细菌纳米纤维素复合抗菌水凝胶敷料的性能研究
张丽;袁海彬;陈琳;洪枫
【摘 要】为了保留细菌纤维素(BNC)独特的纳米三维网络结构,并改善其用于敷料时性能单一的不足,通过旋转浸渍法,将BNC与海藻酸钠(SA)、聚乙烯醇(PVA)复合,再置于硼酸(BA)-氯化钙溶液中浸渍交联,得到力学性能增强、抗菌效果显著、促凝血优异的复合水凝胶敷料.通过场发射电子显微镜、红外光谱、拉力测试、水蒸气透过率、抑菌圈和振荡法抗菌测试、全血凝固时间测定等手段表征了复合抗菌水凝胶的结构和性能.结果表明,SA、PVA与BNC实现了很好的复合,最大断裂拉力比纯BNC提高了3倍,杨氏模量提高了5倍多;复合抗菌水凝胶具有良好的水蒸气透过率,达到751.8±40 g/m2/24h;SA/PVA/BNC水凝胶具有广谱抗菌性能和良好的促凝血效应,在功能性敷料领域应用潜力巨大.
【期刊名称】《纤维素科学与技术》
【年(卷),期】2019(027)002
【总页数】9页(P31-38,58)
【关键词】细菌纤维素;海藻酸钠;聚乙烯醇;硼酸;抗菌敷料
【作 者】张丽;袁海彬;陈琳;洪枫
【作者单位】东华大学化学化工与生物工程学院微生物与工业生物技术研究组,上海 201620;东华大学化学化工与生物工程学院微生物与工业生物技术研究组,上海 201620;东华大学化学化工与生物工程学院微生物与工业生物技术研究组,上海 201620;东华大学化学化工与生物工程学院微生物与工业生物技术研究组,上海 201620
【正文语种】中 文
【中图分类】TB332
皮肤烧创伤护理中最常见的并发症为伤口感染，此过程伴随着大量渗出液，致使多种生长因子和细胞外基质被分解，表皮生长和伤口愈合过程受阻[1]。敷料是临床上广泛使用的一种治疗皮肤创伤的医用材料，能为创口提供一个湿润的环境从而加速伤口的愈合。传统敷料主要包括干纱布、油纱、绷带等，主要由棉纤维织成[2-3]，用于感染性伤口无抗菌效果，渗液管理能力有限，无法促进伤口愈合。细菌纳米纤维素（bacterial nano-cellulo，
BNC）具有独特的天然纳米纤维三维网状结构、超高的持水能力、湿态下优异的力学强度以及良好的生物相容性。BNC作为敷料不仅能为伤口提供湿润的环境，符合目前的湿性疗法理念，而且不粘连伤口，因此具有很好的应用前景[4-5]。
海藻酸钠（sodium alginate，SA）是一种含量丰富的天然生物质多糖[6-7]，为白色或淡黄色粉末。由于SA具有良好的生物相容性，被开发为药物控释载体[8]和组织工程支架[9]，同时由于其良好的促凝血效果和止血性能，SA在敷料领域具有非常成熟的应用。聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）是一种无臭、无味、应用广泛的水溶性高分子聚合物[10]，具有极佳的吸水溶胀性和生物相容性，在生物医用材料领域有良好的应用[11]。通过物理交联的方式制备的 PVA水凝胶敷料，具有很好的弹性，与人体软组织的机械力学性能相近，被广泛用于医用敷料、人工血管和软骨组织工程支架等[12-13]。硼酸（boric acid，BA）是一种有滑腻手感的路易斯酸，为白色粉末状结晶。由于硼酸能够破坏细菌蛋白质的形成，影响丝氨酸蛋白酶、β-内酰胺酶、氨基酰基-tRNA合成酶[14-15]的活性，对多种细菌、霉菌均有抑制作用[16]，3%的硼酸对人体安全无毒，已制成硼酸洗液及相关软膏在临床上广泛使用，可用于小面积伤口。
为了改善纯 BNC敷料应用时功能单一，如无抗菌性和促凝血作用，以及弹性相对较差等不足，本研究拟在不破坏BNC原有三维纳米网络结构及其他优良特性的基础上，以BNC为基底，引入SA良好的生物相容性和促凝血性能，以及PVA良好的力学性能和延展性等特性，并首次将BA作为抗菌剂引入敷料领域。拟通过旋转浸渍法将少量SA和PVA与BNC基底复合后，置于含抗菌剂BA的交联水溶液中，得到一款力学性能增强、抗菌性稳定、促凝血性能明显提升的多功能复合抗菌水凝胶敷料，并对其形貌、红外光谱、力学性能、抗菌性能、促凝血性能进行表征，评价其作为敷料的应用潜能。
1 实验
1.1 材料
酵母浸粉购自OXOID公司，胰蛋白胨、葡萄糖、柠檬酸、海藻酸钠、聚乙烯醇、硼酸、氯化钙、琼脂和氢氧化钠均购自国药集团化学试剂有限公司，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。实验菌株DHU-WX-1为实验室筛选菌种。
1.2 BNC 水凝胶的制备与纯化
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所用培养基为葡萄糖40 g/L、蛋白胨6 g/L、酵母浸粉10 g/L，pH5.0，在121℃灭菌20 min。取活化过的菌种斜面，在无菌操作条件下用接种环挑取两环菌种接入100 mL液体培养基中，放入摇床，在180 r/min和30℃条件下培养。待培养基内长出絮状纤维素后，于超净工作台中，按5%的接种量接入盛有100 mL发酵培养基的切口瓶中，放入恒温培养箱，30℃静态培养10 d。培养结束后，将BNC膜取出，去离子水冲洗后，浸入1% NaOH溶液中于80℃处理4 h，反复多次以除去残存的菌体和培养基，去离子水清洗至中性后121℃灭菌20 min，4℃保存。此时BNC膜为白色半透明凝胶状。深圳学校招聘
1.3 复合抗菌水凝胶的制备
1.3.1 SA/BNC 抗菌水凝胶的制备
配制0.75%的SA水溶液200 mL，3% BA＋1% CaCl2混合水溶液200 mL；将BNC膜放入配制好的SA水溶液中，转移至旋转蒸发仪的茄形瓶中，设置温度50℃，转速60转/分，压力0.03 MPa，旋转浸渍2 h，取出，用去离子水冲洗2～3次，放入3% BA＋1% CaCl2混合水溶液中浸渍2 h，取出用去离子水冲洗至pH＝7，121℃灭菌20 min，4℃保存备用。
1.3.2 PVA/BNC 抗菌水凝胶的制备多宝鱼的做法
配制2.5%的PVA水溶液200 mL，3% BA水溶液200 mL；将BNC膜放入配制好的PVA水溶液中，放入旋转蒸发仪的茄形瓶中，设置温度50℃，转速60转/分，压力0.03 MPa，低压旋转浸渍2 h，取出，用去离子水冲洗2～3次，放入3% BA水溶液中浸渍交联2 h，取出用去离子水冲洗至pH＝7，121℃灭菌20 min，4℃保存备用。
1.3.3 SA/PVA/BNC 抗菌水凝胶的制备
配制0.75% SA＋2.5% PVA混合水溶液200 mL，3% BA＋1% CaCl2混合水溶液200 mL；将BNC膜放入配制好的SA/PVA混合水溶液中，转入旋转蒸发仪的茄形瓶中，设置温度50℃，转速60转/分，压力0.03 MPa，旋转浸渍2 h，取出，用去离子水冲洗2～3次，放入3%BA＋1% CaCl2混合水溶液中浸渍2 h，取出用去离子水冲洗至pH＝7，121℃灭菌20 min，4℃保存备用。
赵云连招1.4 微观结构观察
将处理好的 BNC水凝胶及复合抗菌水凝胶用液氮预冻，放入冷冻干燥机中冻干。喷金镀膜后，用场发射扫描电镜（s4800，日立）观察。
1.5 红外光谱分析带时的诗句
思想小结采用傅立叶红外光谱分析仪（NICOLET iS10，赛默飞世尔科技公司）测试冷冻干燥后样品的红外光谱（FT-IR）。扫描范围 4000～400 cm-1，分辨率为2 cm-1。
1.6 复合抗菌水凝胶的机械力学性能测试
将纯BNC及三种类型的复合抗菌水凝胶剪裁成4 cm×1.5 cm、厚度2 mm的测试样条，将水凝胶两端分别固定在电脑式拉压力试验机（HY-940FS，上海恒驭仪器有限公司）的夹头上，夹距为3 cm，以50 mm/min的速度拉伸水凝胶。每种样品测试3次，取其平均值作为结果。
1.7 水蒸气透过率测试
水蒸气透过率（WVTR）是指在特定湿度和温度下，水分子从皮肤表面通过材料至外部环境的通透性。参考中华人民共和国医药行业标准YY/T0471.2-2004略加修改进行测试[17]。制作一个圆孔直径为1 cm的可密封测试容器，加水至水面与水凝胶样品间的距离为5±1 mm，将水凝胶样品覆盖于测试容器的凹缘上，夹紧样品，避免样品产生形变。24 h后称
量并记录容器、样品和液体的总质量（W1），放入37℃恒温培养箱中，样品向上。72 h后对容器样品和液体重新称量，记录质量（W2），每种样品测试5次，称量时间精确在5 min内，取其平均值。
式中：WT为水蒸气透过率（WVTR，g/m2/24h）；W1为 24 h后的容器、样品和液体的总质量（g）；W2为72 h后称量的容器、样品和液体的总质量（g）；T为实验时间（h），本次时间为48 h。
1.8 抗菌性能测试
1.8.1 抑菌圈定性测试
材料抗菌性的定性检测方法一般为抑菌圈法，根据 GB/T20944.1-2007标准[18]。将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌接种到pH为7.0～7.4的种子培养基（胰蛋白胨1%，氯化钠1%，酵母粉0.5%）中，37℃下恒温培养24 h得到种子液。吸取100 μL种子液加到固体平板培养基（胰蛋白胨1%，氯化钠1%，酵母粉0.5%，琼脂粉2%）上，涂布均匀。将BNC、SA/BNC、PVA/BNC、SA/PVA/BNC等水凝胶样品置于平板培养基上适宜位置，37℃恒温培养24 h，纯BNC为对照组。培养结束后检查样品周围是否有抑菌圈并测量拍照。
1.8.2 振荡共培养法测试
将 BNC与三种复合抗菌水凝胶分别与大肠杆菌菌液和金黄葡萄球菌于 37℃下振荡共培养，转速180 r/min，每隔1 h通过测定菌液的吸光度值来评价材料的抗菌性能。实验过程具体如下：将BNC、SA/BNC、PVA/BNC、SA/PVA/BNC剪裁成面积为1×1 cm2的正方形膜片。制备新鲜的大肠杆菌菌液和金黄葡萄球菌菌液待用。配置液体培养基，培养基成分为：酵母粉0.5 %（w/V），氯化钠1 %（w/V），胰蛋白胨1 %（w/V），pH值大肠杆菌为7.4，金黄色葡萄球菌为7.0；准备50 mL锥形瓶84个，高压灭菌。每个锥形瓶加入20 mL培养基、1 mL菌液和6片同种类型水凝胶，每种类型的水凝胶做3个平行，标记后放入37℃的摇床中培养，转速180 r/min，共培养7 h。每隔1 h取出样品，分别取1 mL上层液体，用紫外分光光度计在600 nm处测定吸光度。
1.9 全血凝固时间测试
使用全血动力学凝血时间法[19]评估BNC、SA/BNC、PVA/BNC和SA/PVA/BNC复合水凝胶的血栓形成性。将500 μLCaCl2水溶液（0.1 M）加入到5 mL SD大鼠的新鲜全血中以激活凝血反应。将活化的血液均匀地滴注在24孔板（每孔50 μL）中的样品上，每隔10 min
向测试样品（n＝3）中加入2.5 mL蒸馏水，温育5 min后测定水溶液的吸光度值，实验时间为60 min。未被血栓反应捕获的红细胞被溶血，从而将血红蛋白释放到水中。使用分光光度计（UV1100，天美科学仪器有限公司）测量545 nm的吸光度值评估溶液中血红蛋白的浓度。心理恐惧
2 结果与讨论
2.1 形貌观察
图1为BNC、SA/BNC、PVA/BNC、SA/PVA/BNC的宏观图和场发射扫描电镜图。从宏观图（Ⅰ～Ⅳ）中可以看出，四种水凝胶外观差别不大；相比纯BNC，SA/BNC、PVA/BNC、SA/PVA/BNC的透明度和柔软度有一定程度的下降，颜色更白。从图A和A1可以看出，BNC水凝胶的内部有清晰可见的三维网络，纤维之间交错穿插，形成了不同直径大小的孔隙状结构；复合SA后，SA与BNC紧密结合，在表面和横断面均匀分布，且保留了BNC的三维网状结构，如图B和B1；复合PVA后，可以看出PVA大量地填充到BNC的孔隙中，且与BNC的结合十分致密均匀，提高了整个水凝胶的致密度，但保留着开放多孔的纳米三维结构（图C和C1）；图D和D1显示同时复合SA及PVA的BNC水凝胶的结构上明显与SA/BN
C和PVA/BNC不同，SA及PVA均稳定地结合并填充在BNC的表面和网络内部，形成具有纳米三维网状的复合抗菌水凝胶。
