SSR分析程序—非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
1．准备DNA样品，将浓度调整至40-60ng/μL;
2．PCR扩增体系(反应体系总体积：10μL)
试 剂 μL/tube 终含量
ddH2O 5.15
10 x PCR buffer 1 1x
MgCl(25mM) 0.8 2mM
dNTP(8mM/4个) 1 0.2mM/个
Primers(5μM/2个) 1 250nM/个
Taq 酶(5U/μL) 怀孕可以吃木瓜吗 0.05 0.25U/10μL
模板DNA 1 40-100ng/10μL
(注：SSR的引物包括两个：Forward Primer 和 Rever Primer)
最后每个反应管中加30μL矿物油；此外，操作时，试剂等应放在冰上；
3.PCR扩增 根据引物所要求的结合温度(TM=47℃、50℃、55℃、60℃)选择扩增程序；PCR反应一般需要3hr左右;
① SSR分析中所应用的PCR反应程序(引物结合温度 60℃)
File 15 Time-delay 95℃, 2min
16 Step-cycle 5 cycle(94℃, 1min; 60℃, 1.5min; 72℃, 1min)
17 Step-cycle 30 cycle(92℃, 30c; 60℃, 50c; 72℃, 30c)
18 Time-delay 72℃, 5min
19 Time-delay 25℃, 1min
14 Soak-file 4℃, 24hrs
②SSR分析中所应用的PCR反应程序(引物结合温度 55俞伯牙℃)
File 21 在没有你的日子里 Time-delay 95℃, 2min
22 Step-cycle 5 cycle(94℃, 1min; 55℃, 1.5min; 72℃, 1min)
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23 Step-cycle 30 cycle(92℃, 30c; 55℃, 50c; 72℃, 30c)
24 Time-delay 72℃, 5min
25 Time-delay 25℃, 1min
14 Soak-file 4℃, 24hrs
③ SSR分析中所应用的PCR反应程序(引物结合温度 50℃)
File 26 Time-delay 95℃, 2min
27 Step-cycle 5 cycle(94℃, 1min; 50℃, 1.5min; 72℃, 1min)
28 Step-cycle 30 cycle(92℃, 30c; 50℃, 50c; 72℃, 30c)
29 Time-delay 72℃, 5min
30 Time-delay 25℃, 1min
14 Soak-file 4℃, 24hrs
4聚丙烯酰胺凝胶制备
4.1 清洗玻璃板、灌胶用量筒和烧杯，玻璃板气干(制胶用玻璃板为硫化玻璃，灌胶面必须干净无水分，否则灌胶时容易产生气泡；烧杯、量筒和玻璃板如果有水，由于胶与水不相溶，易使胶不能牢固粘在玻璃板上)；
4.2将平口玻璃板和凹口玻璃板放在桌面的支撑物（瓶盖等）上，给玻璃板滴少量100%乙醇，用质量好的纸均匀擦洗制胶面，气干；
4.3 平口玻璃板和凹口玻璃板的三个边均匀的涂抹适量凡士林（凡士林太多不容易清洗）；放上需要厚度的板条，此步应注意密封好板条的相接处，用手将三边和接茬处按牢
固，否则容易漏胶；然后用夹子（夹子夹在板条中间）将玻璃板固定于灌胶架上；
4.4游武夷 配胶（8%非变性聚丙烯酰胺凝胶，Acr:Bis=37.5:1）、灌胶;
将以下母液按量混合均匀保存于4℃，一般一周内用完，
溶 液 120ml 240ml
40%Acr 24ml 48ml
2%Bis 12.84ml 25.68ml
10XTBE(8.3) 12ml 24ml
ddH2O 70.8ml 141.6ml
针对所选用的胶的大小和厚度量取适量以上混合液倒入干净烧杯，加入适量10%APS（催化剂）和TEMED（加速剂），摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固；（注：1 聚丙烯酰胺凝胶在凝固以前有毒，凝固后无毒，因
此操作时应戴上手套； 2 板条和梳子厚度必须一致，否则将在点样孔中产生胶膜，影响点样和最后电泳质量）
对于20cm x 17cm的玻璃板，除去板条尺寸，胶为16.5cm(宽蒸大虾) x 15.5cm(高) x 1mm(厚)，
配制如下：
胶混合液 10%APS TEMED
一板胶 30ml 180课外书籍μL 80μL
两板胶 60ml 360μL 160μL
5电泳
5.1 在气门芯中放入金属线，弯成凹形，挂在电泳槽上，在气门芯上均匀涂抹适量凡士林，用来防止上槽缓冲液渗入下槽，往上下电泳槽先加入适量1 x TBE 电泳缓冲液，缓冲液可重复使用6-7次；
5.2 胶凝固后，拔去梳子（注意不要将梳齿拔断），取出胶底端的板条，用纸擦净板条上的凡士林，并用板条刮净玻璃板底端内侧的凡士林（防止将玻璃板放入胶槽中的缓冲液时产生气泡），并用水稍微冲洗点样孔处，斜着将玻璃板放入电泳槽，避免胶底端与缓冲液相接处产生气泡，用夹子从上端将玻璃板固定于电泳槽上，再加入缓冲液，使上槽缓冲液至少盖住点样孔，下槽缓冲液至少与胶下边缘相平齐，然后用电泳缓冲液冲洗点样孔；
5.3 向10μLPCR扩增样品中加入2μL的5x Loading dye（ 此步一般可在PCR扩增完成后进行，从而使溶液充分混合），每个样品点10-12μL；最后点Marker DNA;
5.4 恒压或恒流电泳，恒流，1板，50mA-60mA, 电压约300V; 2板，100-120mA, 电压约300-400V；但是应保持电压恒定，否则条带容易弯曲；
注：PCR扩增产物也可以进行琼脂糖凝胶（3%）电泳，用EB染色观察。
6银染显色
6.1 当第一染料接近胶底边缘，电泳结束，也可使第一染料跑出；关闭电泳仪，移去夹子，取下玻璃板，将胶从玻璃板上小心取下，切去一角或两个角作为记号，以便于辨认，
然后开始银染处理，处理均在摇床上进行，具体步骤如下：
10%醋酸(Fix/stop solution) 20分钟
纯水 15分钟
0.2%硝酸银(染液) 30分钟
纯水 10-20秒左右
显影液(Developer solution, 4-10℃) 显影适当
定影液(3%或10%醋酸，加几滴甘油) 5分钟
包胶
注：定影液——将胶在10%的醋酸中处理结束，可向醋酸中加入少许甘油(防止胶在干燥过程中发生胶裂)，摇匀，直接用作定影液；
银染中应注意事项：
① 水的质量对染色效果影响极大，一般用超纯水或双蒸水，如果水含有污染物，胶可能不显影或仅仅显上部条带；而下部空白；
② 显影液中碳酸钠的纯度也很重要，建议使用无水碳酸钠；
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③ 由于温度过高，显影太快，所以为了便于控制显影过程，一般将显影液储存于4℃，用时取出；显影液在4℃长期放置容易结晶，一般使用前1-2天配制即可，显影液配制方法如下：
试剂名称 500ml 1000ml 终浓度
Na2CO3(无水碳酸钠) 50g 100g 100g/L
50mg/ml硫代硫酸钠 80μL 160μL 160μL/L
(Sodium thiosulfate)
甲醛(Formaldehyde) 1ml 2ml 2ml/L
（注：50mg/ml硫代硫酸钠溶液应于-20℃保存）
