宫颈癌组织内骨髓来源抑制性细胞频率
与患者预后的关系
蒋欢欢１,２,３,４,５，鲁智敏１,４,５，朱梦婷１,４,５，毕开欢１,
４,５
(１．安徽医科大学第一附属医院妇产科，安徽合肥２３００２２;２．国家卫生健康委配子及生殖道异常研究重点实验室，安徽合肥２３００３２;３．出生人口健康教育部重点实验室，安徽合肥２３００３２;４．
生殖健康与遗传安徽省重点实验室，安徽合肥２３００３２;５．安徽省生命资源保存与人工器官工程技术研究中心，安徽合肥２３００３２
)D O I :１０．１１７４８/b j m y ．i s s n ．１００６－１７０３．２０２１．０５．０２３收稿日期:２０２１Ｇ０１Ｇ１９；修回日期:２０２１Ｇ０３Ｇ１８基金项目：国家自然科学基金(编号:８１７０１４２１)；安徽省自然科学基金(编号:１８０８０８５Q H ２７３
)作者简介：蒋欢欢，女，副教授.
摘要：目的㊀研究宫颈癌患者癌组织与非癌组织中骨髓来源抑制性细胞(M D S C s )和调节性T 细胞(T r e g s )的频率及功能.方法㊀收集宫颈癌患者的宫颈组织标本，分为癌组织和非癌组织两组，使用胰酶消化法处理成单细胞悬液，使用流式细胞仪分析两组之间M D S C s 和T r e g 细胞的频率和功能的差异.结果㊀宫颈癌患者癌组织中单核细胞型(
M o )ＧM D S C s 和T r e g 细胞比例明显高于非癌组织(P ＜０．０１)，且M o ＧM D S C s 的一氧化氮(N O )水平在癌组织中显著升高(P ＜０．０５).此外，在５４０d 的随访中，宫颈癌组织中M o ＧM D S C s 水平升高与无进展生存期呈显著正相关(P ＝０．０３７２).结论㊀M o ＧM D S C s 和T r e g 细胞在宫颈癌免疫应答中发挥着免疫抑制作用，且宫颈癌组织内高频率的M o ＧM D S C s 对患者的预后产生不利影响.
关键词：宫颈癌;㊀骨髓来源抑制性细胞;㊀流式细胞术;㊀无进展生存期中图分类号:R ７３７．３３㊀㊀文献标识码:A
T h eA s s o c i a t i o nB e t w e e n t h eF r e q u e n c y o fM y e l o i d ＧD e r i v e dS u p p
r e s s o r C e l l s i nC e r v i c a l C a n c e rT i s s u e a n d t h eP r o g
n o s i s o fP a t i e n t s J I A N G H u a n h u a n １,２,３,４,
５,L U Z h i m i n １,４,
５,Z H U M e n g t i n g １,４,
出口单据
５,
B IK a i h u a n １,４,
５
(１．D e p a r t m e n t o fO b s t e t r i c s a n dG y n e c o l o g y ,t h eF i r s tA f f i l i a t e dH o s p i t a l o fA n h u iM e d i c a lU n i v e r s i t y ,H e f e i ２３００２２,C h i n a ;２．N H C K e y L a b o r a t o r y o f S t u d y o nA b n o r m a lG a m e t e s a n dR e p
r o d u c t i v eT r a c t ,H e f e i ２３００３２,C h i n a ;３．K e y L a b o r a t o r y o f P o p u l a t i o nH e a l t hA c r o s sL i f eC y c l e ,M i n i s t r y o fE d u c a t i o no f t h eP e o p l e sR e p
u b l i c o fC h i n a ,H e f e i ２３００３２,C h i n a ;４．A n h u i P r o v i n c eK e y L a b o r a t o r y o fR e p r o d u c t i v eH e a l t ha n dG e n e t i c s ,H e f e i ２３００３２,C h i n a ;５．B i o p r e s e r v a t i o na n dA r t i f i c i a lO r g a n s ,A n h u i P r o v i n c i a l E n g i n e e r i n g R
e s e a r c hC e n t e r ,H e
f e i ２３００３２,C h i n a )A b s t r a c t :O b j e c t i v e T o s t u d y t h e f r e q u e n c y a n d f u n c t i o no fm y e l o i d Ｇd e r i v e d s u p p
r e s s o r c e l l s (MD S C s )a n d r e g u l a t o r y Tc e l l s (T r e g s )i n c a n c e r o u s a n dn o n Ｇc a n c e r o u s t i s s u e s o f p a t i e n t sw i t h c e r v i c a l c a n c e r ．M e t h o d s C e r v i c a l t i s s u es a m p l e s f r o m p a t i e n t sw i t hc e r v i c a l c a n c e rw e r ec o l l e c t e da n dd i v i d e di n t o c a n c e r o u sa n d n o n Ｇc a n c e r o u st i s s u e s ．T r y p s i n d i g e s t i o n w a sa p p l i e df o r p r e p a r a t i o no fs i n g l ec e l l s u s p e n s i o n ．F l o wc y t o m e t r y w a sc o n d u c t e dt oa n a l y z et h ed i f f e r e n c ei nf r e q u e n c y a n df u n c t i o no f MD S C s a n dT r e g s c e l l s b e t w e e n t h e t w o g r o u p s ．R e s u l t s T h e f r e q u e n c i e s o fM o ＧMD S C s a n dT r e g
s c e l l s i nc e r v i c a l c a n c e r t i s s u e sw e r e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t i nn o n Ｇc a n c e r t i s s u e s ,a n d t h eN Ol e v e l o fM o ＧMD S C s i n c a n c e r t i s s u e sw a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t o f n o n Ｇc a n c e r t i s s u e s (P ＜０．０５)．I n a d d i t i o n ,d u r i n g t h e ５４０f o l l o w Ｇu p d a y s ,t h ea c c u m u l a t i o no f M o ＧMD S C s i
nc e r v i c a l c a n c e r t i s s u e w a s p o s i t i v e l y c o r r e l a t e d w i t h p r o g r e s s i o n Ｇf r e e s u r v i v a l o f p a t i e n t s (P ＝０．０３７２)．C o n c l u s i o n M o ＧMD S Cc a n p l a y a p r o m o t i n g r o l e i nt h e i m m u n e r e s p o n s eo f c e r v i c a l c a n c e ra n da c c e l e r a t e s t h e ２
２８L a b e l e d I mm u n o a s s a y s&C l i n M e d ,M a y
．２０２１,V o l ．２８,N o ．５
d e v e l o p m e n t o f t u m o r．I na d d i t i o n,M oＧMD S C h a sa na d v e r s ee f f e c to nt h e p r o g n o s i so fc e r v i c a l c a n c e r．
K e y w o r d s:C e r v i c a lc a n c e r;㊀M y e l o i dＧd e r i v e ds u p p r e s s o rc e l l s;㊀F l o w c y t o m e t r y;㊀P r o g r e s s i o nＧ
f r e e s u r v i v a l
㊀㊀宫颈癌(c e r v i c a l c a n c e r,C C)起源于子宫上皮内瘤变，由人乳头瘤病毒侵袭宫颈黏膜基底层细胞逐步发展为恶性肿瘤[１Ｇ３].有研究[４Ｇ９]表明，免疫抑制微环境可以逃避机体肿瘤的免疫监视，并促进癌症的发展.骨髓来源的抑制性细胞(m y e l o i dＧd e r i v e d s u p p r e s s o r c e l l s,M
新冠后遗症D S C s)是由不成熟髓系细胞不能完成最终分化而形成的一群异质性细胞，它作为一种免疫抑制细胞在恶性肿瘤的发生发展中起到至关重要的作用[１０Ｇ１１].一氧化氮合酶(i N O S)和精氨酸酶Ｇ１(A R G１)能被M D S C s在肿瘤微环境中诱导表达,A R G１通过分解精氨酸抑制了T细胞的发育，从而会阻碍肿瘤的发展；精氨酸被分解后生成瓜氨酸和一氧化氮(N O)，而N O会抑制C D８＋T细胞的N o t c h信号通路，抑制其肿瘤细胞杀伤毒性[１２Ｇ１３].根据C D１４和C D１５的表达,M D S C s被分为两类：粒细胞型(P MN)ＧM D S C s(C D１４－C D１５＋)和单核细胞型(M o)ＧM D S C s(C D１４＋C D１５－)，有研究表明在人类肿瘤中M oＧM D S C s抑制肿瘤杀伤性T细胞的能力比P MNＧM D S C s更强[１４Ｇ１５].另外也有研究报道调节性T细胞(r e g u l a t o r y Tc e l l s,T r e g)水平的升高也与肿瘤的发展密切相关[１６Ｇ１８].T r e g细胞是一类主要表达F o x P３转录因子的C D４辅助性T细胞，它在宿主自身免疫耐受中发挥着重要作用，有实验证明T r e g细胞免疫缺陷的小鼠存在致命性自身免疫疾病[１７].而在肿瘤组织中T r e g细胞的聚集会导致免疫抑制微环境的形成，且肿瘤患者的临床结局往往与这些T r e g细胞的活动性密切相关[１８].目前关于宫颈癌组织中局部免疫抑制微环境方面的研究尚少，本研究将会探讨M D S C s和T r e g细胞在宫颈癌组织中参与的免疫抑制微环境对肿瘤发生发展的影响.
材料和方法
㊀㊀１㊀样本制备
㊀㊀在２０１８年７月至２０１９年２月期间从安徽医科大学第一附属医院妇产科招募了１０例确诊为原发宫颈癌患者.排除标准包括继发性恶性肿瘤㊁自身免疫性疾病㊁免疫缺陷以及近半年内接受过免疫治疗.在患者全子宫切除手术结束后立即收集宫颈癌组织和非癌组织，使用２．５g/L的胰蛋白酶３７ħ水浴２h,１０００r/m i n离心１０m i n，弃上清液后，沉淀用１００
目细胞滤网过滤，处理成单细胞悬浮液.
问题的英文㊀㊀２㊀流式分析
㊀㊀所有流式抗体购自德国B i o l e g e n d公司，包括: H u C D３３P EＧC y７㊁H u H L AＧD R A P CＧC y７㊁H u C D１１bA P C㊁H uC D１４P e r C PＧC y５．５㊁H uC D１５P E㊁H uC D３F I T C㊁H uC D４P EＧC y７㊁H uC D１２７P e r C PＧC y５．５㊁H uC D２５P E㊁H uF O X P３A l e x a６４７.根据说明书推荐用量，将各抗体加入到装有细胞样本的流式管中,４ħ避光孵育３０m i n.N O荧光探针４,５Ｇ二氨基荧光素二乙酸(D A FＧ２D A)购自美国C e l l T e c h n o l o g y公司，用来测量M D S C S s的N O水平，加入０．５μLD A FＧ２D A到已被抗体孵育过的流式管样本中,４ħ避光孵育３０m i n.所有样本在被荧光抗体染色前使用F c R阻断剂对细胞表面进行封闭处理.使用购自美国B D公司的F A C S V e r s e流式细胞仪收集细胞，获得的流式数据使用F l o w J o_V１０进行分析.
㊀㊀３㊀统计学处理
㊀㊀使用G r a p hP a dP r i s m８．０软件进行统计分析，采用配对样本t检验进行分析，应用K a p l a nＧM e i e r 法分析无进展生存期.P＜０．０５表示差异有统计学意义.
结㊀㊀果
㊀㊀１㊀宫颈癌患者癌组织中M D S C s的频率升高㊀㊀图１为M D S C的流式门控策略,M D S C定义为C D３３＋C D１１b＋H L AＧD R－/l o w细胞,M oＧM D S C为C D１４＋C D１５－M D S C.我们通过分析N O的产生来研究M oＧM D S C的抑制功能.流式结果显示与宫颈非癌组织相比，癌组织中M D S C s(图１B,P＜０．０１)和M oＧM D S C s(图１C,P＜０．０１)的比例均升高，且产生的N O水平更高(图１D,P＜０．０５).
３２８
标记免疫分析与临床㊀２０２１年５月第２８卷第５期
注:A 显示M D S C s 的门控策略,M o ＧM D S C s 定义为C D ３３＋H L A ＧD R －/l o w C D １１b ＋C D １４＋C D １５－细胞,N O 检测分析M o ＧM D S C s 的抑制功能;
B ㊁
C ㊁
D 检测宫颈癌和非癌组织中的M D S C s ㊁M o ＧM D S C s 的频率以及N O 的产生情况.∗P ＜０．０５,∗∗P ＜０．０１
图１㊀人宫颈癌和非癌组织中M D S C s 的流式分析
㊀㊀２㊀T r e g 细胞水平在宫颈癌患者癌组织中升高
㊀㊀检测宫颈癌和非癌组织中T r e g 细胞(
C D ３＋C D ４＋
C D １２７l o w C D ２５＋F O X P ３＋
)的水平，显示T r e g 细胞在宫
颈癌组织中表现出明显的累积(P ＜０．０１
)，见图２
.注:A 显示T r e g 细胞的门控策略,T r e g 细胞定义C
D ３＋C D ４＋C D １２７l o w C D ２５＋F O X P ３＋细胞;B 检测宫颈癌和非癌组织中的T r e g 细胞的频率.∗
∗P ＜０．０１图２㊀人宫颈癌和非瘤组织中T r e g 细胞的流式分析
㊀㊀３㊀M D S C s 与宫颈癌患者预后的关系
㊀㊀以宫颈癌组织中M o ＧM D S C s 频率的均值作为分界限，将患者分为低水平组和高水平组，生存分析结果显示M o ＧM D S C s (＞０．９４％)
和患者无进展生存期呈显著正相关(图２,P ＝０．０３７２
).图３㊀M o ＧM D S C s 和宫颈癌患者无进展生存期的关系
讨㊀㊀论
㊀㊀M D S C s 和T r e g 细胞是重要的免疫抑制细胞,
在肿瘤免疫逃避机制中发挥着关键作用.已有研究证实M D S C s 是一类促进免疫抑制微环境形成的重要细胞，它们可以通过阻碍肿瘤杀伤性T 细胞的增殖，使得肿瘤细胞躲避机体的免疫监视，从而促进肿
瘤的进展[１２
].T r e g 细胞在机体自身免疫耐受中起
到稳态的作用，同样它作为一类免疫抑制细胞在肿
瘤免疫反应中发挥着免疫抑制的作用[
１７
].有研究[１９]
表明在人类肿瘤中M D S C s 可以诱导T r e g 细胞的增殖，从而加强自身免疫抑制能力.此次我们
探究了M D S C s 和T r e g 细胞在宫颈癌病灶中的细胞频率和功能.本研究结果显示宫颈癌患者癌组织中
４
２８L a b e l e d I mm u n o a s s a y s&C l i n M e d ,M a y
．２０２１,V o l ．２８,N o ．５
M oＧM D S C s和T r e g细胞比例显著高于非癌组织，这与其他肿瘤患者免疫抑制细胞频率变化的研究结果相一致[１１,１３].这可能意味着T r e g细胞也可能参与了宫颈癌免疫抑制微环境的形成，在一
定程度上促进了宫颈癌的发展.有报道证实M D S C s可以通过产生一氧化氮(N O)破坏肿瘤杀伤性T细胞表面受体，损害它们清除肿瘤细胞的能力，从而实现机体免疫抑制的功能[１３].因此，我们也通过对N O水平的测定来分析M oＧM D S C s功能的测定，发现N O水平在癌组织中明显升高.这说明M D S C s可以在宫颈癌组织中通过释放N O发挥其免疫抑制的作用.此外，我们对宫颈癌患者进行了生存分析，结果显示，在５４０d的随访中，宫颈癌组织中M oＧM D S C s 水平升高与无进展生存期呈显著正相关.因此我们认为M oＧM D S C s和T r e g细胞在宫颈癌免疫微环境中发挥着免疫抑制作用，且宫颈癌组织中高频率的M oＧM D S C s往往预示着患者的不良预后.
㊀㊀本研究尚存在一些不足之处.首先，我们在宫颈癌病灶处测定的免疫抑制细胞种类较少；其次，对免疫细胞比例和功能测定的方法过于单一.因此，接下来的研究应从机制上对这些免疫抑制细胞进行深入分析.
典型发言
参考文献
[１]H O G Y,B I E R MA N R,B E A R D S L E Y L,e t a l．N a t u r a l h i s t o r y o f c e r v i c o v a g i n a l p a p i l l o m a v i r u s i n f e c t i o n i n y o u n g
w o m e n[J]．NE n g l JM e d,１９９８,３３８(７):４２３Ｇ４２８．[２]WA L B O OM E R SJM,J A C O B S M V,MA N O S M M,e ta l．
H u m a n p a p i l l o m a v i r u s i san e c e s s a r y c a u s eo f i n v a s i v ec e r v i c a l c a n c e rw o r l d w i d e[J]．JP a t h o l,１９９９,１８９(１):１２Ｇ１９．[３]WO O D MA NCB,C O L L I N SSI,Y O U N G L S．T h en a t u r a l h i s t o r y o fc e r v i c a l H P Vi n f e c t i o n:u n r e s o l v e di s s u e s[J]．N a t
R e vC a n c e r,２００７,７(１):１１Ｇ２２．
[４]W A L C HＧRÜC K H E I M B,S T RÖD E R R,T H E O B A L DL,e t a l．
C e r v i c a l c a n c e r i n s t r u c t e d s t r o m a l f i b r o b l a s t s e n h a n c e I L２３e x p r e s s i o n i nd e n d r i t i c c e l l s t o s u p p o r t e x p a n s i o no fT h１７c e l l s[J]．
C a n c e rR e s,２０１９,７９(７):１５７３Ｇ１５８６．
[５]M E Z A C H EL,P A N I C C I A B,N Y I N AWA B E R A A,e t a l．
E n h a n c e d e x p r e s s i o n o f P D L１i n c e r v i c a l i n t r a e p i t h e l i a l n e o p l a s i a a n d c e r v i c a l c a n c e r s[J]．M o dP a t h o l,２０１５,２８(１２):１５９４Ｇ１６０２．
[６]P A H N EＧZ E P P E N F E L D J,S C H RÖE RN,W A L C HＧRÜC K H E I M B,e ta l．C e r v i
c a l c a n c e rc e l lＧd e r i v e d i n t e r l e u k i nＧ６i m p a i r sC C R７Ｇd e p e n d e n tm i g r a t i o no fMM PＧ９Ｇe x p r e s s i n g d e n d r i t i c c e l l s[J]．I n t J
C a n c e r,２０１４,１３４(９):２０６１Ｇ２０７３．
[７]P E D R A Z AＧB R I N D I SE J,SÁN C H E ZＧR E Y E SK,H E R NÁN D E ZＧ
F L O R E SG,e ta l．C u l t u r es u p e r n a t a n t so fc e r v i c a lc a n c e rc e l l s i n d u c e a n M２p h e n o t y p i c p r o f i l e i n T H PＧ１m a c r o p h a g e s[J]．C e l l I m m u n o l,２０１６,３１０:４２Ｇ５２．
[８]P R A T A T T,B O N I N C M,F E R R E I R A A M,e ta l．L o c a l i m m u n o s u p p r e s s i o n i n d u c e d b y h i g h v i r a l l o a d o f h u m a n p a p i l l o m a v i r u s:c h a r a c t e r i z a t i o n o fc e l l u l a r p h e n o t y p e s p r o d u c i n g i n t e r l e u k i nＧ１０i n c e r v i c a l n e o p l a s t i c l e s i o n s[J]．I m m u n o l o g y,２０１５,１４６(１):１１３Ｇ１２１．
[９]D E MO U L I NSA,S OM J AJ,D U R A YA,e t a l．C e r v i c a l(p r e) n e o p l a s t i c m i c r o e n v i r o n m e n t p r o m o t e s t h e e m e r g e n c e o f t o l e r o g e n i c d e n d r i t i c c e l l s v i a R A N K L s e c r e t i o n[J]．O n c o i mm u n o l o g y,２０１５,４(６):e１００８３３４．
[１０]K AWA N O M,MA B U C H IS,MA T S UMO T O Y,e ta l．T h e s i g n i f i c a n c e o fG C S Fe x p r e s s i o n a n dm y e l o i dＧd e r i v e d s u p p r e s s o r c e l l s i nt h ec h e m o r e s i s t a n c eo fu t e r i n ec e r v i c a lc a n c e r[J]．S c i
R e p,２０１５,５:１８２１７．
[１１]L I A N GY,LÜB,Z H A OP,e t a l．I n c r e a s e d c i r c u l a t i n g G r M y e l o i dＧd e r i v e d s u p p r e s s o r c e l l s c o r r e l a t e dw i t h t u m o r b u r d e n a n d s u r v i v a l i n l o c a l l y a d v a n c e d c e r v i c a l c a n c e r p a t i e n t[J]．JC a n c e r,２０１９,１０(６):１３４１Ｇ１３４８．
[１２]V E T S I K AEK,K O U K O SA,K O T S A K I SA,e t a l．M y e l o i dＧd e r i v e d s u p p r e s s o r c e l l s:m a j o r f i g u r e s t h a t s h a p e t h e i mm u n o s u p p r e s s i v e a n d a n g i o g e n i c n e t w o r k i n c a n c e r[J]．C e l l s,２０１９,８(１２):１６４７．
[１３]HO S S A I NF,MA J UM D E R S,U C A R D A,e t a l．N o t c h s i g n a l i n g i n m y e l o i d c e l l s a s a r e g u l a t o r o ft u m o ri mm u n e r e s p o n s e s[J]．F r o n t I mm u n o l,２０１８,９:１２８８．
[１４]B R O N T E V,B R A N D A U S,C H E N,S H,e t a l．R e c o mm e n d a t i o n s f o r m y e l o i dＧd e r i v e d s u p p r e s s o r c e l l n o m e n c l a t u r e a n d c h a r a c t e r i z a t i o n s t a n d a r d s[J]．N a tC o mm u n,２０１６,７:１２１５０．
我的伙伴们[１５]G A B R I L O V I C H DI,O S T R A N DＧR O S E N B E R GS,B R O N T E V．C o o r d i n a t e d r e g u l a t i o no fm y e l o i dc e l l sb y t u m o u r s[J]．N a t R e v I mm u n o l,２０１２,１２(４):２５３Ｇ２６８．
[１６]T A N A K A A,S A K A G U C H IS．R e g u l a t o r y Tc e l l s i nc a n c e r i mm u n o t h e r a p y[J]．C e l lR e s,２０１７,２７(１):１０９Ｇ１１８．
[１７]T O K E RA,O H A S H I P S．E x p r e s s i o n o f c o s t i m u l a t o r y a n d i n h i b i t o r y r e c e p t o r s i nF o x P３＋r e g u l a t o r y Tc e l l sw i t h i n t h e t u m o r
m i c r o e n v i r o n m e n t:i m p l i c a t i o n s f o r c o m b i n a t i o n i m m u n o t h e r a p y a p p r o a c h e s[J]．A d vC a n c e rR e s,２０１９,１４４:１９３Ｇ２６１．
[１８]Y A N G H,Y ES,G O S W A M IS,e t a l．H i g h l y i m m u n o s u p p r e s s i v e如何使用灭火器
别离的笙箫
H L A D R(h i)r e g u l a t o r y T c e l l sa r ea s s o c i a t e d w i t h u n f a v o r a b l e o u t c o m e s
i nc e r v i c a ls q u a m o u sc e l lc a r c i n o m a[J]．I n tJC a n c e r,２０２０,１４６(７):１９９３Ｇ２００６．
手机保护[１９]K A N G X,Z H A N G X,L I U Z,e ta l．G r a n u l o c y t i c m y e l o i dＧd e r i v e ds u p p r e s s o rc e l l s m a i n t a i nf e t oＧm a t e r n a lt o l e r a n c e b y i n d u c i n g F o x p３e x p r e s s i o n i nC D４＋C D２５－Tc e l l sb y a c t i v a t i o n o f t h eT G FＧb e t a/b e t aＧc a t e n i n p a t h w a y[J]．M o lH u m R e p r o d,２０１６,２２(７):４９９Ｇ５１１．
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标记免疫分析与临床㊀２０２１年５月第２８卷第５期
