实验研究-Anosmin-1蛋白通过成纤维生长因子1型受体激活
ERK1/2信号通路增强嗅鞘细胞的迁移
刘路汪瑞粱胡有力
【摘要】目的探究Anosmin-1蛋白对嗅鞘细胞迁移的影响及对成纤维生长因子(FGF)l型受
体和ERK1/2信号通路的影响。方法选择SPF级成年雌性SD大鼠40只，7~10周龄，体重250-
300g。提取大鼠嗅球的嗅鞘细胞并纯化，纯化后细胞培养7d后，采用随机数字表法将所有细胞平
均分为四组：对照组(C组),FGF1型受体激动剂(FGF2)组(F组)，Anosmin-l蛋白组(A组)和
Anosmin-1蛋白+FGF1型受体抑制剂(Su5402)组(S组)。C组为空白对照组，培养液中不加任何药
物处理;F组为阳性对照组，于培养液中加入FGF225ng/ml；A组于培养液中加入Anosmin-1蛋白2
nmol/L；S组于培养液中加入Anosmin-1蛋白2nmo^L和Su540230^mo^L o四组细胞处理24h后，
采用Transwell法检测嗅鞘细胞迁移能力，Western blot法检测嗅鞘细胞磷酸化ERKl/2(p-ERKl/2)
蛋白、磷酸化AKT(p-AKT)蛋白和神经型钙粘连蛋白(N-cadherin)含量，免疫荧光染色法检测N-
cadherin荧光强度。结果纯化后的嗅鞘细胞占总细胞的85.6%。与C组比较,F组和A组迁移至
下室的嗅鞘细胞明显增多(P<0.05),p-ERKl/2蛋白、N-cadherin含量明显升高(P<0.05)。与A组比
较,S组迁移至下室的嗅鞘细胞明显减少(P<0.05),p-ERKl/2蛋白、N-cadherin含量明显降低(P<
0.05)。S组和C组间、F组和A组间迁移至下室的嗅鞘细胞数量、p-ERKl/2蛋白、N-cadherin含量
差异无统计学意义。四组p-AKT蛋白含量差异无统计学意义。结论Anosmin-1蛋白通过FGF1型
受体激活ERK1/2信号通路，从而上调N-cadherin，增强嗅鞘细胞的迁移能力。
得多音字【关键词】Anosmin-1蛋白；嗅鞘细胞；迁移；FGF1型受体；ERKl/2信号通路；神经型钙粘连
蛋白
Anosmin-1protein enhances the migration of olfactory ensheathing cells by fibroblast growth factor
1type receptor activating ERK1/2signaling pathway LIU Lu,WANG Ruiliang,HU Youli.Depart
ment of Anesthesiology,the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing
210029,China
Corresponding author:HU Youli,Email:huyouli@njmu.edu
[Abstract]Objective To investigate the effect and the molecular mechanism of Anosmin-1protein
on the migration of olfactory ensheathing cells and the effect of fibroblast growth factor(FGF)1type recep
tor and ERK1/2signaling pathway.Methods Forty healthy female Sprague-Dawley rats were chon,aged
学生考试7-10weeks，weighing250-300g.The olfactory ensheathing cells from olfactory bulb of rats were extracted，
purified and cultured for7days，After culturing，all cells were equally divided into four groups according
random number table method:control group( group C)，FGF1type receptor agonist(FGF2)treated group
(group F)，Anosmin-1protein treated group(group A)and Anosmin-1protein add to FGF1type receptor
inhibitor(Su5402)treated group(group S).Group C was blank control group，group F was positive control
treated with FGF225ng/ml,group A was treated with Anosmin-1protein2nmol/L,group S was treated
with Anosmin-1protein2nmol/L added to Su540230Rmol/L.The migration ability of olfactory ensheathing
cells was detected by Transwell migration assay.The expression of phosphorylated ERK1/2(p-ERKl/2),
phosphorylated AKT(p-AKT)，and N-cadherin downsteaming of FGF signaling pathway was detected by
Western blot after treatment with Anosmin-1，Su5402and FGF2.Immunofluorescence was ud to reveal the
fluorescence intensity of N-cadherin after treatments of Anosmin-1，Su5402and FGF2.Results The puri
fied olfactory ensheathing cells accounted for85.6%of the total cells.Compared with group C,the
migratory amount of olfactory ensheathing cells of groups F and Awere significantly incread(P<0.05),
DOI：lO.12O89/jca.2O21.O5.O17
基金项目：国家自然科学基金（81571193）
作者单位：210029南京医科大学第一附属医院麻醉科
通信作者：胡有力,Email:huyouli@njmu.edu
the expressions of p-ERK1/2protein and N-cadherin were significantly incread(P<0.05),and the flu
orescence intensity of N-cadherin were significantly incread(P<0.05).Compared with group A,the migratory^amount of olfactory ensheathing cells of group S was significantly decread(P<0.05),the expressions of p-ERK1/2protein and N-cadherin were significantly decread(P<0.05),and the fluorescence intensity of N-cadherin was significantly decread(P<0.05).There was no significantly differences in migratory capacity,expressions of p-ERK1/2protein and N-cadherin,and the fluorescence intensity of N-cadherin between groups C and S，and groups F and A.There was no significant diferences in expression of p-AKT protein in each groups.Conclusion Anosmin-1protein enhances the migratory ability of olfactory ensheathing cells through FGF1type receptor activating ERK1/2signaling pathway and the upregulation of N-cadherin expression.
经营自己
[Key words]Anosmin-1protein；Olfactory ensheathing cell；Migration；FGF1type receptor；ERK1/2signaling pathway；N-cadherin
嗅鞘细胞在体内能够持续促进嗅觉神经元和轴突的再生［1］。利用嗅鞘细胞治疗脊髓损伤已取得了较好的临床效果［2］。嗅鞘细胞的迁移是神经再生和功能恢复的关键步骤，促进嗅鞘细胞迁移和趋化有助于脊髓神经损伤的修复。Anosmin-1蛋白是由KAL1基因所编码，可以激活成纤维生长因子（fibroblast growth factor，FGF）1型受体［3］。本研究通过Anosmin-1蛋白处理嗅鞘细胞，观察其对嗅鞘细胞迁移能力的影响，并探讨其相关分子机制。
材料与方法
实验动物选择SPF级成年雌性SD大鼠40只,7~10周龄，体重250-300g。大鼠均在麻醉下断头处死，本动物实验经南京医科大学动物伦理委员会审核批准（IACUC-2006022）。
原代嗅鞘细胞的纯化和培养SD大鼠断头处死后，依次剪开皮肤、颅骨，暴露嗅球，小心取出嗅球置于预冷的Hank平衡盐溶液当中，使用精细镊仔细剥离嗅球表面的脑膜，分离后嗅球最外层的嗅神经层后剪碎，转移至放有0.25%胰蛋白酶的细胞培养皿中，将培养皿放入细胞培养箱中孵育15min。孵育后用含有10%胎牛血清的完全培养基终止消化，移液器持续吹打多次后过细胞筛处理成单细胞悬液。取细胞悬液，1000r/min离心5min，弃去上清，使用含有10%胎牛血清的完全培养基重悬细胞，按每孔5X106个细胞接种于100mm细胞培养皿培养。由于嗅鞘细胞和成纤维细胞贴壁速率的不同，采用改良差速贴壁法［4］纯化嗅鞘细胞,48h后将未贴壁的细胞收集，用完全培养基重悬接种于六孔板中，根据神经营养因子3对嗅鞘细胞的生长刺激作用明显大于成纤维细胞的原理纯化嗅鞘细胞，于细胞培养基中加入10nmol/L的神经营养因子3，每2天更换一次培养液，共培养7d。采用嗅鞘细胞特定标志物S100进行细胞免疫荧光染色,DAPI进行细胞核定位染色，将S100与DAPI染色的结果融合测定纯化率，纯化率＞80%即为纯化有效［5］。
实验分组与处理将纯化和培养后的嗅鞘细胞平均分为四组：对照组（C组）,FGF1型受体激动剂（FG
F2）组（F组）,Anosmin-1蛋白组（A组）, Anosmin-1蛋白+FGF1型受体抑制剂（Su5402）组（S组）。C组为空白对照组，培养液中不加任何药物处理;F组为阳性对照组，于培养液中加入FGF2 25ng/ml;A组于培养液中加入Anosmin-1蛋白2 nmol/L;S组于培养液中加入Anosmin-1蛋白2 nmol/L和Su540230»mol/L，将各组处理后的细胞放入培养箱中孵育24h［6］o
Transwell法将嗅鞘细胞用胰酶消化、重悬，调整细胞密度为2X107个/mL，在Transwell小室上层加入100口细胞悬液，下室加入600口新鲜培养基和处理药物,24h后取出细胞，吸去上室培养基, PBS清洗两次，用棉签擦去上室内膜细胞后使用4%多聚甲醛固定30min，固定后使用PBS再次清洗3次，用0.1%结晶紫染色30min，再次使用PBS清洗后放入烘箱烘干，高倍镜下记录随机5个视野的细胞数取平均值，测定嗅鞘细胞迁移能力。
Western blot法将嗅鞘细胞培养7d后分别加入Anosmin-1蛋白2nmol/L、Anosmin-1蛋白2 nmol/L+su540230»mol/L、FGF225ng/ml继续培养24h,24h后使用含有磷酸酶抑制剂及蛋白酶抑制剂的RIPA溶液提取总蛋白，使用BCA蛋白定量试剂盒定量蛋白浓度。随后将蛋白样品进行SDS-PAGE电泳、转膜,3%牛血清白蛋白室温封闭1h后加入一抗置于4T冰箱内过夜。次日使用TBST清洗3遍，室温孵育二抗1h，孵育完成后继续使用TBST清洗3遍，加入化学发光液上机成像，测定蛋白含量。
细胞免疫荧光染色处理后的四组嗅鞘细胞继续培养24h,24h后取出细胞培养皿用PBS清洗
后加入4%多聚甲醛固定30min,PBS清洗3次，每次15min，加入3%牛血清白蛋白和1%Triton溶液室温下封闭1h，加入N-cadherin抗体（1：200），以及嗅鞘细胞特异性抗体钙结合蛋白（s100,1:200）放入4X冰箱过夜。次日用PBS溶液清洗3遍，分 别加入羊抗鼠488和羊抗兔594荧光二抗（均1：500）室温孵育1h，孵育结束后继续用PBS清洗，后加入DAPI溶液，使用共聚焦显微镜记录随机5个视野并测定四组N-cadherin荧光强度。
统计分析采用ImageJ软件进行数据统计, GraphPad Prism8.0软件进行数据分析处理及制图。组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
结果
嗅鞘细胞的纯化采用细胞免疫荧光染色测得纯化后的嗅鞘细胞占总细胞的85.6%（图1）o
图1经改良差速贴壁法纯化后的嗅鞘细胞荧光图（X200）
嗅鞘细胞的迁移F组和A组嗅鞘细胞的迁移能力强于C组，迁移至下室的细胞数量明显多于C 组（P<0.05）。S组的迁移能力弱于A组，迁移至下室的嗅鞘细胞明显少于A组（P<0.05）。C组和S 组间、F组和A组间迁移能力无明显变化，嗅鞘细胞迁移至下室的细胞数量差异无统计学意义（图2—3）。P-ERK1/2蛋白含量明显低于A组（P<0.05）。C组和S组间、F组和A组间p-ERK1/2蛋白含量差异无统计学意义（图4）。四组p-AKT蛋白含量差异无统计学意义（图5）o
注：与C组比较,a P<0.05；与A组比较,b P<0.05图3四组嗅鞘细胞迁移至下室细胞数的比较（X200）
P-ERK1/2
C组F组A组S组
GAPDH
北京卤煮的做法注：与C组比较,a P<0.05；与A组比较,b P<0.05
图4四组嗅鞘细胞P-ERK1/2蛋白含量的比较
C组F组A组S组
p-AKT60kD
*
媲
衩
眉
-cn
ffl r
s v
d
图2四组嗅鞘细胞迁移染色图（X200）
P-ERK1/2、p-AKT蛋白含量F组和A组P-ERK1/2蛋白含量明显高于C组（P<0.05）,S组
C组F组A组S组图5四组嗅鞘细胞p-AKT
国企有退休工资吗
蛋白含量的比较
N-cadherin的荧光强度和含量F组和A组N-cadherin融合荧光强度强于C组,N-cadherin含量明显高于C组（P<0.05）。S组N-cadherin融合荧光强度弱于A组，N-cadherin含量明显低于A组（P< 0.05）。C组和S组间、F组和A组间N-cadherin融合荧光强度无差异，N-cadherin含量差异无统计学意义。（图6—7）。
注：绿色，抗N-cadherin染色；红色，嗅鞘细胞特性型抗体
S100；蓝色，核染DAPI
图6四组嗅鞘细胞N-cadherin荧光图（X200）
C组F组A组S组
N-cadherin
GAPDH36kD
*
如
fe^
u
-E Q
l{
P E
3-
N
注：与C组比较，a P<0.05；与A组比较,b P<0.05
图7四组嗅鞘细胞N-cadherin含量的比较
讨论
新生婴儿奶粉嗅鞘细胞有组织的迁移可以增强神经轴突的再生，嗅鞘细胞移植在治疗中枢神经系统轴突损伤尤其是脊髓损伤中具有较大的应用前景，目前已取得一定的效果［7］。中枢神经系统损伤的部位可以产生TNF-a，神经营养因子等多种正向调节嗅鞘细胞的迁移的细胞因子冈。本研究采用差速贴壁法纯化大鼠嗅球中提取的嗅鞘细胞，分别使用Anosmin-1蛋白和FGF1型受体激动剂（阳性对照）处理嗅鞘细胞后发现，嗅鞘细胞的迁移能力较空白对照组明显增强,Anosmin-1蛋白和FGF1型受体激动剂处理组间迁移能力的差异无统计学意义；在Anosmin-1蛋白处理嗅鞘细胞的基础上加入FGF1型受体抑制剂后，嗅鞘细胞的迁移能力较Anosmin-1蛋白处理组明显减弱，提示Anosmin-1蛋白通过激活FGF1型受体增强了嗅鞘细胞的迁移能力。而FGF1型受体下游p-ERK1/2蛋白和p-ERK1/2蛋白下游N-cadherin含量的增加，提示Anosmin-1蛋白通过FGF1型受体激活ERK1/2信号通路，从而上调N-cadherin，最终增强了嗅鞘细胞的迁移能力。
Anosmin-1蛋白是一种在嗅球表面的嗅神经层高表达的细胞外基质蛋白，可以促进促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）神经元在嗅球部位的迁移［9］和调节嗅球表面嗅鞘细胞的分化和成熟⑷。嗅球的发育依赖于嗅鞘细胞从外走嗅粘膜迁移到中枢嗅球表面的过程，本课题组前期研究［6］表明，在鸡胚胎中敲降KAL-1基因，嗅鞘细胞到达嗅球表面的数量明显减少，导致嗅球发育障碍，这提示Anosmin-1蛋白可能参与调控嗅鞘细胞的迁移。本研究结果显示,Anosmin-1蛋白可以直接促进嗅鞘细胞的迁移，说明Anosmin-1蛋白在嗅鞘细胞迁移和定位到目标终点（嗅球）的过
程中起到了关键性的作用。这也提示Anosmin-1蛋白可以促进移植的嗅鞘细胞迁移并定位于神经损伤部位，使得Anosmin-1蛋白可以作为新型迁移蛋白分子，辅助嗅鞘细胞移植用于脊髓损伤修复。
本课题组前期研究［10］表明，Anosmin-1蛋白可以提高FGF2/肝素信号复合体对FGF1型受体的亲和力，激活ERK1/2、PI3K/AKT、p38MAPKs等下游信号通路，产生不同的生物学效应。通过激活ERK1/2和p38MAPKs通路参与GnRH神经元和嗅球神经的轴突生长，激活Rac/cdc42通路调节细胞骨架的重排等，表明Anosmin-1蛋白可以通过激活FGF下游特异的信号通路，对不同类型的细胞产生特定的生物学效应［11］。
N-cadherin是神经系统中钙粘蛋白家族的主要成员，通过调节细胞与细胞之间和细胞与细胞外基质之间的黏附，在神经系统内的细胞迁移中发挥着重要作用。N-cadherin可以增加神经嵴细胞、内皮细胞和肿瘤细胞的运动能力，机制可能与其影响肌动蛋白细胞骨架连接强度有关［12］。此外，N-cadherin还可以稳定细胞表面的FGF1型受体，有
助于FGF2/肝素信号复合体与FGF1型受体结合，激活嗅鞘细胞内与细胞迁移相关信号通路[13]。
发育过程中，嗅鞘细胞在早于初级嗅神经轴突迁移至嗅球，并形成嗅鞘细胞胶质通道，指引嗅神经轴突向嗅球部位的迁移，促进嗅神经轴突的生长和再生[14]。这提示我们嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤中可以通过Anosmin-1蛋白注射至损伤部位，促进嗅鞘细胞迁移至神经损伤部位，形成嗅鞘细胞胶质通道，促进移植后受损神经轴突的再生。
综上所述,Anosmin-1蛋白通过FGF1型受体激活ERK1/2信号通路，从而上调N-cadherin，促进嗅鞘细胞的迁移。通过对Anosmin-1蛋白调节嗅鞘细胞生物学特性的进一步研究，可以为嗅鞘细胞用于神经再生治疗和脊髓神经损伤修复提供新思路。
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