊀数据来源
㊀㊀在T C G A数据库(h t t p s://p o r t a l．g d c．c a n c e r．g o v/)中下载结肠转录组及临床组数据.使用R软件对转录组表达量数据进行归一化处理，使用l i mm a软件进行表达量差异分析，使用g p l o t s软件绘制差异基因火山图和部分差异基因热图.
㊀㊀２㊀试剂与仪器
㊀㊀兔抗人P D P N单克隆抗体(武汉贝茵莱生物科技有限公司)１ʒ４００稀释，苏木素㊁D A B浓缩型试剂盒㊁封闭山羊血清(北京索莱宝科技有限公司)，二甲苯㊁无水乙醇㊁３０％H２O２(国药集团化学试剂有限公司).石蜡切片机(德国徕卡公司).
㊀㊀３㊀P D P N基因表达与临床分析
㊀㊀利用T C G A数据库中结直肠癌患者信息，按照P D P N基因表达量的中位数进行分组，中位数以上的样本归为P D P N高表达组，低于中位数的为低表达组，进行临床病理特征分析.
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㊀㊀４㊀结直肠癌组织芯片
㊀㊀结直肠癌(I W L TＧNＧ７０C４３)组织芯片购买于爱威尔生物有限公司，包含结直肠癌及其癌旁组织共３５例，其中Ⅰ期６例㊁Ⅱ期１５例㊁Ⅲ期１３例㊁Ⅳ期１例.所有组织标本均进行组织学检查，使用美国癌症联合委员会(A J C C)分类(２０１０)/国际抗癌联盟(U I C C)２００２/T NM分类及分期系统.
㊀㊀５㊀免疫组织化学染色
㊀㊀将组织芯片置于恒温烘箱中烤片，二甲苯中脱蜡后使用梯度乙醇水化处理.采用０．０１m o l/L柠檬酸钠缓冲溶液中高压(１２５ħ１０３k P a)进行抗原修复,P B S溶液冲洗３m i nˑ３次.置于３％H２O２中消除内源性过氧化物酶的活性.将玻片置于１０％山羊血清中培养封闭，进行非特异性结合,P B S溶液冲洗３m i nˑ３次.滴加一抗(兔抗人P D P N单克隆抗体,１ʒ４００稀释),４ħ温育过夜,P B S溶液冲洗３m i n ˑ３次.滴加m a x v i s i o n二抗，湿盒孵育,３７ħ孵育１h.P B S溶液冲洗３m i nˑ３次.D A B浓缩型试剂盒染色，苏木精复染３m i n，梯度乙醇脱水后中性树胶封片.通过显微镜拍照，采集样本相关数据.㊀㊀６㊀富集分析
㊀㊀使用G S E A３．０进行基因集富集分析(g e n e s e t e n r i c h m e n t a n a l y s i s,G S E A).利用默认加权富集统计方法，单次分析置换次数为１０００次，初步探究P D P N基因对结直肠癌的可能作用机制.
㊀㊀７㊀统计学处理
㊀㊀采用S P S S２０．０统计学软件进行数据分析, P D P N蛋白表达与结直肠癌临床病理特征的关系使用χ２检验，以P＜０．０５为差异具有统计学意义.
结㊀㊀果
㊀㊀１㊀T C G A数据库分析P D P N在结直肠癌中的表达
㊀㊀下载结肠腺瘤和腺癌(a d e n o m a s a n d a d e n o c a r c i n o m a s)转录组数据，包含３９例正常结肠组织和３９８例结直肠癌组织样本数据，共４３７例.按照差异倍数ȡ３且P值ɤ０．０５为差异基因筛选标准，绘制火山图. P D P N在结直肠癌中高表达，差异倍数为３．２倍(P＜０．０５)，如图１.
注:A为差异分析火山图,B为部分差异基因表达量热图图１㊀T C G A结直肠癌差异分析结果
㊀㊀２㊀P D P N蛋白表达与临床病理参数的相关性㊀㊀T C G A数据库中共有３８０例结直肠癌患者临床信息，通过S P S S统计学分析可知，结直肠癌患者中P D P N高㊁低表达组在年龄和肿瘤远处转移(M)方面差异具有统计学意义(P＜０．０５)；与性别㊁淋巴结转移N㊁T分期㊁癌症分期的差异均没有统计学意义(表１).
表１㊀P D P N表达水平与结直肠癌临床病理参数关系
项目例数
P D P N表达量
低高
χ２值P值
性别０．３８０．５３７
男１７８９２８６
女２０２９８１０４
年龄４．２１１０．０４
ɤ５５７６４６３０
青菜丸子汤＞５５３０４１４４１６０
原发肿瘤T＃０．４１１０．５２２
T１１０６４
T２~T４３７０１８４１８６
淋巴结N０．１７５０．６７５
N０２２８１１６１１２
N１~N２１５２７４７８
儿童国学经典
远处转移M∗４．１４８０．０４２M０２８２１３２１５０
M１５５３４２１
彭于晏演的电影
A J C C分期０．０２０．８８１
I~I I期２１４１０６１０８
I I I~I V期１５５７８７７
㊀㊀㊀注:＃T C G A数据库中包含原位癌(T i s)１例，未纳入统计分析;∗T C G A数据库中远处转移淋巴结未知６例，不能确定是否远处转移(M x)３７例，未纳入统计分析
㊀㊀３㊀免疫组织化学法检测㊀㊀P D P N 的阳性染色定位于肿瘤细胞的细胞膜和细胞质中，阳性表达呈棕黄色或棕褐色的颗粒.免
疫组化结果表明,P D P N 在结直肠癌组织中高表达，在癌旁组织中低表达，如图２
.
注:A ㊁B 分别为P D P N 在结直肠癌I 期患者癌组织和癌旁组织中免疫组化显色结果,C ㊁D 分别为P D P N 在结直肠癌I I 期
患者癌组织和癌旁组织中免疫组化显色结果
图２㊀免疫组织化学染色结果
㊀㊀４㊀P D P N 高表达的G E S A 富集分析结果㊀㊀利用G S E A 富集分析探究P D P N 基因在结直肠癌中生物通路基因集.按照富集分数＞０．５，矫正后P 值＜０．０５，错误发生率＜０．０５为筛选条件，得到表２所示的相关通路.结果表明,P D P N 基因可能
通过影响细胞因子受体相互作用通路㊁补体系统㊁白细胞跨内皮迁移㊁造血细胞系㊁趋化因子信号通路,J A K ＧS T A T 信号通路㊁T O L L 样受体信号通路有关
的基因集来调控结直肠癌.
表２㊀P D P N 高表达的通路富集分析
富集通路
富集分数校正后P 值错误发现率细胞因子受体相互作用画壁里的牡丹
七年级上册生物
０．６７＜０．００１＜０．００１补体系统０．７４＜０．００１＜０．００１趋化因子信号通路０．５７＜０．００１＜０．００１白细胞跨内皮迁移
０．５６＜０．００１＜０．００１造血细胞系
０．７３＜０．００１０．００１细胞外基质受体信号通路０．７４＜０．００１０．００６T o l l 样受体信号通路
０．５８０．００１３０．０１２J A K ＧS T A T 信号通路
０．５５０．００１８０．０１６肠道免疫网络的I G A 生产０．７４０．００５６０．０４９N O D Ｇl i k e 受体信号通路
０．５６
０．００３３
０．０３３
注:A~D分别为细胞因子受体相互作用㊁趋化因子信号通路㊁J A KＧS T A T信号通路㊁T O L L样受体信号通路图３㊀P D P N高表达的结直肠癌样本基因通路富集结果
讨㊀㊀论
㊀㊀P D P N是一种３６~４３k D a的粘蛋白型跨膜蛋白，有８个外显子控制P D P N的合成，在不同物种间相对保守[１３].胞质尾部极短，胞外部分较长，很多研究者推测P D P N介导的相互作用更可能是通过受体Ｇ配体相互作用的方式[１４].c型凝集素受体Ｇ２(C L E CＧ２)已被证实是P D P N唯一已知的内源性受体，在血小板和免疫细胞如肿瘤相关巨噬细胞(T AM s)㊁中性粒细胞和树突状细胞(d c)等上均高表达[１４].P D P N与C L E CＧ２结合，能够直接诱导血小板聚集，在肿瘤细胞的生长㊁迁徙和转移中发挥关键作用[１５Ｇ１６].
㊀㊀为探讨P D P N能否作为结直肠癌的治疗靶点和预后因子，本文使用生物信息学方法对T C G A数据库中结直肠癌转录组数据进行差异分析，得到P D P N在结直肠癌中表达高于正常结肠组织.结直肠癌组织芯片的免疫组织化学法验证结果表明, P D P N在癌症组表达量比癌旁组织表达高，表明其可能作为结直肠癌潜在的治疗靶点.
㊀㊀通过对T C G A结直肠癌转录组数据和临床组数据关联分析，探讨P D P N表达量高低与临床病理参数间关系.结果表明,P D P N在结直肠癌表达与患者的年龄和淋巴组织远处转移显著相关.淋巴结侵袭和转移是划分肿瘤分期的关键因素,P D P N作为淋巴管内皮的特异性标志物，对判断癌症的分期有着重要作用[１７].
㊀㊀对结直肠癌转录组数据进行G S E A富集分析，来揭示P D P N高表达对结直肠癌可能的作用机制.基因富集结果表明,P D P N高表达可能通过影响细胞因子受体相互作用通路来调控结直肠癌的发生及进展[１８].相关文献报道，细胞因子和免疫细胞在结直肠癌的发生㊁发展及转移中发挥重要作用.研究
