y-618230
中文摘要
脑缺血后细胞凋亡与PARP和CaIpain的关系和意义
摘要
目的观察多聚ADP一核糖聚合酶(PARP)与钙依赖性蛋白激酶(Caipain)在脑缺血再灌流损伤中的表达以及凋亡的形态学特征,探讨PARP和Calpaill在细胞凋亡中的作用。方法成年健康雌性Win'tar36只大鼠,应用线栓法建立大脑中动脉闭塞再灌流模型(MCAO)。随机分为假手术组和实验组。用原位TUNEL和原位杂交技术探求脑缺血后细胞凋亡发生的意义和动力学各方面的变化以及PARP和Ca】pain在大鼠脑缺血再灌流不同时间点的表达。
结果缺血再灌流组凋亡细胞主要位于缺血周围区,坏死细胞主要集中于缺血中心区,再灌流2h即出现凋亡细胞,随着再灌流时间的延长逐渐增多,至24h达高峰,2d开始下降,至14(t时仍高于假手术组,各相邻时间点比较差异显著(P<0.05)。缺血中心区凋亡细胞数量较少,其变化规律与缺血周围区相似,除再灌流2h,7d,14d外,其余各时间点无显著性差异(P>o.05)。PARP的表达在脑缺血再灌流2h、6h、12h、2d、3d、7d后神经元数皮质区与假手术组比
较,相差非常显著(P<0.01)。再灌流后2h明显升高,6h达高峰,然后下降14d降至最低点,与假手术组相比也有统计学意义(p<O.05)。纹状体与假手术组比较,再灌流2h、6h、12h、2d、3d、7d相差非常显著(P<0.01)。再灌流后2h己达高峰,然后逐渐下降,14d降至最低点,不过与假手术组相比仍有统计学意义(p<O.05)Calpain的表达在脑缺血1h再灌流2h、6h、12h、2d、3d、7d后神经元数在皮质区与假手术组比较,相差非常显著(P<0.01)。再灌流后2h已达高峰,6h下降,12h又明显升高,然后逐渐下降,14d降至最低点。但14d与假手术组相比,有统计学意义(p<0.05)。纹状体与假手术组比较,相差非常显著(P<0.01).再灌流后2h明显升高,6h反而下降,12h又升高至高峰,然后逐渐下降,14d降至最低点。但14d与假手术组相比,有统计学意义(p<0.05)。
结论脑缺血后细胞凋亡主要位于缺血周围区,PARP与C柚pain在脑缺血细胞凋亡中起重要的作用。PARP与c_柚min抑制剂对缺血性脑损伤的防治具有非常重要的意义。
关键词脑缺血;细胞凋亡:多聚ADP.核糖聚合酶(PARP);钙依赖性蛋白激酶(Calpain)
什么是近义词研究生:李红伟(人体解剖学)
导师:王守彪
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FUNCTONANDRELATIoNBETWEENA_PoPTOSISANDPAR_PoRCALPAINAFTERCEREBRAI.ISCHEM【IA
ABSTRACT
AimThestudyistoexploretheexpressionofpoly(ADP-ribose)polymerase(PARP)andCalpaininfocalcerebralisehemiawithreperfusioninjuryandobservemorphologicalfeaturesofapoptoticcellsandtheroleofPARPandCalpalninapoptosis
Methods36adultfemaleWistarratsweresubjectedtomiddlecerebralarteryocclusion(MCA01anddifferenttimeofreperfusion.RatswererandomlydividedintoMCAOgroupsandshamgroupthatweresame∞oper
ation,butnoMCAO.ToexploretheimplicationandthekineticsofsucheventinapoptosisinducedinsultinducedbyMCAOinsituTUNELtechnic.ToobservetheexpressionofPARPandCalpainatthedifferenttimepointsandthenassessthcirfunctioninapoptosisinducedbyMCAOinsituhybridizationtechnic
ResultsApoptoticcellslieintheboundaryzonetotheischemiccore.ThenumberofapoptoticcellsintheischemicCOreWaslessthanischemicpenumbra(p<0.05)exceptfor2h,7d,14d.SituhybridizationdemonstratedtheevidentexpressionofPARPat2h.ThepeakofPARPwasfirstdetectedat2hinthecorpusstriatumandthencerebralCO^eKat6h.Withincreasinglengthofsurvival,theexpressionofPARPbegantodecrease,thendroppedaverylowlevelat14d.ButtherealedifferencebetweenMCAOgroupandshamcontrol
(p<0.05).SituhybridizationdemonstratedtheevidentexpressionofCalpaininthecerebralcortexandcorpusstriatumat2h.Thestudywasdetectedabimodalpa.ernofCalpainwithaninitialincreaseat2hfollowedbyamoreprominentsecondaryincreaseat12ha氕erreperfmion.After24hCalpainbegan10decrease,thendropped8verylowlevelat14d.ButtherearedifferencebetweenMCAOgroupandshamcontrol(p<0.05).ConclusionApoptosislieintheboundaryzonetotheischemiccore.队FuPandCalpainplayanimportantroleinapoptosis.TheinhibitionofPARPandCalpaincanpreventandcurecerebraliscbemicdamage,
Keywords:cerebralischemia;apoptosis;Poly(ADP-ribose)polymerase(PARP);Calpain
2Postgraduate:L1Hongwei(HumanAnatomy)Directe
dby:WANGSoubiao
第一章前言
脑缺血细胞凋亡与PARP和caIpain的关系和意义
前言
既往关于脑缺血后脑细胞损害的病理生理机制均是从坏死的角度去研究和认识的,近年研究发现脑缺血后细胞死亡的一种新的机制一凋亡。细胞凋亡是有核细胞在一定条件下,通过启动其自身内部机制,主要通过内源性DNA内切酶的激活而发生的细胞自杀性死亡过程。它具有特定的形态学与生化特征,是受基因调控的主动连续的程序化反应【”。最近ChoppM等【2j提出了从细胞DNA损伤与修复水平深层次地研究细胞缺血性凋亡的研究导向多聚ADP一核糖聚合酶(PARP)作为DNA损伤的重要组成部分,在缺氧缺血性脑损伤的分子研究中得到广泛关注。聚腺蕾二磷酸核糖基化作用是在细胞内聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)的催化下,以NAD为底物,对蛋白质(主要是核蛋白)进行翻译后的修饰,从而使聚腺苷二磷酸核糖多聚体共价连接到受体蛋白上去的过程。PARP参与了DNA修复,防止细胞凋亡。PARP与染色质的结构与功能的调节,DNA的修饰、复制、重组与重排、RNA的转录、染色体畸变及生物信息传递等许多重要的生物事件密切相关01。但另有报道,在脑缺血引起细胞凋亡过程中,几乎所有的PARP均裂解成24KD和89KD
的片段。PARP被裂解后,其24KD片段将不容易从DNA链的断口释放出来,冻结了DNA断口,使DNA修复酶不能接近,阻止了DNA的修复,促进细胞凋亡“1。PARP到底是促进细胞凋亡还是抑制细胞凋亡?尚未有确切定论。
脑缺血时,因可引起神经元碎裂和崩溃,以往一直认为Calpain引起的神经元死亡为坏死。但近来研究证明Calpain可导致神经元凋亡。calpain属于半胱氨酸蛋白酶中香木瓜蛋白酶的家族成员,其激活需要细胞内存在一定量的钙离子。caIpain能引起血影蛋白和染色质溶解15j。而脑缺血细胞凋亡时这些结构都有不同程度的发生,而脑组织C咖ain活性的变化尚未见详细报道。
本实验旨在应用原位TUNEL、原位杂交技术,研究PARP和Calpfin在大鼠脑缺血细胞凋亡中的作用及机制,从而为抗脑缺血药物开辟一个新的领域。
第二章材料与方法
材料和方法怎么写植物作文
2.1实验动物
成年健康雌性Wistar大鼠36只,体重200.300克,青岛市药检所提供,清洁级,正常
笼养。将动物分为脑缺血1h再灌流2h、6h、12h、24h、2d、3d、7d、14d组,每组4只。另外4只为假手术组。
2.2实验仪器烤土豆的做法
(1)4-0单股尼龙线的制备:直径O.20ram的4-0尼龙线,一端在火焰上烤出直径O.28ram左右的钝头,分割成5cm长,距钝头22ram处作标记,距钝头5mm处涂硅胶,使其直径为O.30-0,33ram,将其放置于O.5%的肝素中备用。(2)脑立体定位仪:江湾IC型,上海实验仪器厂。
(3)微量移液器:0.5.101.tl、50.20011l。
(4)切片机:LX一75型,德国。
(5)显微镜:LX70型,OLYMPUSOPTICALCo,LTD。
(6)显微摄影装置:PM-CBK—G型,OLYMPUSOPTICALCo,LTD。
2.3药品和试剂
(1)麻醉剂:10%的水合氯醛
(2)固定液:4%多聚甲醛
(3)焦碳酸二乙酯(DEPC),Anleresco进口分装。
(4)PARP原位杂交试剂盒与Calpain原位杂交试剂盒:武汉博士德生物工程有限公司(5)20%甘油缓冲液
(6)3%柠檬酸
2.4实验方法
2.4.1MCAO动物模型的建立
采用Zea-Longa的颈外动脉(ECA)线栓法,经左侧颈外动脉插入4-0尼龙线,经颈总动脉(CCA)分叉处、颈内动脉(ICA)颅外外段进入ICA颅内段到达大脑中动脉(MCA)分支处阻塞MCA的其始部,引起MCA供血区的急性脑缺血。假手术组除尼龙线插不到MCA其始部位外,其余步骤相同。动物苏醒后出现左Homer征,提尾时右前肢内收取屈曲,爬行时向右划圈。有上述体征者为手术成功的标志。
2.4.2标本采集及检测方法
将大鼠深麻醉后,经心脏灌注固定。灌注时先用生理盐水200ml灌流冲洗,使流出液清亮则可,然后灌注4%多聚甲醛固定液200ml,灌注时间大于25min。灌注后迅速置头颅于立体定位仪上,于前囟前2mm到后囟取脑,4%多聚甲醛后固定2h,在蒸馏永中浸泡4h。常规脱水、二甲苯透明、浸蜡、包堙。石蜡切片视连续冠状切片(片厚7um)每隔100um连续取3张,相邻切片分为3套。2套分别用于原位TUNEL测细胞凋亡、原位杂交测定PARP和Calpain的表达及其对照实验。
2.4-=;PARP和Calpain的原位杂交检测
N多题
2
第二章材料与方法
①石蜡切片常规脱蜡至水。3%H202室温处理10min。无酶水洗涤2次
②暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1m13%柠
檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶,混匀),370C消化15min。PBS(加DEPC)洗3次×5min。
③预杂交:按每张切片20ul加预杂交液。恒温箱40oc2h。吸取多余液体,不洗。
毒案
④杂交一按每张切片20ul杂交液,加在切片上。恒温箱400C杂交过夜。
⑤杂交后洗涤:37oC左右水温的2×SSC洗涤5min×2次;0.5×SSC洗涤15min
×1次;0.2×洗涤15min×1次。
⑥滴加封闭液:370C30rain。甩去多余液体,不洗.
⑦滴加生物素化鼠抗地高辛:37oC60min用PBS洗5minx4次。色青五月
⑧滴加SABC:37oC20min。用PBS洗5min×3次。
⑨滴加生物素化过氧化物酶:37oC20min,用PBS洗5minX4次。
⑩DAB显色:使用DAB显色试剂盒一lml蒸馏水加显色剂A、B、c各一滴,混匀,加至标本上。一般显色20—30min。充分水洗。系列酒精脱水、透明、封片。2.4.4细胞凋亡检测
①切片常规脱蜡水化至水。
②新配制3%H202,室温处理10min,蒸馏水洗涤2minX3次。
③标本加TBSl:100新鲜稀释ProteinaseK37℃消化5~10min,TBS洗涤2min
×3次。
④标本片加标记缓冲液,20pl/片,以保持切片湿润。按每张切片取T(1T和
DIG—d-UTP各lul,加入18pl标记缓冲液中,混匀。甩去切片上多余液体后加标记液,20ul/片。置样品于湿盒中,37℃标记2h。
⑨TBS洗2min×3次。
桥之最⑥加封闭液50ul/片,室温30min,甩掉封闭液,不洗。
⑦用封闭活l:100稀释生物素化抗地高辛抗体,50pl/片加至标本片上。置样
品于湿盒中,37℃反应30min。TBS洗2minX3次。
⑧用封闭液1:100稀释SABC:取lml封闭液加SABC10ul,混匀后加至切片。
37℃反应30min。TBS洗5min×4次。
⑨DAB显色:取lml蒸馏水,分别加入DAB试剂盒中A、B、c试剂各一滴,
混匀后加至标本片上,显色30min左右。水洗。
⑩常规脱水,透明,封片。显微镜观察。
结果判定:细胞核中有棕黄色颗粒者为TUNEL阳性细胞,即凋亡细胞。2.4.5神经元密度测定高倍镜下(400X)计数皮质和纹状体的阳性神经元数为神经元密度
2.4.6图象分析::应用VIDAS.21显微图像处理系统测定原位杂交阳性表达的反应产物光密度值(opticaldensity,OD)值
2.4.7用SPSS统计软件对实验结果进行统计学处理。