PPARα／PGC-1α在阿霉素扩张型心肌病小鼠心肌组织中的表达及作用
王学胜;杨永曜;杨天和;蒋清安
【摘 要】目的：探讨过氧化物酶体增殖物激活受体α（ peroxisome proliferator-activated receptors α，PPARα）及过氧化物酶体增殖物活化受体协同刺激因子1α（ peroxisome proliferator activated receptor coactivator 1 alpha， PGC-1α）在阿霉素（ doxorubicin，DOX）诱导扩张型心肌病小鼠心肌中的变化及其对心肌能量代谢及心功能的影响。方法：选取小鼠40只，分为正常对照组、单纯阿霉素模型组、PPARα抑制剂组和PPARα激动剂组。除正常对照组外，其余小鼠采用阿霉素诱导建立扩张型心肌病模型，检测其中PPARα及PGC-1α蛋白的表达，PPARα抑制剂组和PPARα激动剂组在造模前分别采用PPARα抑制剂及激动剂对小鼠预处理2周，高效液相层析法（ high-perfor-mance liquid chromatography，HPLC）测量线粒体内腺苷酸含量，[3H]-ADP（氚标记二磷酸腺苷）掺入法检测线粒体膜腺苷酸转运体（ adenine nucleotide translocator，ANT）转运活性，并利用超声心动图检测各组心脏结构及心功能。结果：成功建立阿霉素诱导的扩张型心肌病模型， PPARα及PGC-1α蛋白在模型组中表达明显低于正常组（ P＜0.05），线粒体内高
能磷酸盐含量和线粒体转运活性明显降低（P＜0.05），心功能显著下降，血流动力学指标紊乱（P＜0.05）；与模型组比较，PPARα抑制剂预处理2周后，可显著降低PPARα／PGC-1α表达，线粒体内高能磷酸盐含量及线粒体ANT转运活性显著降低（ P＜0.05），心功能恶化；而予PPARα激动剂预处理干预2周，上调PPARα／PGC-1α蛋白表达同时，虽然线粒体内高能磷酸盐含量未发现有显著变化，但其可改善阿霉素心肌病大鼠线粒体ANT转运活性，超声心动图显示对心腔大小及心功能有改善作用（ P＜0.05）。结论：在阿霉素诱导扩张性心肌病中，PPARα／PGC-1α对ANT的活性起重要调控作用，激活PPARα／PGC-1α可减轻阿霉素心肌损伤。%[ ABSTRACT] AIM:To investigate the changes of peroxisome proliferator-activated receptors ( PPAR)α/peroxi-some proliferator activated receptor coactivator 1 alpha ( PGC-1α) in doxorubicin ( DOX) induced dilated cardiomyopathy ( DCM) and its effect on the energy metabolism and myocardial function in mice .METHODS:Forty mice were randomly divided into 4 groups:control group, DOX group, PPARαinhibitor group and PPARαagonist group.The DCM model was established by injection of DOX.The protein levels of PPARα/PGC-1αwere detected.The PPARαinhibitor and PPARαagonist were ud 2 weeks beforeinjection of DOX.The conte
nts of adenine acid and phosphocreatine ( Pcr) in the mito-chondria were measured by high-performance liquid chromatography ( HPLC) .The ANT activity was analyzed by the atrac-tyloside-inhibitor stop technique.The changes of the echocardiography and hemodynamics were also obrved.RESULTS:DOX induced DCM model was successfully established.The protein levels of PPARαand PGC-1αin control group were significantly higher than tho in DOX group (P<0.05).Both of the high-energy phosphate contents and the transport ac-tivity of ANT were decread in DOX group (P<0.05), and the hemodynamic parameters were disordered (P<0.01). Compared with DOX group, PPARαinhibitor pre-treatment significantly reduced the PPARα/PGC-1αexpression.Mean-while, high-energy phosphate contents in the mitochondria and the ANT transport activity of the mitochondria decread, as well as the left ventricular function ( P<0.05) .On the other hand, PPARαagonist significantly incread the expression of PPARαand PGC-1α, and improved the transport activity of ANT.In addition, the hemodynamic parameters were amel-iorated, but the high-energy phosphate contents of the mitochondria did not significantly change.CONCLUSION:PPARα/PGC-1αplays an important role in the regulati
on of ANT transport activity in dilated cardiomyopathy induced by DOX, and the activation of PPARα/PGC-1αhas protective effects on the DCM induced by DOX.
【期刊名称】《中国病理生理杂志》
【年(卷),期】2015(000)007
【总页数】6页(P1160-1165)青春的价值
【关键词】过氧化物酶体增殖物活化受体α;过氧化物酶体增殖物活化受体协同刺激因子1α;阿霉素;扩张性心肌病;能量代谢
【作 者】王学胜;杨永曜;杨天和;蒋清安
【作者单位】铜仁市人民医院心内科，贵州铜仁554300;贵州省人民医院心内科，贵州贵阳550002;贵州省人民医院心内科，贵州贵阳550002;贵州省人民医院心内科，贵州贵阳550002
卡通头【正文语种】中 文
我心中的世外桃源【中图分类】R541.6;R363.2
阿霉素( doxorubicin，DOX)在临床上广泛应用于治疗多种恶性肿瘤，但是因对心肌的毒性作用，大大限制了这一抗肿瘤药物的应用，随其用量的增加而引起的慢性心脏毒性会导致不可逆的心肌损伤，最终导致扩张性心肌病( dilated cardiomyopathy，DCM)及充血性心力衰竭［1］。DCM是国际医学界公认的难题［2］。目前对扩心病中心肌能量代谢变化及调控知之甚少，尤其是过氧化物酶体增殖物激活受体α ( peroxisome proliferator-activated receptors α，PPARα)及过氧化物酶体增殖物活化受体协同刺激因子1α ( peroxisome proliferator-activated receptor coactivator 1 alpha，PGC-1α)对药物性心肌病中能量代谢的转录调控鲜见报道。本研究拟通过阿霉素诱导建立小鼠扩张型心肌病模型，检测小鼠中PPARα及PGC-1α蛋白的表达，探讨其对阿霉素心肌病心力衰竭进程中心肌能量代谢及心衰进程的影响。
1 实验动物
实验动物为FVB/NJ小鼠，共40只，鼠龄为10 ～12周，均由第三军医大学实验动物中心提供，生产合格证号为SCXX(军) 2002-007。
2 主要试剂
PPARα抑制剂GW 6471购自天津彬馨博澳科技发展有限公司; PPARα特异性激活剂Wy 14643购自上海浩然生物技术有限公司;兔抗小鼠PPARα抗体购自Abcam;兔抗小鼠PGC-1α抗体购自CST;其它试剂为化学分析纯。
3 实验方法
3.1 动物分组及模型制备 根据参考文献［3］改良制作阿霉素扩张型心肌病小鼠模型。模型组小鼠腹腔注射生理盐水溶解的阿霉素( 2. 0 mg·kg－1· d－1) 2周，间歇2周后再注射3周共7周，经动态心脏超声监测、静脉血B型脑钠肽( B-type natriuretic peptide，BNP)测定，与正常小鼠作对照，证实制造阿霉素慢性诱导的扩张型心肌病充血性心力衰竭模型成功。在模型建立前，将40只小鼠分为4组:正常对照( control)组、DOX扩心病模型组( DOX组)、PPARα抑制组( PPARα－组)、PPARα激活组( PPARα+组)，每组10只。其中PPARα抑制组采用PPARα抑制剂GW 6471，PPARα激活组采用PPARα激动剂Wy14643。正常对照组小鼠腹腔注射与建模小鼠相同容量( 0. 1 mL)的生理盐水，PPARα抑制组予PPARα抑制剂GW 6471腹腔注射给药，给药浓度为20 mg·kg－1·d－1，PPARα激活组予PPARα特
异性激活剂Wy 14643腹腔注射给药，给药浓度为20 mg·kg－1·d－1，时间均为2周。
3.2 超声心动图检查 剔除左胸前壁鼠毛，在Summit生产的台式麻醉机平台上，用4%异氟烷(以氧气为输送载体)进行吸入诱导麻醉，在小鼠进入外科深麻醉期后，以2%的浓度维持麻醉;使用GE心脏超声仪，将小动物15 MHz高频心脏超声探头放置于左胸前壁，切取满意的左室长轴切面后，在乳头肌水平将M型取样线垂直于左室后壁而获得M型超声心动图，随即获取主动脉流速曲线。选取3个连续心动周期，采用美国超声心动图协会推荐方法进行测量，测量数据包括左室舒张末期内径( end diastolic dimension，EDD)、左室收缩末期内径( end systolic diameter，ESD)、心率( heart rate，HR)、左室舒张末期容积( end diastolic volume，EDV)、左室收缩末期容积( end systolic volume，ESV)，左室收缩功能由左室短轴缩短率( fractional shortening，FS)和左室射血分数( ejection fraction，EF)。HR由主动脉多普勒血流信号测量。FS、EDV、ESV及EF由以下公式计算: FS = ( EDD－ESD) /EDD; EDV =7×EDD3/( 2. 4 + EDD) ; ESV =7×ESD3/( 2. 4 + ESD) ; EF = ( EDV－ESV) / EDV×100%。
3.3 血流动力学参数检测及留取心肌标本 观察期满后，分别将各组大鼠用1%戊巴比妥反电信网络诈骗
钠( 30 mg/ kg)腹腔注射麻醉后，分离右颈动脉插管，应用Powerlab/8sp型8道生理记录仪( Adinstruments Pty)测量心率、平均动脉压( mean artery pressure，MAP)、主动脉收缩压( systolic aortic pressure，SAP)、主动脉舒张压( diastolic aortic pressure，DAP)、左室收缩压( left ventricular systolic pressure，LVSP)、左室舒张末压( left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)和左室压力上升或下降最大速度(±dp/dtmax)。完成压力曲线记录后立即开胸取出心脏，用预冷的生理盐水灌注冲洗至冲洗液无红色。取离梗死处4 mm范围心室心肌冻存于液氮中，用于Western blot及ATP含量测定，其余部分用于线粒体分离。全过程于冰浴中进行。
3.4 Western blot法检测PPARα及PGC-1α蛋白的表达 取各组小鼠的心肌组织，研碎，提取总蛋白，蛋白定量后，取60 μg/well上样，行SDS-PAGE，转膜，分别与相关蛋白I抗孵育，再加对应的II抗孵育，ECL发光液显色，暗室压片，采集图像分析。
3.5 心肌组织腺嘌呤核苷酸的测定 参照Botker等［4］方法进行，色谱条件: Gilson系列高效液相色谱系统，UV检测器，检测波长254 nm，灵敏度0. 01 AUFS。色谱柱为4. 6 nm×250 nm，YWG-ODS C1810 μm;流动相为2 mmol/L PBS( pH = 5. 5)，样本加入量20 μL。采用衡速洗脱，全程20 min，流速1 mL/ min。
3.6 心肌线粒体ANT转运活性的测定 用抑制剂终止法测定ANT转运活性。取制备好的线粒体悬液50 μL分离介质稀释后加入0. 3 μmol/L的［3H］-ADP溶液20 μL，10 s，立即加入3. 2 nmol/L ANT抑制剂ATR 50 μL，迅速混匀终止ANT转运功能。4℃、12 000 r/min离心20 min，弃上清，沉淀以1 mL分离介质溶解清洗后加入8. 8 mol/L H2O2400 μL，置于70℃水浴消化40 min，取200 μL用液体闪烁计数法测放射性活性。对照管在加入［3H］-ADP前先加入苍术苷，用实验管的放射性活性减去对照管放射性活性即为ANT的转运活性，结果以ADP含量( nmol·min－1·g－1)表示。
4 统计学处理
实验所有数据均采用SPSS 17. 0进行计算。计量资料采用均数±标准差( mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法计算。以P＜0. 05为差异有统计学意义。
1 阿霉素诱导扩张性心肌病模型的建立
日本服装通过对FVB/NJ小鼠行DOX腹腔注射慢性中毒诱导( 2 mg·kg－1·d－1)，用药7周，中间间
歇2周，DOX总剂量( 20 mg/kg)，我们成功建立FVB/NJ小鼠扩张型心肌病充血性心力衰竭模型，单纯DOX扩心病模型组死亡率仅2%，各项观察指标包括超声心动图检查、左心室内径测量、心肌病理切片结果等均符合扩张型心肌病的改变;经统计学处理，对比正常组可见，模型组第9周左室EDD、ESD及BNP显著增加，IVS、PWT、FS及EF明显下降，PPARα抑制组死亡率40%，而PPARα激活组死亡率10%，见图1、表1。
2 各组大鼠心肌PPARα及PGC-1α的蛋白表达变化
表格筛选快捷键与正常组比较，DOX模型组、给予PPARα抑制剂组及给予PPARα激动剂组PPARα及PGC-1α蛋白表达明显下降;而相对DOX模型组，PPARα+组的PPARα和PGC-1α蛋白表达明显上调，PPARα－组PPARα和PGC-1α蛋白明显下调，差异显著( P＜0. 05)，见图2。
3 心脏超声检查结果
庆祝用英语怎么说与正常对照组相比，单纯DOX模型组左室EDD 及ESD明显升高( P＜0. 05)，FS及EF均显著降低( P＜0. 05)，PPARα+组与正常对照组比较，虽然EDD、ESD值较大，EF、FS有所下降，但未见明显统计学差异。经统计，PPARα+组EDD、ESD较DOX组显著缩小，而FS
、EF较DOX组明显著升高( P＜0. 05)，PPARα－组心脏超声检查显示EDD和ESD明显高于正常对照组，FS及EF明显低于对照组( P＜0. 05)，见图3、表1。
圆形墨镜4 血流动力学检测结果
