ｙ－６１８２３０
中文摘要
脑缺血后细胞凋亡与ＰＡＲＰ和ＣａＩｐａｉｎ的关系和意义
摘要
目的观察多聚ＡＤＰ一核糖聚合酶（ＰＡＲＰ）与钙依赖性蛋白激酶（Ｃａｉｐａｉｎ）在脑缺血再灌流损伤中的表达以及凋亡的形态学特征，探讨ＰＡＲＰ和Ｃａｌｐａｉｌｌ在细胞凋亡中的作用。方法成年健康雌性Ｗｉｎ＇ｔａｒ３６只大鼠，应用线栓法建立大脑中动脉闭塞再灌流模型（ＭＣＡＯ）。随机分为假手术组和实验组。用原位ＴＵＮＥＬ和原位杂交技术探求脑缺血后细胞凋亡发生的意义和动力学各方面的变化以及ＰＡＲＰ和Ｃａ】ｐａｉｎ在大鼠脑缺血再灌流不同时间点的表达。
结果缺血再灌流组凋亡细胞主要位于缺血周围区，坏死细胞主要集中于缺血中心区，再灌流２ｈ即出现凋亡细胞，随着再灌流时间的延长逐渐增多，至２４ｈ达高峰，２ｄ开始下降，至１４（ｔ时仍高于假手术组，各相邻时间点比较差异显著（Ｐ＜０．０５）。缺血中心区凋亡细胞数量较少，其变化规律与缺血周围区相似，除再灌流２ｈ，７ｄ，１４ｄ外，其余各时间点无显著性差异（Ｐ＞ｏ．０５）。ＰＡＲＰ的表达在脑缺血再灌流２ｈ、６ｈ、１２ｈ、２ｄ、３ｄ、７ｄ后神经元数皮质区与假手术组比
较，相差非常显著（Ｐ＜０．０１）。再灌流后２ｈ明显升高，６ｈ达高峰，然后下降１４ｄ降至最低点，与假手术组相比也有统计学意义（ｐ＜Ｏ．０５）。纹状体与假手术组比较，再灌流２ｈ、６ｈ、１２ｈ、２ｄ、３ｄ、７ｄ相差非常显著（Ｐ＜０．０１）。再灌流后２ｈ己达高峰，然后逐渐下降，１４ｄ降至最低点，不过与假手术组相比仍有统计学意义（ｐ＜Ｏ．０５）Ｃａｌｐａｉｎ的表达在脑缺血１ｈ再灌流２ｈ、６ｈ、１２ｈ、２ｄ、３ｄ、７ｄ后神经元数在皮质区与假手术组比较，相差非常显著（Ｐ＜０．０１）。再灌流后２ｈ已达高峰，６ｈ下降，１２ｈ又明显升高，然后逐渐下降，１４ｄ降至最低点。但１４ｄ与假手术组相比，有统计学意义（ｐ＜０．０５）。纹状体与假手术组比较，相差非常显著（Ｐ＜０．０１）．再灌流后２ｈ明显升高，６ｈ反而下降，１２ｈ又升高至高峰，然后逐渐下降，１４ｄ降至最低点。但１４ｄ与假手术组相比，有统计学意义（ｐ＜０．０５）。
结论脑缺血后细胞凋亡主要位于缺血周围区，ＰＡＲＰ与Ｃ柚ｐａｉｎ在脑缺血细胞凋亡中起重要的作用。ＰＡＲＰ与ｃ＿柚ｍｉｎ抑制剂对缺血性脑损伤的防治具有非常重要的意义。
关键词脑缺血；细胞凋亡：多聚ＡＤＰ．核糖聚合酶（ＰＡＲＰ）；钙依赖性蛋白激酶（Ｃａｌｐａｉｎ）
什么是近义词研究生：李红伟（人体解剖学）
导师：王守彪
产后腰疼是什么原因引起的英文摘要
ＦＵＮＣＴＯＮＡＮＤＲＥＬＡＴＩｏＮＢＥＴＷＥＥＮＡ＿ＰｏＰＴＯＳＩＳＡＮＤＰＡＲ＿ＰｏＲＣＡＬＰＡＩＮＡＦＴＥＲＣＥＲＥＢＲＡＩ．ＩＳＣＨＥＭ【ＩＡ
ＡＢＳＴＲＡＣＴ
ＡｉｍＴｈｅｓｔｕｄｙｉｓｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐｏｌｙ（ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＰＡＲＰ）ａｎｄＣａｌｐａｉｎｉｎｆｏｃａｌｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｅｈｅｍｉａｗｉｔｈｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙａｎｄｏｂｓｅｒｖｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｆｅａｔｕｒｅｓｏｆａｐｏｐｔｏｔｉｃｃｅｌｌｓａｎｄｔｈｅｒｏｌｅｏｆＰＡＲＰａｎｄＣａｌｐａｌｎｉｎａｐｏｐｔｏｓｉｓ
Ｍｅｔｈｏｄｓ３６ａｄｕｌｔｆｅｍａｌｅＷｉｓｔａｒｒａｔｓｗｅｒｅｓｕｂｊｅｃｔｅｄｔｏｍｉｄｄｌｅｃｅｒｅｂｒａｌａｒｔｅｒｙｏｃｃｌｕｓｉｏｎ（ＭＣＡ０１ａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅｏｆｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．ＲａｔｓｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏＭＣＡＯｇｒｏｕｐｓａｎｄｓｈａｍｇｒｏｕｐｔｈａｔｗｅｒｅｓａｍｅ∞ｏｐｅｒ
ａｔｉｏｎ，ｂｕｔｎｏＭＣＡＯ．ＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｋｉｎｅｔｉｃｓｏｆｓｕｃｈｅｖｅｎｔｉｎａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｅｄｉｎｓｕｌｔｉｎｄｕｃｅｄｂｙＭＣＡＯｉｎｓｉｔｕＴＵＮＥＬｔｅｃｈｎｉｃ．ＴｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＡＲＰａｎｄＣａｌｐａｉｎａｔｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅｐｏｉｎｔｓａｎｄｔｈｅｎａｓｓｅｓｓｔｈｃｉｒｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙＭＣＡＯｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｃ
ＲｅｓｕｌｔｓＡｐｏｐｔｏｔｉｃｃｅｌｌｓｌｉｅｉｎｔｈｅｂｏｕｎｄａｒｙｚｏｎｅｔｏｔｈｅｉｓｃｈｅｍｉｃｃｏｒｅ．ＴｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆａｐｏｐｔｏｔｉｃｃｅｌｌｓｉｎｔｈｅｉｓｃｈｅｍｉｃＣＯｒｅＷａｓｌｅｓｓｔｈａｎｉｓｃｈｅｍｉｃｐｅｎｕｍｂｒａ（ｐ＜０．０５）ｅｘｃｅｐｔｆｏｒ２ｈ，７ｄ，１４ｄ．ＳｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈｅｅｖｉｄｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＡＲＰａｔ２ｈ．ＴｈｅｐｅａｋｏｆＰＡＲＰｗａｓｆｉｒｓｔｄｅｔｅｃｔｅｄａｔ２ｈｉｎｔｈｅｃｏｒｐｕｓｓｔｒｉａｔｕｍａｎｄｔｈｅｎｃｅｒｅｂｒａｌＣＯ＾ｅＫａｔ６ｈ．Ｗｉｔｈｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｌｅｎｇｔｈｏｆｓｕｒｖｉｖａｌ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＡＲＰｂｅｇａｎｔｏｄｅｃｒｅａｓｅ，ｔｈｅｎｄｒｏｐｐｅｄａｖｅｒｙｌｏｗｌｅｖｅｌａｔ１４ｄ．ＢｕｔｔｈｅｒｅａｌｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎＭＣＡＯｇｒｏｕｐａｎｄｓｈａｍｃｏｎｔｒｏｌ
（ｐ＜０．０５）．ＳｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈｅｅｖｉｄｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣａｌｐａｉｎｉｎｔｈｅｃｅｒｅｂｒａｌｃｏｒｔｅｘａｎｄｃｏｒｐｕｓｓｔｒｉａｔｕｍａｔ２ｈ．Ｔｈｅｓｔｕｄｙｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄａｂｉｍｏｄａｌｐａ．ｅｒｎｏｆＣａｌｐａｉｎｗｉｔｈａｎｉｎｉｔｉａｌｉｎｃｒｅａｓｅａｔ２ｈｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙａｍｏｒｅｐｒｏｍｉｎｅｎｔｓｅｃｏｎｄａｒｙｉｎｃｒｅａｓｅａｔ１２ｈａ氕ｅｒｒｅｐｅｒｆｍｉｏｎ．Ａｆｔｅｒ２４ｈＣａｌｐａｉｎｂｅｇａｎ１０ｄｅｃｒｅａｓｅ，ｔｈｅｎｄｒｏｐｐｅｄ８ｖｅｒｙｌｏｗｌｅｖｅｌａｔ１４ｄ．ＢｕｔｔｈｅｒｅａｒｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎＭＣＡＯｇｒｏｕｐａｎｄｓｈａｍｃｏｎｔｒｏｌ（ｐ＜０．０５）．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＡｐｏｐｔｏｓｉｓｌｉｅｉｎｔｈｅｂｏｕｎｄａｒｙｚｏｎｅｔｏｔｈｅｉｓｃｈｅｍｉｃｃｏｒｅ．队ＦｕＰａｎｄＣａｌｐａｉｎｐｌａｙａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎａｐｏｐｔｏｓｉｓ．ＴｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＰＡＲＰａｎｄＣａｌｐａｉｎｃａｎｐｒｅｖｅｎｔａｎｄｃｕｒｅｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｂｅｍｉｃｄａｍａｇｅ，
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；Ｐｏｌｙ（ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＰＡＲＰ）；Ｃａｌｐａｉｎ
２Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅ：Ｌ１Ｈｏｎｇｗｅｉ（ＨｕｍａｎＡｎａｔｏｍｙ）Ｄｉｒｅｃｔｅ
ｄｂｙ：ＷＡＮＧＳｏｕｂｉａｏ
第一章前言
脑缺血细胞凋亡与ＰＡＲＰ和ｃａＩｐａｉｎ的关系和意义
前言
既往关于脑缺血后脑细胞损害的病理生理机制均是从坏死的角度去研究和认识的，近年研究发现脑缺血后细胞死亡的一种新的机制一凋亡。细胞凋亡是有核细胞在一定条件下，通过启动其自身内部机制，主要通过内源性ＤＮＡ内切酶的激活而发生的细胞自杀性死亡过程。它具有特定的形态学与生化特征，是受基因调控的主动连续的程序化反应【”。最近ＣｈｏｐｐＭ等【２ｊ提出了从细胞ＤＮＡ损伤与修复水平深层次地研究细胞缺血性凋亡的研究导向多聚ＡＤＰ一核糖聚合酶（ＰＡＲＰ）作为ＤＮＡ损伤的重要组成部分，在缺氧缺血性脑损伤的分子研究中得到广泛关注。聚腺蕾二磷酸核糖基化作用是在细胞内聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（ＰＡＲＰ）的催化下，以ＮＡＤ为底物，对蛋白质（主要是核蛋白）进行翻译后的修饰，从而使聚腺苷二磷酸核糖多聚体共价连接到受体蛋白上去的过程。ＰＡＲＰ参与了ＤＮＡ修复，防止细胞凋亡。ＰＡＲＰ与染色质的结构与功能的调节，ＤＮＡ的修饰、复制、重组与重排、ＲＮＡ的转录、染色体畸变及生物信息传递等许多重要的生物事件密切相关０１。但另有报道，在脑缺血引起细胞凋亡过程中，几乎所有的ＰＡＲＰ均裂解成２４ＫＤ和８９ＫＤ
的片段。ＰＡＲＰ被裂解后，其２４ＫＤ片段将不容易从ＤＮＡ链的断口释放出来，冻结了ＤＮＡ断口，使ＤＮＡ修复酶不能接近，阻止了ＤＮＡ的修复，促进细胞凋亡“１。ＰＡＲＰ到底是促进细胞凋亡还是抑制细胞凋亡？尚未有确切定论。
脑缺血时，因可引起神经元碎裂和崩溃，以往一直认为Ｃａｌｐａｉｎ引起的神经元死亡为坏死。但近来研究证明Ｃａｌｐａｉｎ可导致神经元凋亡。ｃａｌｐａｉｎ属于半胱氨酸蛋白酶中香木瓜蛋白酶的家族成员，其激活需要细胞内存在一定量的钙离子。ｃａＩｐａｉｎ能引起血影蛋白和染色质溶解１５ｊ。而脑缺血细胞凋亡时这些结构都有不同程度的发生，而脑组织Ｃ咖ａｉｎ活性的变化尚未见详细报道。
本实验旨在应用原位ＴＵＮＥＬ、原位杂交技术，研究ＰＡＲＰ和Ｃａｌｐｆｉｎ在大鼠脑缺血细胞凋亡中的作用及机制，从而为抗脑缺血药物开辟一个新的领域。
第二章材料与方法
材料和方法怎么写植物作文
２．１实验动物
成年健康雌性Ｗｉｓｔａｒ大鼠３６只，体重２００．３００克，青岛市药检所提供，清洁级，正常
笼养。将动物分为脑缺血１ｈ再灌流２ｈ、６ｈ、１２ｈ、２４ｈ、２ｄ、３ｄ、７ｄ、１４ｄ组，每组４只。另外４只为假手术组。
２．２实验仪器烤土豆的做法
（１）４－０单股尼龙线的制备：直径Ｏ．２０ｒａｍ的４－０尼龙线，一端在火焰上烤出直径Ｏ．２８ｒａｍ左右的钝头，分割成５ｃｍ长，距钝头２２ｒａｍ处作标记，距钝头５ｍｍ处涂硅胶，使其直径为Ｏ．３０－０，３３ｒａｍ，将其放置于Ｏ．５％的肝素中备用。（２）脑立体定位仪：江湾ＩＣ型，上海实验仪器厂。
（３）微量移液器：０．５．１０１．ｔｌ、５０．２００１１ｌ。
（４）切片机：ＬＸ一７５型，德国。
（５）显微镜：ＬＸ７０型，ＯＬＹＭＰＵＳＯＰＴＩＣＡＬＣｏ，ＬＴＤ。
（６）显微摄影装置：ＰＭ－ＣＢＫ—Ｇ型，ＯＬＹＭＰＵＳＯＰＴＩＣＡＬＣｏ，ＬＴＤ。
２．３药品和试剂
（１）麻醉剂：１０％的水合氯醛
（２）固定液：４％多聚甲醛
（３）焦碳酸二乙酯（ＤＥＰＣ），Ａｎｌｅｒｅｓｃｏ进口分装。
（４）ＰＡＲＰ原位杂交试剂盒与Ｃａｌｐａｉｎ原位杂交试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司（５）２０％甘油缓冲液
（６）３％柠檬酸
２．４实验方法
２．４．１ＭＣＡＯ动物模型的建立
采用Ｚｅａ－Ｌｏｎｇａ的颈外动脉（ＥＣＡ）线栓法，经左侧颈外动脉插入４－０尼龙线，经颈总动脉（ＣＣＡ）分叉处、颈内动脉（ＩＣＡ）颅外外段进入ＩＣＡ颅内段到达大脑中动脉（ＭＣＡ）分支处阻塞ＭＣＡ的其始部，引起ＭＣＡ供血区的急性脑缺血。假手术组除尼龙线插不到ＭＣＡ其始部位外，其余步骤相同。动物苏醒后出现左Ｈｏｍｅｒ征，提尾时右前肢内收取屈曲，爬行时向右划圈。有上述体征者为手术成功的标志。
２．４．２标本采集及检测方法
将大鼠深麻醉后，经心脏灌注固定。灌注时先用生理盐水２００ｍｌ灌流冲洗，使流出液清亮则可，然后灌注４％多聚甲醛固定液２００ｍｌ，灌注时间大于２５ｍｉｎ。灌注后迅速置头颅于立体定位仪上，于前囟前２ｍｍ到后囟取脑，４％多聚甲醛后固定２ｈ，在蒸馏永中浸泡４ｈ。常规脱水、二甲苯透明、浸蜡、包堙。石蜡切片视连续冠状切片（片厚７ｕｍ）每隔１００ｕｍ连续取３张，相邻切片分为３套。２套分别用于原位ＴＵＮＥＬ测细胞凋亡、原位杂交测定ＰＡＲＰ和Ｃａｌｐａｉｎ的表达及其对照实验。
２．４－＝；ＰＡＲＰ和Ｃａｌｐａｉｎ的原位杂交检测
N多题
２
第二章材料与方法
①石蜡切片常规脱蜡至水。３％Ｈ２０２室温处理１０ｍｉｎ。无酶水洗涤２次
②暴露ｍＲＮＡ核酸片段：切片上滴加３％柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（１ｍ１３％柠
檬酸加２滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），３７０Ｃ消化１５ｍｉｎ。ＰＢＳ（加ＤＥＰＣ）洗３次×５ｍｉｎ。
③预杂交：按每张切片２０ｕｌ加预杂交液。恒温箱４０ｏｃ２ｈ。吸取多余液体，不洗。
毒案
④杂交一按每张切片２０ｕｌ杂交液，加在切片上。恒温箱４００Ｃ杂交过夜。
⑤杂交后洗涤：３７ｏＣ左右水温的２×ＳＳＣ洗涤５ｍｉｎ×２次；０．５×ＳＳＣ洗涤１５ｍｉｎ
×１次；０．２×洗涤１５ｍｉｎ×１次。
⑥滴加封闭液：３７０Ｃ３０ｒａｉｎ。甩去多余液体，不洗．
⑦滴加生物素化鼠抗地高辛：３７ｏＣ６０ｍｉｎ用ＰＢＳ洗５ｍｉｎｘ４次。色青五月
⑧滴加ＳＡＢＣ：３７ｏＣ２０ｍｉｎ。用ＰＢＳ洗５ｍｉｎ×３次。
⑨滴加生物素化过氧化物酶：３７ｏＣ２０ｍｉｎ，用ＰＢＳ洗５ｍｉｎＸ４次。
⑩ＤＡＢ显色：使用ＤＡＢ显色试剂盒一ｌｍｌ蒸馏水加显色剂Ａ、Ｂ、ｃ各一滴，混匀，加至标本上。一般显色２０—３０ｍｉｎ。充分水洗。系列酒精脱水、透明、封片。２．４．４细胞凋亡检测
①切片常规脱蜡水化至水。
②新配制３％Ｈ２０２，室温处理１０ｍｉｎ，蒸馏水洗涤２ｍｉｎＸ３次。
③标本加ＴＢＳｌ：１００新鲜稀释ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ３７℃消化５～１０ｍｉｎ，ＴＢＳ洗涤２ｍｉｎ
×３次。
④标本片加标记缓冲液，２０ｐｌ／片，以保持切片湿润。按每张切片取Ｔ（１Ｔ和
ＤＩＧ—ｄ－ＵＴＰ各ｌｕｌ，加入１８ｐｌ标记缓冲液中，混匀。甩去切片上多余液体后加标记液，２０ｕｌ／片。置样品于湿盒中，３７℃标记２ｈ。
⑨ＴＢＳ洗２ｍｉｎ×３次。
桥之最⑥加封闭液５０ｕｌ／片，室温３０ｍｉｎ，甩掉封闭液，不洗。
⑦用封闭活ｌ：１００稀释生物素化抗地高辛抗体，５０ｐｌ／片加至标本片上。置样
品于湿盒中，３７℃反应３０ｍｉｎ。ＴＢＳ洗２ｍｉｎＸ３次。
⑧用封闭液１：１００稀释ＳＡＢＣ：取ｌｍｌ封闭液加ＳＡＢＣ１０ｕｌ，混匀后加至切片。
３７℃反应３０ｍｉｎ。ＴＢＳ洗５ｍｉｎ×４次。
⑨ＤＡＢ显色：取ｌｍｌ蒸馏水，分别加入ＤＡＢ试剂盒中Ａ、Ｂ、ｃ试剂各一滴，
混匀后加至标本片上，显色３０ｍｉｎ左右。水洗。
⑩常规脱水，透明，封片。显微镜观察。
结果判定：细胞核中有棕黄色颗粒者为ＴＵＮＥＬ阳性细胞，即凋亡细胞。２．４．５神经元密度测定高倍镜下（４００Ｘ）计数皮质和纹状体的阳性神经元数为神经元密度
２．４．６图象分析：：应用ＶＩＤＡＳ．２１显微图像处理系统测定原位杂交阳性表达的反应产物光密度值（ｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ，ＯＤ）值
２．４．７用ＳＰＳＳ统计软件对实验结果进行统计学处理。
