影响S A R S ＧC o V Ｇ２疑似感染者检出率的
多因素分析
谢㊀玮１，陈㊀相１，周㊀峰１，赵㊀枰１，周李宁１，曹兴建１，陶国华１，朱春华２，崔一峰３,
何伯圣４，许东升５，朱易华１
(１．南通大学第二附属医院南通市第一人民医院检验科，江苏南通２２６０００;２．海门市疾病预防控制中心，江苏南通２２６１００;３．海安市疾病预防控制中心，江苏南通２２６６００;４．
南通大学第二附属医院南通市第一人民医院影像科，江苏南通２２６０００;５．R y
eB r o o k ,N e w Y o r k ,U S A )D O I :１０．１１７４８/b j m y ．i s s n ．１００６－１７０３．２０２１．０１．０２４收稿日期:２０２０Ｇ０８Ｇ１９；修回日期:２０２０Ｇ１２Ｇ０９
通讯作者：朱易华，博士，主任技师.E Ｇm a i l :４０３７４４８２７＠q q
．c o m 摘要：目的㊀由于轻症和无症状携带者的病毒载量较低以及试剂敏感性的影响，新型冠状病毒(s e v e r ea c u t e r e s p i r a t o r y s y
n d r o m e c o r o n a v i r u s Ｇ２,S A R S ＧC o V Ｇ２)的检测常会出现假阴性.因此分析试剂性能和该群体的病毒分布特征，选择性能较优试剂并优化采样部位十分必要.方法㊀我们收集了新诊断的S A R S ＧC o V Ｇ２感染轻症患者和无症状携带者的咽拭
子㊁血浆㊁尿液和肛拭子样本.分析不同类型样本的病毒载量差异，同时分析试剂性能和样本灭活对检出率的影响.结果早期批号检测试剂的检出率低，重复性差.S S ２试剂检测结果重复性较好(C V ＝１．０１％).随着批号的增加,S S 试剂
(O R F １a b )和Z J 试剂(O R F １a b )检测结果的检出率和重复性有提高的趋势.与未灭活相比,５６ħ灭活１h 未显著降低S A R S ＧC o V Ｇ２病毒完整R N A 含量(３４．３１ʃ３．８０v s ３５．４３ʃ３．９９,t ＝０．６１,P ＝０．５５).不同部位标本分析显示，咽拭子的阳性检出率高于肛拭子(７７．７８％v s ４４．４４％,χ２＝４．２０８,P ＝０．０４０
)，血浆和尿液中未检出病毒核酸.结论㊀在使用新试剂或改变试剂批号前，实验室应进行性能验证，以满足检测要求.对病毒保存液中的样本进行加热灭活处理，不会影响检测结果.建议在轻症患者和与确诊患者有密切接触的疑似人群中，同时采集咽拭子和肛拭子来提高检出率.关键词：新型冠状病毒;㊀检出率;㊀病毒载量;㊀轻症患者;㊀灭活中图分类号:R ３７３．９㊀㊀文献标识码:A
A M u l t i ＧF a c t o rA n a l y s i s t o I m p
r o v e S A R S ＧC o V Ｇ２D e t e c t i o n R a t e i nS u s p
e c t e dP a t i e n t s X I E W e i １,C H E N X i a n g １,Z H O U F e n g １,Z H A OP i n g １,Z H O U L i n i n g １
,
C A O X i n g j i a n １,T A O G u o h u a １,Z H U C h u n h u a ２,C U IY i f e n g ３
,
H EB o s h e n ４,X U D o n g s h e n g ５
,
Z H U Y i h u a １(１．D e p a r t m e n t o fL a b o r a t o r y M e d i c i n e ,N a n t o n g F i r s t P e o p l e ᶄsH o s p i t a l ,t h e S e c o n dA f f i l i a t e dH o s p i t a l o fN a n t o n g U n i v e r s i t y
,N a n t o n g ２２６０００,C h i n a ;２．H a i m e n M u n i c i p a l C e n t e r f o rD i s e a s eC o n t r o l a n dP r e v e n t i o n ,N a n t o n g ２２６１００,C h i n a ;３．H a i a nm u n i c i p a l C e n t
e r f o rD i s e a s eC o n t r o l a n dP r e v e n t i o n ,N a n t o n g ２２６６００,C h i n a ;４．D e p a r t m e n t o fR a d i o l o g y ,N a n t o n g F i r s t P e o p l e ᶄsH o s p i t a l ,t h eS e c o n dA f f i l i a t e dH o s p i t a l o fN a n t o n g U n i v e r s i t y ,N a n t o n g ２２６０００,C h i n a ;５．C B LP a t h ,I n c ,R y
eB r o o k ,N e w Y o r k ,U S A )A b s t r a c t :O b j e c t i v e T h e e a r l y d i a g n o s i sa n di s o l a t i o n o fS A R S ＧC o V Ｇ２i n f e c t i o n sf r o m s u s p
i c i o u s p a t i e n t s i s v e r y i m p o r t a n t ．H o w e v e r ,b e c a u s e o f t h e l i m i t a t i o no f r e a g e n t s e n s i t i v i t y a
n d t h e l o wv i r a l l o a d i n m i l da n da s y m p t o m a t i c p a t i e n t s ,f a l s en e g a t i v e sa r ec o m m o nd u r i n g t
h ei d e n t i f i c a t i o no f p a t h o g e n s ．I t i s n e c e s s a r y t oa n a l y z e r e a g
e n t p e r
f o r m a n c e a n d t h e v i r u s d i s t r i b u t i o n c h a r a c t e r i s t i c s o f t h i s p o p u l a t i o na n dt oo p t i m i z et h es e l e c t i o n p r o c e s so f s a m p l i n
g s
i t e s ．M e t h o d s W ec o l l e c t e dt h r o a t s w a b s ,p l a s m a ,u r i n e ,a n da n a l s w a b s a m p l e s f r o mn e w l y d i a g n o s e dm i l d p a t i e n t s a n da s y m p t o m a t i c c a r r i e r s ．T h ed i f f e r e n c e s i nv i r a l l o a da m o n g t h e s ed i f f e r e n t s p e c i m e n sw e r ea n a l y z e dt o g u i d et h e c l i n i c a l o p t i m i z a t i o no f s p e c i m e nc o l l e c t i o n ．T h ee f f e c t s o f r e a g e n t p e r f o r m a n c ea n d s p e c i m e n i n a c t i v a t i o no n d e t e c t i o n r a t ew e r e a l s o a n a l y z e d ．R e s u l t s T h e d e t e c t i o n r a t e a n d r e p e a t a b i l i t y o f r e a g e n t sw e r e l o wi n t h e e a r l y
０
１１L a b e l e d I mm u n o a s s a y
s&C l i n M e d ,J a n ．２０２１,V o l ．２８,N o ．１
s t a g e s ．T e s t r e s u l t sw i t hS S ２r e a g e n t s h o w e da no p t i m a l r e p e a t a b i l i t y (
C V ＝１．０１％)．W i t h t h e i n c r e a s eo f l o t n u m b e r s ,t h e r e p e a t a b i l i t y o f t h e
d e t e c t i o nr e s u l t s o f S S r e a g e n t (O R F １a b )a n dZ J r e a g
e n t (O R F １a b )h a da t e n d e n c y t o i m p r o v e ．I n a c t i v a t i o na t ５６ħ
f o r １h o u r d i dn o t s i
g n i f i c a n t l y r e d u c e t
h ed e t e c t a b l eS A R S ＧC o V Ｇ２t e m p l a t e s c o m p a r e d t ou n Ｇ
i n a c t i v a t e d r e s u l t s (３４．３１ʃ３．８０v s ３５．４３ʃ３．９９,t ＝０．６１,P ＝０．５５)．T h e p o s i t i v e r a t eo f t h r o a t s w a b sw a s h i g h e r t h a n t h a t i na n a l s w a b s (７７．７８％v s ４４．４４％,χ２＝４．２０８,P ＝０．０４０)．T h ev i r u s n u c l e i c a c i dw a sn o t d e t e c t e d i n p l a s m aa n du r i n e ．C o n c l u s i o n B a s e do no u r r e s u l t s
,b e f o r e u s i n g n e wr e a g e n t s o r c h a n g i n g t h eb a t c hn u m b e r s o f r e a g e n t s ,t h e l a b o r a t o r y s
h o u l d p e r f o r m t h e c o r r e s p o n d i n gp e r f o r m a n c ev e r i f i c a t i o nt o m e e t t h e l a b o r a t o r y ᶄs t e s t i n g r e q
u i r e m e n t s ．W i t ht h i s c o m m e r c i a l v i r u s p r e s e r v a t i o n p i p e l i n e ,h e a t Ｇt r e a t e d t h r o a t s w a b s t o i n a c t i v a t e t h e v i r u s i s a n a c c e p t a b l e b i o s a f e t y s t e p i
nd e t e c t i n g S A R S ＧC o V Ｇ２v i r u s e s ．I n m i l d p a t i e n t sa n da s y m p t o m a t i c p o p u l a t i o n w i t hac l o s e c o n t a c to f p a t i e n t s w i t h k n o w n c a s e s ,w h i l e c o l l e c t i n g a i r w a y s p
e c i m e n s ,w es h o u l d a l s o t e s t i n t e s t i n a l s p e c i m e n s t o i m p
r o v e t h ed e t e c t i o nr a t e ．K e y w o r d s :S A R S ＧC o V Ｇ２;㊀D e t e c t i o n r a t e ;㊀V i r u s l o a d ;㊀M i l d p a t i e n t ;㊀I n a c t i v a t i o n ㊀㊀２０２０年２月１１日,
国际病毒分类委员会声明将新型冠状病毒命名为 S A R S ＧC o V Ｇ２ .大多数新型冠状病毒肺炎(c o r o n a v i r u s d i s e a s e １９,C O V I D Ｇ１９
)患者症状轻微或无症状，却可传播病毒[１Ｇ２
].因此，对疑似
S A R S ＧC o V Ｇ２感染者的早期诊断和隔离对控制
C O V I
D Ｇ１９的传播具有重要意义.目前，核酸检测是C O V I D Ｇ１９诊断的金标准.然而,
核酸检测的阳性率仅为３０％~５０％[４Ｇ５
三叶菜].检测试剂的敏感性㊁不规范的采样过程以及病毒载量低等都会造成假阴性.其中核酸扩增试剂盒的性能成为影响核酸检测结果准确性的重要因素.因此，实验室应积极比较分析不同试剂的检测结果，评价各试剂盒的性能，从而选择性能更好的试剂盒进行检测，提高检出率.
㊀㊀为了降低检测人员感染的风险,
国家卫生健康委员会建议，在提取核酸模板前，样本应在５６ħ，灭活３０
m i n [３]
.然而，有报道称，病毒R N A 提取前的高温灭
活过程会显著降低病毒核酸含量[
６
].基于生物安全和提高检出率的双重考虑，我们研究了高温灭活对保
存液中S A R S ＧC o V Ｇ２R N A 检出率的影响.
㊀㊀根据«
新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版)»,S A R S ＧC o V Ｇ２的病毒核酸可在鼻咽拭子㊁痰㊁下呼吸道分泌物㊁
粪便等标本中检测到[３
].因此，我
们收集了无症状和轻度患者不同部位采集的标本
(咽拭子㊁血浆㊁尿液和肛拭子)，分析其中的S A R S Ｇ
C o V Ｇ２病毒载量差异,
尝试为选择标本采集部位提供指导，从而提高S A R S ＧC o V Ｇ２的检出率.
材料和方法
㊀㊀１㊀材料来源
㊀㊀本研究材料均取自本市病毒感染者的样本,
本研究已通过南通市第一人民医院伦理委员会批准
(L L Ｇ２０２０Ｇ０１．０１
)，并因重大传染性疾病研究的属性而免除知情同意.㊀㊀２㊀方法
㊀㊀２．１㊀试剂重复性分析㊀收集了两名患者的阳性咽拭子来评估不同试剂盒的性能.一名患者于
２０２０年２月２２日接受检测为阳性,
另一名患者于２０２０年２月２７日被检出阳性.均为男性，年龄分别为４７岁和５９岁.
㊀㊀２．２㊀高温灭活样本的处理㊀在做好生物安全
防护的情况下，收集了低㊁中㊁高３个不同水平病毒载量患者的样本，分别来自２８岁的女性㊁１７岁的男高中生和５８岁的男性.取患者咽拭子病毒保存液
标本各１m L ,５６ħ灭活１h .
㊀㊀２．３㊀多种类型样本的检测㊀由当地C D C 收集
标本，然后将标本运送到南通第一人民医院P C R 实
验室，该实验室是检测S A R S ＧC o V Ｇ２核酸的指定实
验室.共收集１８例(２个月至６７岁;
男/女比例为２ʒ１)确诊为S A R S ＧC o V Ｇ２感染的患者样本,
其中２例为无症状携带者,１６例为轻症患者.２例无症状携带者由于有与确诊患者的密切接触史，被筛查而
发现感染S A R S ＧC o V Ｇ２；其中轻症患者指表现为低热㊁轻微乏力㊁嗅觉及味觉障碍等，但无肺炎表现的感染者；我们收集初筛阳性后，复检采集的咽拭子㊁血液㊁尿液和肛拭子标本，检测其中的病毒载量.㊀㊀２．４㊀不同试剂的比较㊀在试剂性能分析测试中，我们使用了２家不同公司生产的５种试剂盒.分别为：江苏硕世生物科技股份有限公司的新型冠状病毒(２０１９Ｇn C o V )核酸检测试剂盒双重荧光P C R 法，批号２０２００１０７(S S １)和批号２０２００２０８(S S ２)；以及上海之江生物科技有限公司的新型冠状病毒１
１１标记免疫分析与临床㊀２０２１年１月第２８卷第１期
(２０１９Ｇn C o V)核酸检测试剂盒双重荧光P C R法，批号２０２００１０４(Z J１)；三重荧光P C R法，批号２０２００１０５(Z J２)；荧光P C R方法，批号２０２００３０１(Z J３).根据不同厂家试剂说明书进行运行参数设置㊁质量控制㊁扩增结果分析(见表１),５种试剂的判定结果略有不同.本研究使用的标本类型为咽拭子,５种试剂均适用.本研究仅针对相应批次的试剂.
表１㊀每种试剂的基本操作
试剂靶基因
检出限
(c o p i e s/m L)
样品/总体积
(μL)
扩增
参数
质量控制结果判断
阴性对照阳性对照内标阳性阴性
S S１O R F１a bN１ˑ１０３５/２５反转录５０ħ３０m i n,９５ħ
１０s,５５ħ４０s,４５个循环U N D E T C tɤ３０无C tɤ３５C t＞３８或U N D E T
S S２O R F１a bN１ˑ１０３５/２５反转录５０ħ１０m i n,９７ħ
５s,５８ħ３０s,４５个循环U N D E T C tɤ３０有C tɤ３７C t＞４０或U N D E T
Z J１O R F１a bN１ˑ１０３５/２５反转录４５ħ１０m i n,９５ħ１５
s,５８ħ３０s,４５个循环U N D E T或
C tȡ４５C tɤ３５无
O R F１a b和/或N基因的
C tɤ４３
U N D E T
或C tȡ４３
综合防治
Z J２R d R PNE１ˑ１０３５/２５反转录４５ħ１０m i n,９５ħ
１５s,５８ħ３０s,４５个循环U N D E T或
C tȡ４５C tɤ３５无
(１)C t(R d R P,N,E)ɤ４３
(２)C t(R d R P和N)ɤ４３
(３)C t(R d R P和E)ɤ４３
(４)C t(R d R P)ɤ４３
(１)C t(仅N
或E)ɤ４３
职工董事(２)C t(R d R P,
N,E)ȡ４３
Z J３R d R P,NE１ˑ１０３５/２５反转录４５ħ１０m i n,９５ħ
１５s,５８ħ３０s,４５个循环U N D E T或26个声母
C tȡ４５C tɤ３０有
(１)C t(R d R P,N,E)ɤ４３
(２)C t(R d R P和N)ɤ４３
(３)C t(R d R P和E)ɤ４３
(４)C t(R d R P)ɤ４３
(１)C t(仅N或
E)ɤ４３
桅子(２)C t(R d R P,
N,E)ȡ４３
㊀㊀２．５㊀高温灭活标本的检测㊀有报道标本需在５６ħ下至少孵育４５m i n以上才能灭活[７].我们从三个咽拭子保存液中各取１m L，在５６ħ下灭活１h.然后同时检测灭活和非灭活标本.实验分为３组，每组做３个复孔.检测过程与方法同上.病毒采样管为友康生物科技(北京)有限公司生产(批号:０１２００２０８).
㊀㊀２．６㊀不同类型标本的检测㊀血液标本采集后立即分离血浆，所有标本均保存于４ħ，当天检测.检测S A R SＧC o VＧ２核酸的试剂和仪器由上海之江生物科技有限公司生产，提取试剂批号为２０２００２０１，扩增试剂批号为２０２００３０１.核酸提取采用E X３６００核酸提取仪，核酸扩增用A B I７５００实时荧光定量P C R仪.C t＜４０为阳性,C t＞４３为阴性.４０ɤC tɤ４３时需要重新测试确认.若重复检测为C t＜４０或仍为４０ɤC t＜４３且有明显的峰值，则复测判定为阳性.实时R TＧP C R扩增条件为:４５ħ条件下１０m i n,９５ħ条件下３m i n,９５ħ条件下１５s,５８ħ条件下３０s，共４５个循环.
㊀㊀３㊀统计学处理
㊀㊀运用S P S S１３．０统计软件进行数据分析，计数资料采用例数或百分比表示，连续变量以均数ʃ标准差(xʃs)表示，并进行t检验.分类变量以百分数(％)表示采用χ２检验.通过计算变异系数(C V)比较不同试剂的批内重复性.P＜０．０５被认为差异有统计学意义.
结㊀㊀果
㊀㊀１㊀不同试剂检测性能的比较
茵陈能治结石吗㊀㊀不同试剂对高㊁低浓度核酸样品的检测结果如表２所示.阳性标本中所有试剂检测结果均为阳性.而弱阳性标本批内结果不同，重复性差.在S S１和Z J１试剂的初始批次中，弱阳性标本的重复性和检出率较低.其中，试剂S S１的检出率为６６．６％(４/６)，试剂Z J１的检出率为５０．０％(３/６).在３次重复检测中,Z J１均未检测到S A R SＧC O VＧ２特异性O R F１a b基因,N基因有一次未检测到.第二批试剂S S２和Z J２的结果优于第一批试剂.试剂S S２和Z J２的检出率为１００．０％(６/６).S S２试剂增加了内参，但内参仅存在于阳性对照中是不合理的. Z J３也添加了内参，是除阳性对照外，其余所有测试均有内参的，该试剂是所有标本均检测到目的基因的(６/６,１００．０％).５种试剂检测O R F１a b结果显示,S S２试剂重复性最好,C V值最小(C V＝１．０１％),Z J２试剂变异系数最大(C V＝４．４６％).
２１１L a b e l e d I mm u n o a s s a y s&C l i n M e d,J a n．２０２１,V o l．２８,N o．１
表２㊀不同试剂检测结果
试剂批号靶基因(C t 值)
O R F １a b
N
E
结果O R F １a b C
V (％)S S １
２０２００２２７０８３
U N D E T U N D E T －阴性(－)－
３８．６４０．１－阳性(＋)U N D E T U N D E T
－
阴性(－)
２０２００２２２１４３
３０．２３１．０－阳性(＋)１．８２
２９．７３１．２－阳性(＋)３０．８
３１．９－阳性(＋)S S ２２０２００２２７０８３３６．３３７．０－阳性(＋)１．７７
３７．１３６．４－阳性(＋)３７．６３７．８－阳性(＋)２０２００２２２１４３３０．５３１．２－阳性(＋)１．０１
３０．３３１．０－阳性(＋)２９．９
３１．４－阳性(＋)Z J １２０２００２２７０８３U N D E T
３８．４－
阴性(－)－
U N D E T ３９．１－阴性(－)U N D E T U N D E T
－
阴性(－)
２０２００２２２１４３
３０．４３１．１－阳性(＋)２．７１
３１．７３２．７－阳性(＋)３２．０
３３．５－
阳性(＋)
Z J ２２０２００２２７０８３
３６．４
男的第一次会疼吗３７．１３６．８
阳性(＋)
４．４６
３７．１３８．４３８．１阳性(＋)３９．６３９．７３８．３阳性(＋)
２０２００２２２１４３３０．５３１．５３１．３阳性(＋)１．８３
３０．９３１．１３１．０阳性(＋)
２９．８
３１．５３０．５阳性(＋)
Z J ３２０２００２２７０８３
３６．４
３６．９３８．５
阳性(＋)
２．３１
３６．１３７．３３９．０阳性(＋)３７．７３８．２３８．６阳性(＋)
２０２００２２２１４３２９．９３０．０３４．１阳性(＋)１．８１
３１．０３１．７３３．５阳性(＋)
３０．５
３１．２３３．２阳性(＋)
㊀㊀㊀注:－无数据;U N D E T 未检出
㊀㊀２㊀高温灭活对病毒检出率的影响.㊀㊀与未灭活组相比,５６ħ灭活１h 未显著降低
S A R S ＧC o V Ｇ２病毒载量(３４．３１ʃ３．８０v s ３５．４３ʃ
３．９９,t ＝０．６１,P ＝０．５５;
表３，图１)；因此，在检测S A R S ＧC o V Ｇ２病毒时，我们可以将标本５６ħ，灭活３０m i n
，来降低检测人员感染的风险.表３㊀各样本病毒载量
３
１１标记免疫分析与临床㊀２０２１年１月第２８卷第１期
注:A 低浓度未灭活样本;B 低浓度灭活样品;C 中浓度未灭活样品;D 中浓度灭活样品;E 高浓度未灭活样本;F 高浓度灭活样品
图１㊀O R F １a b 基因实时荧光定量R T ＧP C R 扩增图
段落设置在哪㊀㊀３㊀不同类型样本的病毒载量分析
㊀㊀我们收集１８例经病毒核酸检测阳性确诊的新诊断患者的咽拭子㊁血浆㊁尿液和肛拭子，分析了各标本的病毒载量(表４)，病毒载量与C t 值呈负相关.１４份咽拭
子(１４/１８,７７．７８％)和８份肛门拭子(８/１８,４４．４４％)检测出病毒核酸.４例患者咽拭子和肛门拭子均检出病毒核酸(４/１８,２２．２２％)
.咽拭子阳性检出率高于肛拭子(７７．７８％v s ４４．４４％,
χ２
＝４．２０８,P ＝０．０４０).所有无症状患者的标本中，病毒核酸仅在肛门拭子中检测出，腹
泻患者的肛拭子中也检测到病毒核酸，提示肛拭子可能会提高无症状和腹泻患者的检出率.
㊀㊀无症状患者的病毒载量与轻症患者相似,
提示无症状患者与轻度患者的传播潜力相似.这些发现与前期报道一致，并表明样本检测和隔离措施可能
要与S A R S 不同[１,２,５].此外，在１８例患者的血浆
和尿液标本中均未检测到病毒核酸.因此，我们建
４
１１L a b e l e d I mm u n o a s s a y
s&C l i n M e d ,J a n ．２０２１,V o l ．２８,N o ．１
