用于粪便样本的Ａ组轮状病毒ＲＴ ＰＣＲ
快速检测方法的建立及应用
许瑞娜，刘和录，朱淑娥，於艳霞，丁 华
（深圳市中西医结合医院检验科，广东深圳５１８１０４）
ＤＯＩ：１０．１１７４８／ｂｊｍｙ．ｉｓｓｎ．１００６－１７０３．２０２０．１１．０３２收稿日期：２０２０ ０７ ３１；修回日期：２０２０ ０７ ３１
基金项目：深圳市宝安区科技技术项目（编号：２０１６ＣＸ１２９）
作者简介：许瑞娜（１９８２—），女，本科，主管技师。研究方向：主要从事临床体液及分子生物学研究。Ｅ ｍａｉｌ：ｒｎｌ５１４＠１６３．ｃｏｍ
摘要：目的 建立用于粪便样本Ａ组轮状病毒（ＲＶＡ）的实时荧光ＲＴ ＰＣＲ（ＲＴ ＰＣＲ）快速检测方法并探究其应用价值。方法 收集２０１６年８月至２０１８年１２月本院门诊儿科及住院部儿科稀便及水样便标本２００例轮状病毒胶体金阳性标本为研究对象，采用实时荧光ＲＴ ＰＣＲ检测样本ＲＶＡ，分析其灵敏度、特异性及精密度，并与胶体金免疫层析、试剂盒检测方法进行对比研
究。结果 本研究一步法实时荧光ＲＴ ＰＣＲ检测ＲＶＡ灵敏度高，与种属相近病毒无交叉反应；不同浓度ＲＶＡ上清样本Ｃｔ值标准差在０．１７～０．４２范围内，变异系数（ＣＶ）在０．４９％～１．８７％范围内；与胶体金免疫层析方法对比，阳性符合率为９１．０３％、阴性符合率为９０．９８％，总符合率为９１．００％，Ｋａｐｐａ值为０．８１３，与上海之江ＲＶＡ检测试剂盒检测结果对比，阳性符合率为１００％，阴性符合率为９７．４１％，总符合率９９．５％，Ｋａｐｐａ值为０．９６９。结论 本研究建立的一步法实时荧光ＲＴ ＰＣＲ具有灵敏度、特异性、精密度高，简单快速，通用性好等特点，对临床ＲＶＡ引起的小儿腹泻快速诊断有一定应用价值。
关键词：Ａ组轮状病毒； 实时荧光ＲＴ ＰＣＲ； 检测中图分类号：Ｒ４４６．１ 文献标识码：Ａ
ＴｈｅＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＲＴ ＰＣＲｆｏｒａＲａｐｉｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＲｏｔａｖｉｒｕｓＡｉｎＦｅｃａｌＳａｍｐｌｅｓ
ＸＵＲｕｉｎａ，ＬＩＵＨｅｌｕ，ＺＨＵＳｈｕ′ｅ，ＹＵＹａｎｘｉａ，ＤＩＮＧＨｕａ
（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＳｈｅｎｚｈｅｎＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅａｎｄＷｅｓｔｅｒｎＭｅｄｉｃｉｎｅＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ５１８１０４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｒｅａｌ ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰＣＲ（ＲＴ ＰＣＲ）ｍｅｔｈｏｄｆｏｒａｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｒｏｔａｖｉｒｕｓＡ（ＲＶＡ）ｉｎｆｅｃａｌｓａｍｐｌｅｓａｎｄｅｘｐｌｏｒｅｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｖａｌｕｅ．ＭｅｔｈｏｄｓＦｒｏｍＡｕｇｕｓｔ，２０１６ｔｏＤｅｃｅｍｂｅｒ，２０１８，２００ｒｏｔａｖｉｒｕｓｃｏｌｌｏｉｄａｌｇｏｌｄｐｏｓｉｔｉｖｅｓｐｅｃｉｍｅｎｓｉｎｌｏｏｓｅｓｔｏｏｌａｎｄｗａｔｅｒｙｓｔｏｏｌｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄｉｎｏｕｔｐａｔｉｅｎｔａｎｄｉｎｐａｔｉｅｎｔｐｅｄｉａｔｒｉｃｓｆｒｏｍｏｕｒｈｏｓｐｉｔａｌ．Ｒｅａｌ ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰＣＲｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔＲＶＡ．Ｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄｐｒｅｃｉｓｉｏｎｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ，ａｎｄｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｌｌｏｉｄａｌｇｏｌｄｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄｋｉｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｏｎｅ ｓｔｅｐｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＲＴ ＰＣＲｉｎｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＲＶＡｗａｓｖｅｒｙｈｉｇｈ，ａｎｄｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｃｒｏｓｓｒｅａｃｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｖｉｒｕｓｅｓｏｆｓｉｍｉｌａｒｇｅｎｅｒａａｎｄｓｐｅｃｉｅｓ．ＴｈｅｓｔａｎｄａｒｄｄｅｖｉａｔｉｏｎｏｆＣｔｖａｌｕｅｓｏｆＲＶＡｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓａｍｐｌｅｓｗａｓｉｎｔｈｅｒａｎｇｅｏｆ０．１７ ０．４２ａｎｄｔｈｅｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｏｆｖａｒｉａｔｉｏｎ（ＣＶ）ｗａｓｉｎｔｈｅｒａｎｇｅｏｆ０．４
９％ １．８７％．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｃｏｌｌｏｉｄａｌｇｏｌｄｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅｒａｔｅｗａｓ９１．０３％，ｗｈｉｌｅｔｈｅｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅｒａｔｅｗａｓ９０．９８％，ｔｈｅｔｏｔａｌｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅｒａｔｅｗａｓ９１．００％，ａｎｄｔｈｅＫａｐｐａｖａｌｕｅｗａｓ０．８１３．Ａｌｓｏ，ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＳｈａｎｇｈａｉＺｈｉｊｉａｎｇＲＶＡｔｅｓｔｋｉｔ，ｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅｒａｔｅｗａｓ１００％，ｔｈｅｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅｒａｔｅｗａｓ９７．４１％，ｔｈｅｔｏｔａｌｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅｒａｔｅｗａｓ９９．５％，ａｎｄｔｈｅＫａｐｐａｖａｌｕｅｗａｓ０．９６９．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅｏｎｅ ｓｔｅｐｒｅａｌ ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＲＴ ＰＣＲｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙｈａｓｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｈｉｇｈｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，ｓｉｍｐｌｅａｎｄｒａｐｉｄ，ａｎｄａｇｏｏｄｕｎｉｖｅｒｓａｌｉｔｙ，ｗｈｉｃｈｈａｓｃｅｒｔａｉｎａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｖａｌｕｅｓｉｎｔｈｅｒａｐｉｄｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｉｎｆａｎｔｉｌｅｄｉａｒｒｈｅａｃａｕｓｅｄｂｙＲＶＡ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＲｏｔａｖｉｒｕｓＡ； Ｒｅａｌ ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＲＴ ＰＣＲ； Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
６
螺旋式
７９１ＬａｂｅｌｅｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ＆ＣｌｉｎＭｅｄ，Ｎｏｖ．２０２０，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．１１
腹泻是儿科常见消化道疾病，好发于６个月至６岁婴幼儿，是引起儿童死亡的第二大原因，其中多为轮状病毒（ｒｏｔａｖｉｒｕｓ，ＲＶ）感染［１ ３］。ＲＶ感染常以水样腹泻伴呕吐发烧、严重脱水、电解质紊乱等为主特征，严重可引起患儿死亡，极大威胁儿童健康［４］。ＲＶ是一种双链核糖核酸病毒，根据其编码６个结构蛋白（ＶＰ６）抗原特异性分为Ａ Ｈ８组，其中Ａ组轮状病毒（ｒｏｔａｖｉｒｕｓＡ，ＲＶＡ）是引起婴幼儿腹泻的主要ＲＶ病毒类型［５ ６］。目前临床检测ＲＶ的主要方法有电子显微镜、胶体金法、酶联免疫吸附法（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ，ＥＬＬＳＡ）、核酸杂交、反转录 ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＰＣＲ，ＲＴ ＰＣＲ）及反转录实时定量ＰＣＲ（ｒｅａｌ ｔｉｍｅｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ，ｒｅａｌ ｔｉｍｅＲＴ ｑＰＣＲ），其中电子显微镜设备价格昂贵，常规实验室难以普及，胶体金及ＥＬＩＳＡ直接抗原检测灵敏度不佳，近年来ＲＴ ＰＣＲ、ＲＴ ｑＰＣＲ及巢式ＰＣＲ等核酸检测方法可显著提高ＲＶＡ检测的灵敏度，但耗时长，不能完全满足ＲＶＡ快速检测要求［７ ８］。因此建立一种快速、准确、简单、廉价的ＲＶＡ检测方法为临床ＲＶＡ感染快速诊断及预后评估至关重要。本研究旨在探究一步法实时荧光ＲＴ ＰＣＲ快速检测ＲＶＡ的临床效果及临床应用价值。
材料和方法
１ 毒株
ＲＶＡ毒株、Ｆ组肠道腺病毒４０型、肠道病毒７１型、肠炎沙门氏菌、空肠弯曲杆菌均来源于美国菌种保藏中心（ＡＴＣＣ）。
２ 临床样本收集
收集２０１６年８月至２０１８年１２月本院门诊儿科及住院部儿科稀便及水样便标本２０００例，抽取其中２００例轮状病毒胶体金阳性标本为研究对象，其中男９４例，女１０６例，年龄４月至６岁，中位年龄３岁。另取２００例轮状病毒胶体金阴性标本为对照组，男９６例，女１０４例，年龄４个月至６岁，中位年龄３．２岁。 ３ 主要仪器及试剂
引物及探针引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；ＲＶＡ抗原胶体金免疫层析试剂盒购自北京万泰生物药业股份有限公司；ＲＶＡ实时荧光检测试剂盒购自上海之江生物科技有限公司；Ｃｏｂａｓｚ ４８０ＰＣＲ仪器购自罗氏公司；Ｅｘｐｕｒｅ ２０核酸提取仪购自深圳汇研科创生物科技有限公司等。
４ 引物和探针设计
在Ｇｅｎｂａｎｋ下载ＲＶＡ序列，利用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒｖ５．０、Ｏｌｉｇｏｖ６．３１、ＴｍＵｔｉｌｉｔｙｖ１．３等软件进行检测引物和探针设计，共２对引物及探针，具体信息见表１。
表１ 引物及探针序列
ＮａｍｅＳＥＱ５′ ３′ｌｅｎｇｔｈｒａｔｉｎｇｏｆＰ５ＴＭｏｆＰ５ＴＭｏｆＮＣＢＩ第一对ＲＮ ＲＶ ＮＳＰ５ Ｆ７４＋２３ １ＴＣＴＡＣＡＡＣＧＴＣＡＡＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧ２３８９５６．７５８．３８ＲＮ ＲＶ ＮＳＰ５ Ｆ７４＋２３ ２ＴＣａＡＣＡＡＣＧＴＣＡＡＣＴａＴＴＴＣＴＧＧ２３８８５６．７５８．３８
ＲＮ ＲＶ ＮＳＰ５ Ｒ１８４ ２４ＡＡＴＡＴＣＣＴＣＴＧＧＡＧＡＣＴＴＣＧＡＣＡ２３８７５７．５５８．４６ＲＮ ＲＶ ＮＳＰ５ Ｐ１０７＋２９ＴＣＴＧＧＴＧＡＡＡＴＧＴＡＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＣＴＡＣＣ２９８４６５．５６４．１５
第二对ＲＮ ＲＶ ＶＰ２ Ｆ６１０＋２５ＧＡＴＧＣＴＧＧＴＡＡＡＧＴＴＧＴＡＧＡＴＴＣＴＧ２５７９５７．６５７．９９ＲＮ ＲＶ ＶＰ２ Ｒ７３１ ２１ＴＣＡＧＣＣＴＧＡＡＣＴＴＧＴＴＧＴＣＴＣ２１７７５５５８．１６
ＲＮ ＲＶ ＶＰ２ Ｐ６６４＋３０ＣＡＧＧＡＴＧＡＧＧＡＡＡＣＡＧＡＧＧＧＡＧＴＴＡＴＣＡＧＡ３０７７６９．５６５．２１
５ 质控品建立
采用空斑减数实验进行ＲＶＡ培养上清标定，稀释上清液至１．０×１０６ＰＦＵ／ｍＬ，为阳性质控品［呈典型Ｓ型曲线扩增且循环阈值（ｃｙｃｌｅｔｈｒｅｓｈｏｌｄｖａｌｕｅ，Ｃｔ值）≤３０］，灭菌生理盐水为阴性质控品（无典型Ｓ型扩增曲线或无Ｃｔ值）。同时检测待检样品、阴性阳性质控品，用于实验质控。 ６ 核酸提取
收集稀便或水样便２～５ｍＬ于收集管内，如有黏液便可加入１ｍＬ生理盐水于收集管内３０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，取２００ｍＬ粪便上清液采用磁珠法提取粪便核酸，置于－８０℃冰箱保存待用。
７ ＲＴ ＰＣＲ检测
分别用引物、探针经一步法及经典两步法各进
７
７
９
１
标记免疫分析与临床 ２０２０年１１月第２７卷第１１期
行ＰＣＲ检测。一步法反应体系（４０ｍＬ）：４×Ｂｕｆｆｅｒｌ
１０．０ｍＬ，ｄＮＴＰ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）０．３２ｍＬ，Ｍｇ２＋（１００ｍｍｏｌ／Ｌ）１．６ｍＬ，上下游引物（Ｆ／Ｒ，２５μｍｏｌ／Ｌ）各０．３２ｍＬ，探针（Ｐ，１０μｍｏｌ／Ｌ）０．４ｍＬ，Ｔａｑ Ｅ酶（１．５Ｕ／ｍＬ）１．０ｍＬ，Ｒ Ｅ酶（２００Ｕ／ｍＬ）０．２ｍＬ，ｄｄＨ
２
Ｏ５．８４ｍＬ，粪便核酸提取液２０ｍＬ。反应条件：５０℃１０ｍｉｎ；９５℃２．５ｍｉｎ；９５℃１０ｓ，４５个循环；６０℃３０ｓ，４５个循环。两步法反转录反应体系：１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ２．０ｍＬ，０．５ｍｏｌ／ＬＨＣＬ１．８ｍＬ，１ｍｏｌ／ＬＫＣＬ２．５ｍＬ，Ｔｗｅｅｎ ２０（２０％）０．２５ｍＬ，ＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬ，５０％甘油
（Ｇｌｙ）４．０ｍＬ，Ｍｇ２＋（１００ｍｍｏｌ／Ｌ）１．０ｍＬ，ＮＨ
４＋（４００ｍｍｏｌ／Ｌ）２．０７５ｍＬ，ｄＮＴＰ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）０．４ｍＬ，
ＰａｎｄｏｍＰｒｉｍｅｒ２．０ｍＬ，酶（Ｍ ＭｕＣＶＲｅ）０．２ｍＬ，ｄｄＨ
２Ｏ８．２７５ｍＬ核酸提取液２５．０ｍＬ。反应条件：３７℃５９ｍｉｎ，８０℃５ｍｉｎ，４℃２０ｍｉｎ。ＰＣＲ反应体系：４×Ｂｕｆｆｅｒｌ１０．０ｍＬ，ｄＮＴＰ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）０．３２ｍＬ，Ｍｇ２＋（１００ｍｍｏｌ／Ｌ）１．６ｍＬ，上下游引物（Ｆ／Ｒ，２５μｍｏｌ／Ｌ）各０．３２ｍＬ，探针（Ｐ，１０μｍｏｌ／Ｌ）０．４ｍＬ，Ｔａｑ Ｅ酶（１．５Ｕ／ｍＬ）１．０ｍＬ，ｄｄＨ
２
Ｏ１６．０４ｍＬ，反转录后模板１０ｍＬ。反应条件：９５℃１５０ｓ，９５℃１０ｓ。
８ 统计学处理
采用ＳＰＳＳ２５．０软件进行统计学分析、检验Ｋａｐｐａ一致性，采用四格表对分类变量资料进行χ２分析，采用Ｅｘｃｅｌ软件进行精密度分析，以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
结 果
１ ＲＴ ＰＣＲ扩增产物分析
来自深圳市宝安区疾控中心提供的ＲＶＡ阴性、阳性样本各１２份进行实时荧光ＲＴ ＰＣＲ检测，结果发现，ＲＶＡ阳性样本均呈典型Ｓ型曲线扩增，Ｃｔ值＜３８；ＲＶＡ阴性样本均呈无Ｓ型扩增（图１），无Ｃｔ
值。
图１ ＲＶＡ阴性、阳性样本实时荧光ＲＴ ＰＣＲ扩增曲线
２ 实时荧光ＲＴ ＰＣＲ方法灵敏度分析
经空斑减数实验标定ＲＶＡ浓度为５．２９×１０８item什么意思
ＰＦＵ／ｍＬ，取其上清进行梯度倍比稀释，分别稀释至
１．０×１０５、１．０×１０４、１．０×１０３、１．０×１０２、１．０×１０１、
１．０×１００ＰＦＵ／ｍＬ，分别进行一步法及两步法实时荧
光ＲＴ ＰＣＲ扩增，进行２０次重复检测，结果见表１。
ＲＶＡ浓度为１．０×１０１时，第二对引物一步法和两步
法的检出率相同，均高于第一对引物，提示第二对引
物灵敏度较好，但由于一步法操作简单，因此选择第
红色经典诗文
二对引物一步法，用于后续试验。
８
萝莉动漫图片７
９
１ＬａｂｅｌｅｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ＆ＣｌｉｎＭｅｄ，Ｎｏｖ．２０２０，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．１１
表１ 实时荧光ＲＴ ＰＣＲ方法灵敏度分析（％）
项目
ＲＶＡ浓度（ＰＦＵ／ｍＬ）
１．０×１０
５
草莓汤圆１．０×１０
４
１．０×１０
３
１．０×１０
２
１．０×１０
１
１．０×１０
０
第一对引物一步法
检测次数２２２２２２２２２２２２阳性次数２０２０２０１９１１６检出率（％）
１００．００１００．００１００．００８６．３６５０．００２７．２７第一对引物两步法
检测次数２２２２２２２２２２２２阳性次数２０２０２０２０１２６检出率（％）
１００．００１００．００１００．００９０．９１５４．５４２７．２７第二对引物一步法
检测次数２０２０２０２０２０２０阳性次数２０２０２０２１１４８检出率（％）
１００．００１００．００１００．００９５．４５６３．６４３６．３６第二对引物两步法
检测次数２２２２２２２２２２２２阳性次数２０２０２０２１１４７检出率（％）
１００．００
１００．００
１００．００
９５．４５
６３．６４
３１．８２
３ 实时荧光ＲＴ ＰＣＲ方法特异性分析 为探究一步法实时荧光ＲＴ ＰＣＲ检测ＲＶＡ的特异性，分别采用种属相近、感染部位相同及症状相似的病原菌Ｆ组肠道腺病毒４０型、肠道病毒７１型、
肠炎沙门氏菌、空肠弯曲杆菌及诺如病毒为待检样本进行检测，结果均显示为阴性，提示该法具有良好特异性（见图２
）
。
注：１～２为Ｆ组肠道腺病毒４０型；３～４为肠道病毒７１型；５～６为肠炎沙门氏菌；７～８为空肠弯曲杆菌；
９～１０为诺如病毒；Ｍ为ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ
图２ 特异性病原体一步法实时荧光ＲＴ ＰＣＲ扩增结果
４ 实时荧光ＲＴ ＰＣＲ方法精密度分析
以１×１０７、１×１０６、１×１０５、１×１０４、１×１０３
ＰＦＵ／ｍＬ
ＲＶＡ上清为待测样本，采用本研究新建立的一步法实时荧光ＲＴ ＰＣＲ检测ＲＶＡ，重复３０次，结果显示，Ｃｔ值
标本差在０．１７～０．４２范围内，变异系数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｏｆｖａｒｉａｂｌｅ，ＣＶ）在０．４９％～１．８７％范围内（表２），提示符合检测精密度要求，具有良好的稳定性及可重复性。
表２ 一步法实时荧光ＲＴ ＰＣＲ方法精密度分析结果
项目ＲＶＡ浓度（ＰＦＵ／ｍＬ）
１．０×１０
３
１．０×１０
４
男生留胡子１．０×１０
５
１．０×１０
６
１．０×１０
７
Ｃｔ值２８．９７±０．４２
２６．７２±０．２４
２３．６５±０．２１
２０．２８±０．１７
１６．９４±０．２５周子怡
ＣＶ（％）
１．８７
１．２１
０．４９
０．５６
０．９７
９
７９１标记免疫分析与临床 ２０２０年１１月第２７卷第１１期
５ 与胶体金免疫层析、试剂盒检测方法对比分析
对本研究纳入的２００份标本采用本研究第二组引物探针一步法检测ＲＶＡ，结果与胶体金免疫层析方法对比，阳性符合率为９１．０３％、阴性符合率为９０．９８％，总符合率为９１．００％，Ｋａｐｐａ值为０．８１３（表３），与上海之江ＲＶＡ检测试剂盒检测结果对比，阳性符合率为１００％，阴性符合率为９７．４１％，总符合率９９．５％，Ｋａｐｐａ值为０．９６９（表４）。
表３ 一步法实时荧光ＲＴ ＰＣＲ与胶体金免疫层析方法检测结果对比
本研究方法
胶体金免疫层析方法
阳性阴性合计
Ｋａｐｐａ值
一步法实时荧光ＲＴ ＰＣＲ阳性７１１１８２０．８１３
阴性７１１１１１８
合计７８１２２２００
符合率（％）９１．０３９０．９８９１．００
表４ 一步法实时荧光ＲＴ ＰＣＲ与上海之江ＲＶＡ检测试剂盒检测结果对比
本研究方法
ＲＶＡ检测试剂盒
阳性阴性合计
Ｋａｐｐａ值
一步法实时荧光ＲＴ ＰＣＲ阳性８４３８７０．９６９
阴性０１１３１１３
合计８４１１６２００
符合率（％）１００．００９７．４１９９．５０
莫名是什么意思讨 论
我国ＲＶ感染发病率高达３０％～４０％，是引起６岁以下婴幼儿腹泻的主要病原体，严重威胁婴幼儿身体健康及生活质量［９ １１］。ＲＶＡ可经粪 口传播，是大规模流行的主要病因，因此早期检测不仅是控制其感染及传播的关键，也是临床正确治疗、合理用药及预后评估的关键［１２ １３］。
目前临床有基于各种原理检测ＲＶＡ的方法，但检测效果均不理想，如ＥＬＩＳＡ、胶体金等免疫学检测技术，要求检测样本病毒含量较高，即灵敏度差，存在漏诊及误诊，近来核酸检测成为临床前景较好且适用性强的有效检测手段，但依然存在耗时长等缺点［１４］。为了建立一种急速、快捷、经济实用且具有普遍适用性的检测方法，本研究采用一步法实时荧光ＲＴ ＰＣＲ法检测ＲＶＡ。由于粪便标本含有胆盐、胆红素、氯高铁血红素等抑制ＰＣＲ反应的物质，传统ＲＴ ＰＣＲ对于标本预处理环节繁琐，对仪器要求较高，所用试剂也较多，成本较高，大部分的医院难以达到要求［１５］。为了简化标本预处理步骤，本研究首先采用简易式过滤吸附装置快速过滤粪便标本，该装置利用疏水性Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ膜具有很高的蛋白结合能力，而对核酸的结合效率较低；该装置孔径为０．２
μｍ，而病毒体积通常以纳米级为单位，可将粪便标本的颗粒、细菌等样品杂质去除，粪便悬液中的病毒颗粒经正压过滤而固化于膜上，用去垢剂如Ｔｗｅｅｎ２０和蛋白酶Ｋ消化膜结合的病毒颗粒，于是核酸从衣壳中释放出来，同时存在于标本中的ＲＮＡ酶被失活，可达到一步提取核酸的效果，大大缩短标本预处理及核酸提取时间。
其次，在Ｇｅｎｂａｎｋ基础上，利用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒｖ５．０、Ｏｌｉｇｏｖ６．３１、ＴｍＵｔｉｌｉｔｙｖ１．３等软件进行检测引物和探针设计，共设计两对引物，分别采用本研究一步法及传统两步法进行扩增，检测引物的特异性及扩增效率，进一步优化引物，结果发现第二对引物一步法检测ＲＶＡ检出率为９５％时的ＲＶＡ浓度可达２．０×１０２ＰＦＵ／ｍＬ，提示该法灵敏度高，可用于后续试验。同时本研究采用ＴｔｈＤＮＡ聚合酶使ＲＴ和ＰＣＲ一步完成，可减少污染环节，简化操作程序，节省检测时间，基于ＲＴ ＰＣＲ检测Ｃｔ值，结果发现，本研究建立的一步法实时荧光ＲＴ ＰＣＲ法与种属相近病毒无交叉反应，不同浓度ＲＶＡ上清样本Ｃｔ值标准差在０．１７～０．４２范围内，提示该法具有良好的特异性。ＣＶ在０．４９％～１．８７％范围内，均小于２．５％，提示该法具有良好精密度，可重复性好，可能具有普遍适用性。
最后，为进一步探究其临床应用价值，将本研究
０
８
９
１ＬａｂｅｌｅｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ＆ＣｌｉｎＭｅｄ，Ｎｏｖ．２０２０，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．１１
