免疫荧光层析法检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体
的临床价值及假阳性分析
李小凤，姜海蓉，王静，薛成军，张娅
(重庆市公共卫生医疗救治中心检验科，重庆400036)
摘要：目的探讨新型冠状病毒(SARS-CoV-2.)抗体在新型冠状病毒肺炎(COIVD-2019.)患者和非COIVD-2019患者中的检测效果.方法选取161例COIVD-2019患者和79例非COIVD-2019［合并人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、结核和自身免疫性疾病•患者，采用免疫荧光层析法对患者的血清标本进行SARS-CoV-2IgM和IgG抗体检测.结果161例COIVI-2019患者SARS-CoV-2IgM和IgG抗体阳率分别是88.82%(143/161.)和9329%(151/161).79例非COIVI-2019患者SARS-CoV-2IgM和IgG抗体阳性率分别为16.46%(13/79)和7.59%(6/79).免疫荧光层析法与化学发光分析法进行一致性评价，IgM抗体一致率达8421%(135/159),IgG一致率达8&68%(141/159.)，两种方法检测IgG结果的一致性比IgM偏高.检测HIV、结核、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎(RA)和自身免疫性肝炎(HIA)患者血清出现不同程度假阳性，稀释假阳性标本后检测6例RA、2例结核和1例HIA患者SARS-CoV-2抗体转阴.结论免疫荧光层析法性能满足COIVD-2019临床辅助诊断和流行病学调查，但应注意与流行病不相符的检测结果.通过稀释血清标本，可以一定程度降低检测过程中假阳性，对COIVD-2019患者发病早期标本检测灵敏度的影响需进一步研
究.
关键词：新型冠状病毒；免疫荧光层析法；性能评估；COIVD-2019；免疫球蛋白M；免疫球蛋白G
中图分类号：R3732文献标识码：A
The Clinical Value of2019-nCov IgM and IgG Tests by Immunofluorescence Chromatography and the Analysis of Its Fal Positive Results LI Xiaofeng,JIANG Hairong,WANG Jng,XUE Chengjun,ZHANG Ya (Department of Laboratory,Chongqing Public Health Medical Treatment Center,Chongqing400036,China)
Abstract:Objective To investigate the detection efficacy of SARS-CoV-2antibody in COIVD-2019patients and non-COIVD-2019patients.Methods Serum antibodies(IgM/IgG)against SARS-Co V-2were detected by immunofluorescence chromatography in161patients with COIVD-2019,68healthy controls and 79non-COIVD-2019patients(complicated with HI V,tuberculosis and autoimmune dias).Results The positive rates of SARS-CoV-2-specific IgM and IgG in161patients with COIVD-2019were88.82% (143/161)and93.79%(151/161),respectively.The positive rates of SARS-CoV-2-specific IgM and IgG in 79non-COIVD-2019patients were16.46%(13/79)and7.59%(6/79),respectively.Among the results,both SARS-CoV-2-specfc IgM and IgG wer
e postve in5cas.The consstency of immunofluorescence chromatography and chem lum nescence analys showed that the cons stency rate of IgM antibody was84.91%(135/159)and was88.68%for IgG(141/159)The consistency of IgGresultswashigherthanthatofIgMinboth methods．DetectionsofHIV,tuberculosis,SLE,RA andrum of patients with autoimmune hepatitis showed fal positive results in different degrees．Afterdilutionoffalpositivesamples,SARS-CoV-2antibodiesin6patientswith RA,2patients with tuberculosis and1patient with HIA turned to negative.Conclusion The performance of immunofluorescence chromatography could meet the standards of clinical diagnosis and
DOI：10.11748/bjmy.issn.l006-1703.2021.02.017
收稿日期：2020-12-14；修回日期：202-0-28历历在目意思
基金项目：重庆市2020年科卫联合医学科研项目（编号：2020FYYX161）
作者简介：李小凤，女，主管技师，主要从事病原微生物检验及研究.
通讯作者：张娅,E-mail：56.
epidemiological investigation of COIVD-2019.However,attentions should be paid to the detection res
ults which are not consistent with the epidemic.Dilutions of rum samples could be partially helpful for reducing the fal positive results of SARS-CoV-2antibodies in the detection proces s.The effectofdilutiononthedetectionnsitivityofearlyCOVID19needsafurtherstudy．Keywords：SARS-CoV-2；Immunofluorescencechromatography；Performanceevaluation；COIVD-2019；
IgM；IgG
2019年湖北省武汉市发现并暴发新型冠状病毒肺炎(coronavirus dia2019,COVID-19)以来，到目前新型冠状病毒(vere acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV-2)已在世界范围内的扩散引发了COVID-19大流行［］。随着疫情的发展，检测SARS-CoV-2抗体的血清学分析的可用性和用途也在增加，使人们能够更深入地了解COVID-19感染的流行病学，并为当地流行率和疾病发病率提供更准确的估计。然而,SARS-CoV-2抗体检测和运用过程中也遇见许多问题，因此对试剂盒的性能特征进行评估和验证对于指导临床使用至关重要。本研究首先对商业化的免疫荧光层析法检测SARS-CoV-2IgM和IgG抗体进行性能评价，其次，检测SARS-CoV-2IgM/IgG抗体在临床中的应用，最后探讨实际运用中遇见的假阳性问题。
材料和方法
1研究对象
选取重庆市公共卫生医疗救治中心收治的161例COVID-19确诊病例，年龄范围为2~86岁，平均年龄47.2±15.9岁，其中男性70例，女性91例；非COVID-19患者共79例，病例年龄范围为16~76岁，平均年龄48.0±16.1岁，其中男性30例，女性49例。COVID-19确诊患者的诊断符合《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第八版)》中的确诊病例的规定：疑似病例具备病原学证据者：实时荧光定量PCR检测新型冠状病毒核酸阳性。非COVID-19患者按照新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》(试行第八版)，排除COVID-19疑似，其中合并结核病患者18例，人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染患者12例，系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者11例，类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者20例，自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,HIA)患者18例。
2试剂和仪器
免疫荧光层析法2019-nCoV特异性IgM/IgG 抗体检测试剂盒和干式荧光免疫分析仪(型号iSIA01)由重庆新赛亚生物科技有限公司提供；化学发光特异性IgM/IgG抗体检测试剂盒和化学发光免疫分析仪均为博奥塞斯公司提供。
3方法
采集COVID-19患者和与非COVID-19患者血清,500r/min离心10min后，取上层血清，按照试剂盒的操作说明进行操作检测。所有操作均在生物安全柜中进行。样本采集参照新型冠状病毒肺炎防控方案(第
七版)的附件6《新型冠状病毒感染肺炎实验室检测技术指南》⑷。
4统计学处理
所有数据统计分析均采用SPSS20.0软件进行，计数资料采用百分比描述。
结果
1SARS-CoV2-IgM/IgG抗体检测性能评估
用免疫荧光层析法对161例COVID-19患者和79例非COVID-19患者进行SARS-CoV-2IgM/IgG 抗体检测，IgM和IgG的阳性检出率分别为88.82% (143/161).93.79%(151/161)；特异性分别为83.54% (66/79).92.41%(73/79)；假阳性率分别为16.46%、7.59%具体见表1。
表1SARS-CoV-2抗体检测试剂盒的
福建一本大学
性能评估结果(％)
项目阳性检出率特异性假阳性率
IgM88.82(143/161)83.54(66/79)16.46(13/79) IgG93.79(151/161)92.41(73/79)7.59(6/79)
2免疫荧光层析法与化学发光免疫分析法检测结果的一致性评价
化学发光免疫分析法在方法学上较层析法占有一定的优势，因此本研究用免疫荧光层析法和化学发光分析法对80例COVID-19患者和79例非COVID-19患者进行SARS-CoV-2IgM/IgG抗体检测，在159例患者中有135例患者IgM抗体结果一致，其中69例患 者均为阳性,6例患者均为阴性,4例患者结果不一致，一致率达84.91%(135/159)；141例IgG抗体结果一致，其中71例患者均为阳性，70例患者均为阴性, 18例患者结果不一致，一致率达88.68%(141/159)0
比较COVID-19患者和非COVID-19患者间结果一 致性,IgM 抗体在CO V ID-19患者一致率为90%，而 非COVID-19患者一致率为79. 75% , IgG 抗体在 COVID-19患者一致率为91.25%，而非COVID-19患
者一致率为8628%，两种方法检测IgG 结果的一致
性比IgM 偏高，具体见表2和表3.
一致性评价
表2免疫荧光层析法与化学发光法IgM 检测结果的
项目
一致
不一致
阳性
阴性
合计
COVID-19 患者
68
4
72
8
非COVID-19患者
1626316
表3免疫荧光层析法与化学发光法IgG 检测结果的
一致性评价
项目
一致
不一致
阳性
阴性
合计
COVID-19 患者
712
73
7
非COVID-19患者
686811
3 SARS- CoV2 - IgM/IgG 抗体不同发病时间
的检出率
发病不同阶段SARS-CoV-2特异性IgM 抗体 检出率情况，结果显示，发病7d 以内,IgM 抗体检出
率为27.39%(20/73)，发病8〜14d 时，IgM 抗体检 出率为67.09%(53/79)，发病15d 以上，IgM 抗体检
清明节祭文出率均为87.5% (56/64)；发病不同阶段SARS-
CoV-2 特异性IgG 抗体检出率情况，发病7d 以内， IgG 抗体检出率为21.92% (16/73)，发病8〜14d
自我鉴定大学
时，IgG 抗体检出率为6329%(50/79)，发病15d 以 上，IgG 抗体检出率为90.63% (58/64)； IgG 抗体和
结合IgM 抗体联合灵敏度初期为34.24%，中期为
7029% ，后期及恢复期为100% ，具体数值见表4.
表4患者发病后不同时间点IgM/IgG 抗体的阳性检出率
发病后时间(d)
例数
IgM( + )
IgG( + )
IgM 或 IgG( + )
1〜7
732016258 〜14
79
535056
>15
6456
58
64
4 非 COVID-19 患者 SARS-CoV2-IgM/IgG 抗体检出结果
免疫荧光层析法检测79例非COVID-19患者血
清SARS-CoV-2 IgM 和IgG 抗体情况见表5.在18
例结核患者中，2例IgM 阳性(11.11%),IgG 全阴性; 在11例SIE 患者中，2例IgM 阳性(1& 18%) , 1例 IgG 阳性(9. 09%)，其中1例两种抗体同时阳性
(9.09%)；在12例HIV 患者中，IgG 全阴性，l 例是
IgM 抗体阳性(&33%)，在20例RA 患者中,6例
IgM 阳性(3020%),5 例 IgG 阳性(2520% )，其中
4例两种抗体同时阳性(2020 % ),18例自身免疫性
肝炎患者，2例IgM 阳性(11.11%),IgG 全阴性.
表5各组血清样本中SARS-CoV-2 IgM/IgG 抗体检出结果
项目例数
IgM(+ )
I g G(+ )
IgM/IgG 同时阳性
例数
率(％)
例数
率(%)
例数
率(%)
结核
182
1121
0000HIV 12
18230
0SLE
1121828
19291929
RA
20630205252042020HIA
182
112100
00合计
79
13
16.46
6
729
鸽子养殖利润
5
623
5 稀释SARS- CoV- 2 IgM/IgG 抗体阳性的非 COVID-19患者血清后的检出结果
对 14 例非 COVID-19 患者 SARS-CoV-2
IgM/IgG 抗体阳性血清标本分别稀释2倍、4倍、8 倍后用免疫荧光层析法进行检测. 稀释2 倍后2 例
RA 、1例结核患者SARS-CoV-2 IgM 抗体阳性转变 为阴性，例RA 患者SARS-CoV-2 IgG 抗体阳性 转变为阴性，稀释4倍后6例RA 、1例结核患者
SARS-CoV-2 IgM 抗体阳性者转变为阴性，5例RA 患者SARS-CoV-2 IgG 抗体阳性转变为阴性，稀释
8倍后6例RA 、2例结核和HIA 患者SARS-CoV-2
赤坎
IgM 抗体阳性者转变为阴性,5例RA 患者SARS- CoV-2 IgG 抗体阳性转变为阴性.1例SLE 患者随
着稀释倍数增加SARS-CoV-2 IgG 抗体阳性程度越
咼，出现带现象.
讨 论
SARS-CoV-2抗体的血清学检测方法主要有胶 体金免疫层析法、免疫荧光层析法、化学发光法和酶
联免疫吸附法 (enzyme linked immunosorbent,
运动打卡
assay,ELISA)，免疫层析法操作简单、检测量大而被
实验室广泛使用。本研究使用免疫荧光层析法分别检测SARS-CoV-2的IgM抗体和IgG抗体，IgM 抗体的阳性检出率低于IgG抗体，但同时IgM抗体的假阳性率明显较高，不利于早期诊断，IgG的检测在阳性检出率和特异性方面表现均较好。免疫荧光层析法和化学发光免疫分析法一致性评价发现，在COVID-19患者和非COVID-19患者中IgG的一致率均高于IgM，而COVID-19患者中的IgM和IgG 的一致率高于非COVID-19。
研究发现COVID-19患者症状出现后,SARS-CoV-2IgM和IgG水平呈逐渐升高趋势，IgM和IgG的检出率愈高，本研究与先前研究一致［4］,IgG 抗体和IgM抗体联合检测也随发病时间愈长检出率越高，后期检出率可达到100%。虽然COVID-19患者发病早期血液中SARS-CoV-2特异性抗体阳性率不高，但在SARS-CoV-2密切接触者和疑似患者核酸检测阴性时，增加SARS-CoV-2IgM及IgG 抗体检测将有助于疑似病例的确诊和无症状感染者的筛查。
应用免疫层析法检测健康人群血清SARS-CoV-2抗体，具有相当低的假阳性率⑹，然而在非健康人群，如自身免疫性疾病、结核等患者的假阳性情况鲜有报道。本研究收集不同疾病患者（已排除SARS-CoV-2感染）血清检测SARS-CoV-2IgG及IgM，发现结核患者、HIV患者、SLE患者、RA患者和HIA患者中均出现了不同程度的假阳性。生物信息学分析表明，结核分枝杆菌蛋白Rv0934、Rv3763和Rv3875相对应的卡介苗抗原与SARS-CoV-2S1蛋白具有共同的信息特性，提示这些细菌蛋白与S1蛋白之间可能存在免疫交叉反应，可能诱导针对SARS-CoV-2的特异性适应性免疫应答6。GERARD等7采用免疫组化染色的方法，用SARS-CoV-2特异性包膜抗体在福尔马林固定的石蜡包埋的组织中检测出11例分枝杆菌。由此推测结核病患者在检测SARS-CoV-2抗体时有可能出现假阳性反应，在本研究中只纳入了18例结核病患者，出现了两例假阳性，且是结核分枝杆菌蛋白引起的假阳性需要进一步研究。TAN等阪用化学发光免疫分析对两例COVID-19患者进行HIV血清学测试，结果是有反应性，然后用HIV免疫印迹进行了确证试验，两份血清均为阴性。因此，HIV感染患者使用胶体金免疫层析法检测结果也可能出现假阳性结果，可能是由于HIV和SARS-CoV-2S蛋白具有独特的相似性可能造成的交叉反应凹。我们检测的自身免疫性疾病患者血清标本也出现假阳性反应。分析患者发生假阳性的可能原因：①ARISTO等［10］以ELISA的方法检测SARS-CoV-2刺突蛋白抗体和核蛋白抗体与组织蛋白之间是否有反应，发现棘突蛋白抗体和核蛋白抗体与线粒体、转谷氨酰胺酶、核抗原、甲状腺过氧化物酶、可提取核抗原和髓鞘碱性蛋白呈强反应性。由此推测，当人患某些自身免疫性疾病时，血液中的自身免疫性抗体有可能与胶体金标记法的硝酸纤维素膜包被SARS-CoV-2的两种抗原（
N蛋白和S蛋白）发生交叉反应。②WANG 等［1］SARS-oCV转染非洲绿猴肾细胞的混合裂解液和Veo-E6细胞裂解液分别作为包被抗原来检测抗SARS-oCV抗体，发现部分SLE、混合性结缔组织病和干燥综合征患者存在假阳性，其认为非洲绿猴肾细胞裂解液中存在细胞膜、胞浆和细胞核的裂解成分有可能含有针对不同类型自身抗体的抗原。如果将含有SARS-CoV-2的非洲绿猴肾细胞裂解后用于SARS-CoV-2IgM和IgG抗体检测，有可能造成自身免疫性疾病患者出现假阳性。③RA患者含有不同水平的类风湿因子（rheumatoid factor, RF），通常为IgM型,RF可以与硝酸纤维素膜上包被的IgG以及胶体金标记的IgG抗体结合，从而出现假阳性结果，尤其是在捕获法IgM型抗体中表现最为明显［12］，这也是本研究中RA患者IgM假阳性率高于IgG的可能原因。
贾兴旺等［13］研究发现当RF>331IU/mL时, SARS-CoV-2I g M抗体呈阳性,RF为981.2IU/mL 的样本,SARS-CoV-2I g M和SARS-CoV-2IgG抗体均呈阳性，由此推测干扰物质达到一定量时才可引起抗体检测假阳性。本研究将SARS-CoV-2 IgM/IgG抗体阳性的非COVID-19患者血清进行稀释后检测发现，通过稀释可以避免RF的干扰，减少其他干扰物质的影响，同时发现1例SLE患者血清随着稀释倍数增加SARS-CoV-2IgG抗体阳性程度越高，出现带现象。
综上所述，本研究采用的免疫荧光层析法是一种快速、简便的检测方法，试剂的灵敏度和特异性均比较高，和化学发光免疫分析法进行的一致性评价也显示两者之间检测结果一致性较高，试剂性能验证显示符合筛查实验的要求，对COVID-19的检测结果较为可靠。试剂在检测不同疾病患者标本时出现
了不同程度的交叉反应，虽然通过稀释可一定程度减少假阳性率，但临床医生在筛查疾病时除了考虑患者的流行病学特点和临床症状外，还应进行病
毒核酸检测。本研究有一定的局限性，首先，标本数量偏少；其次，对试剂盒只进行了部分性能验证。第三，本研究在HIV、结核和自身免疫性疾病引起的假阳性原因方面的研究亟待深入。
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(上接第245页)
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