中，兽医科学 2021，51(01):53-58
Chine Veterinary Science网络首发时间：2020-10-14
D01：10.16656/j.issn.l673-4696.2020.0208 中图分类号：S852.43 文献标志码：A文章编号：1673_4696(2021)01-0053-06大熊猫IgG Fc HRP酶标二抗的制备
骆琢\王振斌\李明恒\王兴龙”，潘广林2*
(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌712100;
2.陕西省林业科学院珍稀野生动物救护基地，陕西周至710402)
摘要：为获得辣根过氧化物酶（HRP)标记的抗大熊猫IgG抗体，本研究利用重组大肠杆菌表达技术对 大熊猫IgG F c片段进行了表达，获得重组蛋白后进行了小鼠免疫，抗体特异性检测，并进行了多克隆抗体的 HRP标记。结果显示，在37 °C、IPTG浓度为0.5mmol/L、诱导5h的条件下，可获得分子质量约为88k u的目的蛋白；将重组蛋白免疫小鼠后，免疫小鼠血清与重组蛋白反应效价可达1 : 102 400以上，且与大熊猫血 清IgG反应良好，经HRP标记试剂盒标记的鼠抗大熊猫IgG效价可达1 :25 600以上。上述结果表明，本研 究成功制备了 HRP标记的小鼠抗大熊猫IgG二抗，为大熊猫疾病血清学检测方法的开发提供了支撑。
关键词：大熊猫；IgG F c；酶标二抗
Preparation of HRP enzyme-labeled cond antibody against
giant panda IgG Fc
L U O Chen1，WANG Zhen-bin1,LI Ming-heng1，WANG Xing-long1*,PAN Guang-lin2*
(1. College of Veterinary Medicine , Northwest A &F University, Yangling 712100, China；
2.Rare Wildlife Rescue Ba .Shaanxi Academy o f Forestry .Zhouzhi 710402, China)春深似海
Abstract：In order to obtain HRP labeled anti-giant panda IgG antibody,the giant panda IgG Fc fragment was expresd by li expression technique. The recombinant protein was immunized in mice,the antibody specificity was detected,and the polyclonal antibody was labeled with HRP. The results showed that the target protein with molecular weight of about 88 ku could be obtained under the condition of 37 °C ,IPTG concentration of 0.5 mmol/L and induction for 5 h.After immunizing mice with the recombinant protein,the reaction titer of the immunized mou rum with the recombinant protein was more than 102 400 and reacted well with the giant panda rum IgG. The titer of mou anti-giant panda IgG labeled by HRP labeling kit can reach more than 25 600. Th
e results showed that the HRP labeled mou anti-giant panda IgG condary antibody was successfully prepared,which provided support for the development of rological detection methods for giant panda dias.
Key words：giant panda；IgG Fc；enzyme labeled condary antibody
* Corresponding authors：WANG Xing-long,E-mail ：wxlong@nwsuaf. edu. cn；PAN Guang-1 in,E-mail ：33954979@qq. com
大熊猫是食肉目、熊科、大熊猫亚科、大熊猫属 猫的生存状况受到广泛关注。在国家一系列措施的唯一的哺乳动物，作为中国的珍稀濒危动物，大熊 保障下，大熊猫保护工作初见成效[1]。国际自然保护
收稿日期：2020-09-09；修回日期：2020-10-14
基金项目：国家重点研发计划项目（2017YFD0501703;2017YFD0501706)
作者简介：胳琛（1996-)，男，陕西西安人，硕士生，研究方向为动物传染病防治，E-mail:****************。*通讯作者：王兴龙，教授，博士，研究方向为动物传染病防治，E-mail:*****************；潘广林，高级兽医师，兽医硕
士，研究方向为野生动物疾病防治及保护研究，E-mail:***************。
54中国兽医科学第51卷
联盟已将大熊猫的地位从“濒危”改为了威胁较小 的“脆弱”，但疾病给大熊猫保护工作带来了巨大的 挑战。据调查，大熊猫疾病有近40种》]，在做好药物 治疗的同时，建立特异性的诊断方法对于大熊猫疾 病的防控至关重要。逢博3；通过制备针对大熊猫犬 冠状病毒的荧光抗体，建立了大熊猫犬冠状病毒的 荧光检测方法。雷燕等[1利用从腹泻大熊猫粪便中 分离得到的大熊猫轮状病毒，建立了大熊猫轮状病 毒的RT-PC R检测方法。郭玲等[5]设计了针对犬细 小VP2基因的P C R诊断方法，并完成了对大熊描 粪便样品的检测。王斌61于2013年成功建立了 7种检测大熊猫病毒性疾病的PC R检测方法，陈珍容等m 成功建立了针对大熊猫轮状病毒的SYBR Green I 的实时荧光定量PC R检测方法。虽然针对-些疫病 建立了上述检测方法，但目前缺乏商品化的大熊猫 二抗，严重制约了大熊猫血清学检测方法的发展。
IgG是动物体内含量最高的免疫球蛋白，在机体 抗感染免疫中发挥着重要作用，是具有2条重链和 2条轻链的对称结构，其重链恒定区F c片段可被多 克隆抗体特异性识别和结合[8]。研究人员曾通过提 纯大熊猫血清IgG建立了大熊猫血清IgG的单向免 疫扩散和EL1S A检测方法的'但提纯量有限，难以 在实际生产中应用。用大肠杆菌表达方法获得重组 蛋白的技术已经广泛应用到现代医药生物技术领 域〜13]。为克服大熊猫血清难以获得的困难，研究利 用大肠杆菌表达系统获取大熊猫IgG F c蛋白，免疫 小鼠后制备HRP酶标大熊猫二抗具有实际意义。
1材料与方法
1.1质粒和血清
包含大熊猫IgG F c片段基因序列（GenBank登 录号:AY818390.1，经过密码子优化）的pMAL-C4x- P F c重组质粒由本实验室保存。大熊猫血清（免疫犬 瘟热疫苗后第14天采集）由陕西省林业科学院珍 稀野生动物救护基地提供。
1.2主要试剂
Dextrin Beads 6F F购自常州天地人和公司。rProtein A Beads4FF购自 Smart-Lifesciences公司。TM B显色液购自北京索莱宝科技有限公司。
1.3表达及纯化
将质粒pMAL-C4x-P F c转化BL21(DE3)感受 态细胞。重组菌在37 °C、IPTG浓度0.5 mmol/L的条件下，诱导表达5 h。超声破碎菌体,6 000 r/min离 心10 min，收集上清。
参照Dextrin Beads6F F说明书进行蛋白纯化，收集流出液、洗涤液和洗脱液，进行SDS-PAGE鉴定。
1.4多克隆抗体制备
将重组蛋白（使用弗氏佐剂）以每只100 P g的剂量皮下免疫小鼠5只，三免后第7天采血，分离 血清于一20 °C保存。
1.5蛋白包被浓度的确定
用方阵滴定法确定最适蛋白包被浓度。将重组 蛋白或大熊猫血清2倍比稀释包被于酶标板（起始 浓度 1 : 50)，每孔 100 y L，37 °C孵育 2 h;PBST 洗 涤3次后，10%脱脂乳，37 °C封闭2 h，PBST洗涤3 次，获得包被好的反应板。
将阳性血清2倍比稀释（起始浓度1 :50)，每孔 100 HL,37 °C孵育1hD PBST洗涤5次，每孔加入 HRP标记的山羊抗小鼠丨gG(100 y L,l : 5 000稀 释），37 °C孵育1h。P B ST洗涤5次，加人50 yL 丁!^8,37°(：显色15〇1丨11，加入50/^终止液，测045〇值，根据最适反应原则确定重组蛋白或血清的最佳 包被浓度。
1.6多克隆抗体效价的测定
将5份免疫小鼠血清和3份未免疫小鼠血清 以1 : 50起始做2倍比稀释，根据P//V值（P/iV彡2.1)计算抗体的效价。
1.7多克隆抗体稳定性检测
将获得的小鼠血清分3批（间隔1周），每样3 个重复，测定血清反应Aso值，计算批内差异和批间 差异，分析抗体反应的稳定性。
1.8多克隆抗体特异性检测
将大熊猫，健康鸡、家兔、猪、山羊血清以1 : 100的稀释度包被酶标板，与大熊猫IgG F c免疫小 鼠和未免疫小鼠血清反应，每样3个重复，分析免 疫小鼠多克隆抗体与大熊猫]g G反应的特异性。1.9多克隆抗体的纯化
参照rProtein A Beads 4F F产品说明书对血清 IgG进行纯化，收集流出液、洗脱液、洗杂液，进行 SDS-PAGE鉴定。
1.10 HRP酶标抗体的制备
家常千层饼参照LinKine™辣根过氧化物酶偶联试剂盒说 明书对纯化后的IgG进行标记，以1 : 3的比例加入 抗体和 HRP labeling溶液，加入 7.5 pL 的Activated HRP溶液，加入去离子水至100 m L，室温避光反应 2 h，再加人15 m L quencher溶液即可制备完成，与 50%甘油混合后置于_20°C保存。
1.11酶标抗体效价的测定
根据最适包被浓度包被重组蛋白，将未免疫小 鼠血清和酶标抗体分别以1 : 50起始做2倍比稀
第1期骆琛等：大熊猫I g G F c H R P酶标二抗的制备55
释，每孔3个重复，ELISA反应结束后，测定酶标抗 体和未免疫小鼠血清各孔的D450值P和N，根据P//V 值计算酶标抗体的效价。
2结果
2.1重组蛋白的大量表达及纯化
将重组菌在37 °C、IPTG浓度为0.5 mmol/L的条件下，诱导表达5 h。将诱导表达后的重组菌超声 破碎，对沉淀和上清进行可溶性分析，重组蛋白主 要表达于上清中（见图1)。利用Dextrin Beads 6FF 纯化上清蛋白，获得大小约为88 k u的目的条带（见 图2)。
图1重组蛋白的可溶性分析
Figure 1Solubility analysis of recombinant protein
M：蛋白分子质量标准；1:B L21诱导后产物；2：重组菌诱导产物上清；3：重组菌诱导产物沉淀。
M：Protein molecular weight Marker ；1：B L21 induced products ；2 ：Supernatant of the recomb
inant bacteria induced products ；3 ：Precipitate of the recombinant bacteria induced products.2.2最佳包被浓度的确定
将重组蛋白、大熊猫血清、小鼠血清反应D45〇值 达到最大时的稀释度确定为最佳抗原包被稀释浓 度，分别确定为1 :400、1 : 100和1 : 100。
2.3多克隆抗体效价的测定
反应结束后，免疫小鼠血清与未免疫小鼠血清 〇45〇值的比值尸/~在血清稀释度为1:102 400时仍 大于2.1，表明该多克隆抗体效价可达到1 : 102 400 以上（见图3)。
图3多克隆抗体效价检测
Figure 3 Detection of polyclonal antibody titer
2.4多克隆抗体的稳定性检测
5份免疫小鼠血清和3份未免疫小鼠血清的 ELISA重复性检测结果表明，批内差异为0.95%〜 7.95%，批间差异为1.37%〜12.86%(见表1)，表明 该多克隆抗体检测重复性较好。
88 ku 70 ku
50 ku
图2重组蛋白纯化后SDS-PAGE分析
Figure 2 SDS -PAGE analysis of purified recombinant protein
M：蛋白分子质量标准；1:BL21诱导后产物；2：重组菌诱导产物上清；3：流出液；4：洗杂液；5：洗脱液。
双方代理
M：Protein molecular weight M a r k e r；1：B L21 induced products；2：S upernatant of the recombinant bacteria induced products ；3 ：Effluent ；4 ：Washing liquid ；5 ：Eluent.表1多克隆抗体稳定性检测
Table 1Stability detection of polyclonal antibody
血清样本批内 Intra batch批间 Inter batch Serum samples无土SD C V/%S土SD CV/%
1 1.78 土0.0170.95 1.770 ±0.060 3.37
2 1.75 土0.040 1.76 1.750±0. 061 3.50
3 1.7
4 土0.022 1.24 1.714±0.024 1.37
4 1.70 土0.017 1.00 1.651 ±0.063 3.80
5 1.84 土0.019 1.02 1.782 土0.0774.34 60.30 ±0.0247.950.290±0.017 5.8
6 70.22 士0.0052. 110.243 ±0.0208.0
7 80.30 土0.021 6. 930.280 ±0.04012.86
2.5多克隆抗体的特异性检测
将大熊猫IgG F c免疫小鼠和未免疫小鼠血清 与健康鸡、家兔、猪、
山羊血清以及大熊猫血清反
56
中国兽医科学
第51卷
体与未免疫小鼠血清〇450值的比值P //V 仍大于 2.1，表明血清IgG 被标记了 HRP ，该酶标抗体效价 可达到1 : 25 600以上（见图6)。
50 r
不同动物血清 Different animal rum
图4
多克隆抗体的特异性检测结果
F ig u r e 4
S p e c ific d e te c tio n re s u lts o f p o ly c lo n a l a n tib o d ie s
2.6血清多克隆抗体的纯化
利用rProtain A Beads 4F F 亲和层析法纯化多 克隆抗体，流出液、洗涤液和洗脱液的SDS-PAGE 结果显示，洗脱液电泳出现了两条大小不一的1 g G 重链和轻链条带（见图5)，表明通过纯化获得了多 克隆抗体血清IgG 。
100 ku
75 ku 65 ku
45 ku
35 ku
25 ku
15 ku
家与国图5血清多克隆抗体的纯化
F ig u r e 5
P u r if ic a t io n o f s e r u m p o ly c lo n a l a n tib o d y
白色的鼻毛M ：蛋白分子质量标准；1：洗脱液；2：流出液；3：血清原液；4.洗杂液
M ：Protein molecular weight M a r k e r ； 1 ：Eluent ；2 ：Effluent;3 ：Serum ；4 ： Washing liquid.
2.7酶标抗体效价的检测
当稀释度为1:25 600时，反应结束后，酶标抗
、.
夕j 气夺
|
、、.、、.、、、、.，、.
W
酶标抗体稀释度 Enzymic-laheled antibody dilution
图6
酶标抗体效价检测
F ig u r e 6
D e te c tio n o f e n z y m e -la b e le d a n tib o d y tit e r
3讨论
经我国政府多年的不懈努力，大熊猫保护T .作
取得了长足的进展[M]，但大熊猫疫病的防控不容忽 视。2014年至2015年，陕西省林业科学院珍稀野生 动物救护基地6只大熊猫感染犬瘟热病毒，4只死 亡[15]。对卧龙自然保护区、成都大熊猫繁殖研究基 地和北京动物园的大熊猫进行犬瘟热病毒、犬细小
病毒和犬腺病毒的血清学调查结果显示，未进行疫 苗免疫的部分大熊猫血清抗体呈阳性，存在感染风 险〖叫。
大熊猫基因组大小约为2.4 Gb ，包含2万多个 基因U 7]。大熊猫IgG 具有Ig G l 和IgG 2两个亚类，其 重链分别由IgG 71和丨g G y 2两个基因编码。大熊猫 丨g G 的两个亚类重链基因同源性高达96.9%，且差 异氨基酸主要集中干铰链区和羧基末端™。因此, 基于大熊猫IgG 两个亚类间有较高的同源性，克隆 IgG F c 基因制备抗大熊猫IgG F c 的多克隆抗体与 大熊猫IgG 的两个亚类均能较好的结合。由于血清 中RNA 含量较低、稳定性相对较差，从血清中提取 RNA 后构建原核表达载体存在较大困难。我们在前 人对于大熊猫IgG 研究的基础上，对IgG 71 F c 片段 核酸序列进行大肠杆菌密码子优化后，
合成该核酸 序列后构建pMAL -C 4x -P F c 重组载体。在对不同诱 导条件优化时，我们同时设置25、30、37 °C 不同诱导
应，免疫小鼠血清与大熊猫血清反应的平均〇45…值 大于1.5，与家兔血清反应的平均D «值介于0.5〜 1.0，与山羊、猪、鸡血清反应的结果均小于〇.5(见图 4)。
20 1
■■试验组
=3对照组
o
o
o 4 3 2J n J >5J 班
義
第1期骆琛等：大熊猫丨g G F c H R P酶标二抗的制备57
温度，0.1、0_5、1.0、1.5 mmol/L IPTG不同诱导剂浓 度，1、2、3、4、5、6、7、8 h不同诱导时间的对照组。最
终确定IPTG终浓度为0.5 mmol/L，37 °C诱导表达
5 h为最佳诱导表达条件，实现了对重组蛋内的大
量表达。
由于缺乏针对性的抗体，大熊猫疾病的血清学
检测多依赖中和试验，但该方法诊断需要较长
的时间，对实验设备及人员技术要求较高，不能满
足临床上快速诊断的要求。本研究成功制备出HRP
标记的鼠抗大熊猫IgG F c二抗，可用于包括ELISA、Western-blot在内的多种免疫学检测方法，初步解
决了大熊猫IgG二抗缺乏的现状，对大熊猫相关疾
病血清学检测技术的开发、疫苗免疫效力的评估以
及整体疫病防控水平的提升具有重要意义。
参考文献（References)
[1]刘化雨.大熊猫国家公园体制试点方案获批涉及四川7
市州[EB/OL]. www. sc. gov. cn/ 10462/12771/
2017/8/9/10430252. shtml,2017-08-09/2020-09-08.
LIU Hua-yu. The pilot plan for the Giant Panda
National Park System was approved,involving 7
cities and prefectures in Sichuan [EB/OL]. http：
//www. sc. gov. cn/10462/12771/2017/8/9/10430252.
shtml,2017-08-09/2020-09-08. (in Chine)
为你喝彩作文[2]胡锦矗，胡杰.大熊猫研究与进展[J].西华师范大学学
报（自然科学版），2003(03) :253-257.
HU Jin-chu,HU Jie. The study of gaint pandas and
its progress [J]. Journal of China West Normal Uni
versity (Natural Scie/ices),2003 (03) ：253-257. (in
Chine)
[3]逄博.大熊猫犬冠状病毒动物感染试验及其荧光检测
方法的建立[D].长春：吉林农业大学，2005.
FENG Bo. Animal infection assay and tting-up of
fluorescence antibody detection to cannie coron-
avirus from giant pandas[D]. Changchun：Jilin Agri
culture University,2005(in Chine)
[4]雷燕，颜其贵，张志和，等.大熊猫轮状病毒R T-PCR检
测方法的建立[J].中国兽医科学,2010,40(05):490-493.
LEI Yan,YAN Qi-gui,ZHANG Zhi~he,et al.Establish
ment of RT-PCR for detection of giant panda ro
tavirus [J]. Chine Veterinary Science,2010,40
(05):490-493. (in Chine)
[5]郭玲，杨绍林，张志和，等.犬细小病毒P C R诊断方法的
建立及对大熊猫粪便的检测[J].中国兽医学报，2013,33
(08)：1201-1205.
画册模板
GUO Ling,YANG Sha〇-lin,ZHANG Zhi-he,et al.Estab
货款欠条
lishment of PCR for detection of canine parvovirus
and investigation into giant pandas [J]. Chine
Journal of Veterinary Science,2013,33(08) ：1201-
1205. (in Chine)
[6]王斌.大熊猫病毒性疾病P C R检测方法的建立及流行
病学调查[D].成都：西南民族大学，2013.
WANG Bin. Establishment of PCR methods for detect
ing viral dias in giant panda and the epidemi
ologic investigation [D]. Chengdu ：Southwest Uni
versity for Nationalities,2013. (in Chine)
[7]陈珍容，廖红，郝中香，等.大熊猫轮状病毒荧光定量
R T-PCR检测方法的建立[J].兽类学报，2016,36(04):
445-451.
CHEN Zhen-rong,LIAO Hong,HA0 Zhong-xiang,et ai.
Establishment of fluorescent quantitative RT-PCR
assay for detection of the giant panda rotavirus
[J]. Acta Theriologica Sinica,2016,36(04) ：445-451.
(in Chine)
[8]金伯泉.医学免疫学[M]第6版.北京：人民卫生出版
社，2013.
JIN B〇-quan. Medical Immunology[M ]. 6th ed.Bei-
jing:People’s Medical Publishing Hou,2013. (in
Chine)
[9]王讯.大熊猫I g G测定方法的建立与初步应用[D].成
都：四川农业大学，2005.
WANG Xun. Establishing a method to estimate IgG in
panda and its primary applications [D]. Chengdu：
Sichuan Agricultural University,2005. (in Chi
ne)
[10]张焕容，海泉，王海瑞，等.大熊猫I g G双抗体夹心
E L I S A定量检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，
2011,33(01)：50-53.
ZHANG Huan-rong,HAI Quan,WANG Hai~rui,et ai. De
velopment of double-antibody sandwich ELISA for
quantitative detection of IgG in giant panda [J].
Chine Journal of Preventive Veterinary Medic-
ine,2011,33(01 )：50-53. (in Chine)
[11]邹乐.大肠杆菌重组人源DNA-PKcs截短体蛋白的诱
导表达和纯化的摸索[D].长春：吉林大学，2020.
Z0U Le. Expression and purification of recombi
nant human DNA-PKcs truncated protein in E. coli
[D]. Changchun ：Jilin University,2020. (in Chin
e)
[12]张素玲，吴艽，岳亚男，等.非洲猪瘟病毒MGF505-5R
蛋白表达与纯化[J].河南农业科学，2020,1-14.
ZHANG Su-ling,WU Peng,YUE Ya~nan,et ai. Expres
sion and purification of MGF505-5R protein of
african swine fever virus [J]. Journal of Henan
Agricultural Sciences,2020,1-14. (in Chine) [13]李海，曹蕾，任虎，等.人呼吸道合胞病毒F蛋白在大
肠杆菌中的表达与免疫效果研究[J].病毒学报，2020,
36(04)：634-642.
