动物源性食品中β-受体激动剂分类及检测方法研究进展
书的成语>九阳售后维修点廖艳华
【期刊名称】《《食品研究与开发》》
【年(卷),期】2019(040)020
【总页数】6页(P213-218)
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【关键词】动物源性食品; β-受体激动剂; 残留; 检测技术; 进展
宇航员的简笔画【作 者】廖艳华
【作者单位】广西壮族自治区疾病预防控制中心 广西南宁530028
【正文语种】中 文拔牙痛吗
β-受体激动剂是一类母核为β-苯乙醇胺结构、具有舒张平滑肌及解除支气管痉挛等作用的药物，在临床上被广泛应用于治疗支气管哮喘。该类药物能结合细胞膜中的β-受体，从而发生
一些列生理效应，减少脂肪沉积，提高瘦肉率[1-2]，导致畜禽肉中该类药物残留严重超标。由于β-兴奋剂作用效应较强，并且在动物体内，特别是在动物肝、肾、肺残留量最高，通过食物链进入人体，会使一些易感人群产生较明显的中毒症状，严重危害人类健康[3-4]。为保证动物性食品卫生安全，我国农业部已明令[5-6]克伦特罗及其盐、沙丁胺醇及其盐、西马特罗及其盐等β-受体激动剂为禁止使用药物，不得在所有动物性食品中检出，并制定了相应的监管制度与检测方法[7-12]。
1 β-受体激动剂种类
β-受体激动剂大多含苯乙醇胺骨架，按苯环取代基不同可分为与胺基、酚羟基、卤素等各种取代基链接；根据胺基上的取代基不同，可分为叔丁基或异丙基类兴奋剂，这有利于β-受体激动剂裂解途径及机理分析、其二级质谱丰富的特征离子碎片信息更有利于目标物的筛查、确证。在国内最常用的有克伦特罗、沙丁胺醇、特布他林等。
β-受体激动剂化学结构见图1。
图1 β-受体激动剂化学结构Fig.1 Molecular structural of β-agonist
β-受体激动剂常见种类及特征基团见表1。
2 β-受体激动剂的检验方法
β-受体激动剂的检测方法包括依据其不同样品基质前处理方法和检测仪器的不同，目前已建立了液相色谱、酶联免疫法、气相色谱串联质谱法（gas chromatography-mass spectrometer，GC/MS）、液相色谱串联质谱法（high performance liquid chromatography-mass spectrometer HPLC-MS/MS），由单组分检测逐渐向多组分同时检测发展，灵敏度也逐步提高。
表1 β-受体激动剂常见种类及特征基团Table 1 Common species and characteristic groupsof β-agonist药物名 R1 R2 R3 R4 R5克伦特罗（Clenbuterol） -Cl -NH2 -Cl -CH3 -CH3沙丁胺醇（Salbuternol） -CH3OH -OH -H -CH3 -CH3福莫特罗（Formoterol） -NHCH0 -OH -H -Himages/BZ_221_1569_1149_1869_1221.png莱克多巴胺（Ractopamine） -H -OH -H -Himages/BZ_221_1579_1257_1858_1333.png马布特罗(Mabuterol) -CF3 -NH2 -Cl -CH3 -CH3班布特罗（Bambuterol） -H -CH3 -CH3images/BZ_221_713_1424_964_1516.pngimages/BZ_221_1246_1421_1504_1517.png
非诺特罗（Fnoterol） -OH -H -OH -Himages/BZ_221_1575_1546_1863_1625.png溴布特罗（Brombuterol） -Br -NH2 -Br -CH3 -CH3奥西那林（Orciprenaline） -OH -H -OH -CH3 -CH3塞曼特罗（Cimaterol） -CN -NH2 -H -CH3 -CH3特布他林（Trbutaline） -OH -H -OH -CH3 -CH3马贲特罗（Mapenterol） -CF3 -NH2 -Cl -CH3 -C2H5
2.1 高效液相色谱法
目前现行有效的国家标准方法GB/T5009.192-2003《动物性食品中克伦特罗残留量的测定》[12]第一法为液相色谱法，此法仅为单个组分克伦特罗的检测，试样剪碎后用高氯酸匀浆，进行超声加热提取后，用异丙醇 ∶乙酸乙酯=40 ∶60（v/v）萃取，有机相浓缩，经弱阳离子交换柱进行分离，用乙醇∶氨=98 ∶2（v/v）溶液洗脱，洗脱液经流动相定容后在高效液相色谱仪上紫外检测器进行测定，外标法定量，检出限为0.5 ug/kg。王烁等[13]建立了超高效液相色谱测定猪组织中4 种β-兴奋剂（奥西那林、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺）的方法，流动相采用乙腈和0.01 mol/L 磷酸二氢钾溶液的梯度洗脱，检测波长为227 nm，外标法定量，4 种兴奋剂的检出限为 0.1 μg/kg～0.4 μg/kg，不同加标水平回收率为61.2%～101.3%，相对标准偏差分别为2.9%～9.2%，此法在分离能力、分析速度及
灵敏度方面都比高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）有较大提高，二极管阵列检测器（photo-diode array，PDA）可以提供 190 nm～400 nm 波长的吸收曲线图，在保留时间定性基础上再结合标准物质与样品中待测物吸收曲线匹配度定性。但高效液相法依然存在灵敏度低、无法同时进行多种兴奋剂的测定等缺点，而且存在较多杂质干扰，给定性确证带来困难，因此在近些年应用得很少。
2.2 免疫分析法
免疫分析法是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合为基础检测各种物质的分析方法，由于免疫法选择性较好，具有前处理简单、灵敏度高等优点，故在快速筛查大批量样品中兽药残留方面有广泛应用，免疫分析法中最常用的是酶免疫分析法和胶体金免疫层析法。
长期目标酶免疫分析法其原理是待测样品中的β-受体激动剂类药物残留与微孔包被的抗原共同竞争特异性抗体。万宇平等[14]应用直接竞争酶联免疫吸附技术，建立了一种快速检测动物组织中β-兴奋剂类药物多残留的方法，并对其技术性能进行了评价。结果表明，该方法的IC50 动范围为0.4 μg/L～0.7 μg/L，对组织样本的检测限为0.5 μg/kg；样本添加回收率为72.9%～103.5%，变异系数为5.8%～14.1%；可用于检测克仑特罗、沙丁胺醇等8 种β-受
体激动剂。张璐琪等[15]用比较了3 种不同公司生产的试剂盒测定3 种β-兴奋剂残留，结果显示盐酸克伦特罗试剂盒和莱克多巴胺试剂盒的检出结果与液质法的符合率较高，均为94%；沙丁胺醇试剂盒和β-兴奋剂试剂盒的符合率一般，分别为76.2%和75%，主要表现在假阳性结果较多。龚倩等[16]建立了快速检测猪肉中克伦特罗、沙丁胺醇、溴布特罗和特布他林4 种β-受体激动剂的光激化学发光纳米均相时间分辨荧光免疫（alpha LISA）分析方法，沙丁胺醇与克伦特罗、溴布特罗和特布他林的交叉反应率分别为143.3%、179.2%和95.6%，检出限为0.03 ng/mL～0.08 ng/mL，在 0.5、10、20 μg/kg 3 个添加水平下，4 种化合物的平均回收率为82.5%～15.9%，相对标准偏差均小于12.0%。
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胶体金免疫层析法是一种利用胶体金颗粒作为标记物简单快速的免疫分析方法[17]。其最关键的是制备出特异性强和纯度高的单克隆抗体，使用原理是将人工合成的抗原先固定于条状纤维层析材料的试纸条上，胶体金标记试剂（抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，样品溶液借助毛细作用在试纸条上移动，待测物与人工合成的抗原竞争结合胶体金标记的抗体，并直接以颜色显示检测结果。目前主要用在液体样品检测中，在肉制品中应用不多，其灵敏度和准确度不及酶联免疫法。
现行有效标准免疫方分析法[18-19]主要是饲料和动物尿液中受体激动剂的酶联免疫试剂盒方法。GB/T 5009.192-2003《动物性食品中克伦特罗残留量的测定》第三法为酶联免疫法。
虽然免疫法操作简单，使用成本不高，在监测检测中能快速测量大批量样品，但免疫学存在交叉反应现象仍然是制约其应用的主要问题，而且受厂家生产试剂质量影响，有可能抗体批次不同，测定结果也会出现差异。另外在同类药物多残留检测方法方面也有其不能所及之处，不能用于国家相关执法仲裁检验。
2.3 色谱质谱联用技术
色谱联用技术即两种或两种以上的分析技术联合应用，以达到更好的分析效果。色谱质谱联用技术一方面具有色谱的分离能力、分析速度和灵敏度，又兼具质谱对化合物的结构的定性能力，因而在检测的选择性和准确度上都有更好表现。色质联用技术是目前分析β-受体激动剂残留的主流方法，包括气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）和液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）。我国现行检验方式依据不同样品基质前处理方法及检测仪器制定，对 GC-MS[10，12]和 HPLC-MS[7，8，9，11]检
测方法做了相关规定和阐述。
受体激动剂的GC/MS 分析与其他分析方法不同主要是样品需衍生化，因为β-受体激动剂属于高沸点、难挥发的极性化合物，不适合直接进行GC 或GCMS 分析。通过衍生化，不仅可以增大试样的挥发性和稳定性，减小样品的极性，还可以达到改善分析效果、提高灵敏度的目的。衍生反应的类型目前文献报道的主要有3 类：第一类为酰化反应，衍生剂通常为七氟乙酰酐、乙酸酐；第二类为甲基硼酸或丁基硼酸化反应，利用β-受体激动剂结构的侧链上有-OH 和-NH-与衍生试剂形成五元环，由于硼的同位素为很强，故其衍生物的质谱峰很有特征性。第三类采用硅烷化反应，衍生剂通常为双三甲基硅基三氟乙酰胺（bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide，BSTFA）+1 %（φ）三甲基氯硅烷（trimethyl chlorosilane，TMCS）衍生，最后一种是最常用的衍生剂。报道的相关文献[20-23]和标准方法[10，12]GC-MS 样品前处理大多都是样品经过酶解或酸解之后，用pH5.2 的乙酸钠缓冲溶液或酸性甲醇或高氯酸溶液提取样品中的兽药残留，经高氯酸沉淀蛋白后，碱性条件下经过乙酸乙酯 ∶异丙醇（60 ∶40，v/v）进一步提取净化、浓缩，在pH5.2 缓冲体系下经固相萃取柱净化，最后衍生经GC-MS 内标法定量测定；刘五一等[24]用气质法测定畜禽肉中4 种β-兴奋剂的前处理新技术进行研究，结果表明直接用5%的高氯酸提取，WCX 阳
离子交换固相萃取小柱效果最佳，检测的4 种兴奋剂在 50 μg/L～1 000 μg/L 的范围具有良好线性，加标回收率在84.32 %～103.15 %之间，RSD 在1.35%～4.78%之间。岳韩笑等[25]采用同位素稀释质谱法，结合HLB-MCX 双柱固相萃取技术，建立了猪肉中克伦特罗、妥布特罗、溴布特罗、沙丁胺醇等4 种β-受体激动剂残留量的气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）检测方法，方法最低检测限为0.13 μg/kg～0.40 μg/kg，最低定量限为0.40 μg/kg～1.27 μg/kg。由于这种方法衍生耗时长，条件不好控制，同时能检测的受体激动剂不是很多，因此方法的使用在逐年减少。
