Advances in Clinical Medicine 临床医学进展, 2021, 11(1), 165-173
Published Online January 2021 in Hans. www.hanspub/journal/acm
doi/10.12677/acm.2021.111024
缬沙坦通过Akt信号通路抑制宫颈癌Hela细胞
增殖、迁移及侵袭的研究
宗军宁1，张裕民2，谭雪莹3，李稳1，张萍1
1青岛大学附属青岛市市立医院，妇科，山东青岛
2菏泽市食品药品检验检测研究院药品所，山东菏泽
3青岛大学附属青岛市市立医院，卫生部细胞移植重点实验室，山东青岛
收稿日期：2020年12月16日；录用日期：2021年1月5日；发布日期：2021年1月20日
摘要
目的：观察血管紧张素II 1型受体拮抗剂缬沙坦(Valsartan)对宫颈癌Hela细胞的增殖、迁移及侵袭的影响及机制。方法：体外培养宫颈癌Hela细胞。采用不同浓度(0.1、1、10和100 μmol/L)的缬沙坦分别处理Hela细胞0、24、48 h，CCK-8法检测Hela细胞的增殖能力。缬沙坦(100 μmol/L)处理Hela细胞24 h 后，采用划痕愈合实验和Transwell小室侵袭实验分别检测迁移及侵袭能力，蛋白质印迹法检测缬沙坦(10和100 μmol/L)处理Hela细胞24 h后，Hela细胞中Akt、p-Akt蛋白的表达情况。随后，在Hela细胞中加入Akt激动剂预处理1 h后，再加入缬沙坦(100 μmol/L)培养Hela细胞，采用cck-8法检测Hela细胞增殖能力，采用划痕愈合实验和Transwell小室侵袭实验，检测Hela细胞的迁移和侵袭能力。结果：使用缬沙坦(10和100 μmol/L)处理Hela细胞，能够抑制Hela细胞的增殖作用(p < 0.01)，缬沙坦(100 μmol/L)处理细胞后能够明显抑制Hela细胞的迁移及侵袭能力(p < 0.01)；缬沙坦(100 μmol/L)处理过的Hela细胞中p-Akt蛋白的表达量降低(p < 0.01)。Akt激动剂减弱了缬沙坦对Hela细胞的增殖、迁移及侵袭的抑制作用。结论：缬沙坦对宫颈癌Hela细胞的增殖、迁移及侵袭能力有明显的抑制作用，这种抑制作用可能是通过抑制Akt信号通路实现的。
北京历史关键词
宫颈癌，血管紧张素受体拮抗剂，PI3K-Akt信号通路
Valsartan Inhibits Proliferation, Migration
and Invasion of Cervical Cancer Hela Cells
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through Akt Signaling Pathway
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Junning Zong1,Yuming Zhang2,Xueying Tan3,Wen Li1,Ping Zhang1
宗军宁 等
1
Department of Gynecology, Qingdao Municipal Hospital Affiliated to Qingdao University, Qingdao Shandong 2Shandong Heze Food and Drug Inspection and Rearch Institute, Heze Shandong 3Cell Laboratory of Qingdao Municipal Hospital Affiliated to Qingdao University, Qingdao Shandong
Received: Dec. 16th , 2020; accepted: Jan. 5th , 2021; published: Jan. 20th
, 2021
Abstract
Objective: To obrve the effect and mechanism of angiotensin II type 1 receptor antagonist Valsartan on the proliferation, migration and invasion of cervical cancer Hela cells. Methods: Hela cells were cultu red in vitro . Different concentrations (0.1, 1, 10, and 100 μmol/L) of valsa r-tan were ud to treat Hela cells for 0, 24, and 48 hours, respectively. The proliferation ability of Hela cells was detected by CCK -8 method. After treatment of Hela cells with v alsartan (100 μmol/L) for 24 h, the migration and invasion ability were detected by scratch healing test and transwell cell invasion te
st respectively. Western blotting was ud to detect the expression of Akt and p-Akt proteins in HeLa cells after 24 h treatment with Valsartan (10 and 100 μmol/L) Then, HeLa cells were pretreated with Akt agonist for 1 h, and then cultured with Valsartan (100 μmol/L). The proliferation ability of HeLa cells was detected by CCK -8 assay. The migration and invasion ability of HeLa cells were detected by wound -healing assay and Transwell assay . Re-sults: Treatment of Hela cells with 10 and 100 μmol/L valsartan can inhibit the proliferation of Hela cells (p < 0.01). After treatment with valsartan (100 μmol/L), cells can significantly inhibit the migration and invasion ability of Hela cells (p < 0.01); the expression of p -Akt protein in Hela cells treated with 100 μmol/L valsartan was reduced (p < 0.01). Akt agonist eliminates the inhibitory effect of valsartan on the proliferation, migration and invasion of Hela cells. Conclu-sion: Valsartan has a significant inhibitory effect on the proliferation, migration and invasion of cervical cancer Hela cells. This inhibitory effect may be achieved by inhibiting the Akt signaling pathway. Keywords
Cervical Cancer , Angiotensin Receptor Antagonist, PI3K-Akt Signaling Pathway
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Copyright © 2021 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licend under the Creative Commons Attribution International Licen (CC BY 4.0). creativecommons/licens/by/4.0/
1. 引言
升学贺词宫颈癌是危害女性身体健康的重要疾病之一，在全球妇女癌症中发病率位于第四位[1]。据统计，晚期宫颈癌5年生存率不足40% [2]。因此，寻找抑制宫颈癌增殖及早期转移的方法及可能机制，具有重要的临床意义。血管紧张素II (angiotensin II, AngII)通过与血管紧张素II 1型受体(AngII type 1 receptor AT1R)结合，上调血管内皮生长因子(VEGF)，增加MMP-2、MMP-9的表达量，激活MAPK 、PI3K/Akt 等信号通路影响肿瘤的发生与发展[3]。缬沙坦(Valsartan)是一种血管紧张素II 1型受体拮抗剂(ARBs) [4]，有学者研究发现，缬沙坦可以抑制宫颈癌细胞的增殖[5]。既往研究发现，宫颈癌患者的疾病进展和预后与Open Access
宗军宁等
郭沫若的诗PI3K-Akt信号通路的异常激活相关，发生Akt高水平的磷酸化宫颈癌患者化疗后预后较差，生存期也较短[6]。因此，本文旨在探讨缬沙坦(Valsartan)是否可以通过影响Akt、p-Akt的表达，继而影响宫颈癌Hela 细胞的增殖、转移及侵袭等生物学作用。
2. 材料与方法
2.1. 细胞、试剂及器材
人宫颈癌Hela细胞株由青岛市市立医院肝胆胰细胞实验室馈赠；缬沙坦购自大连美仑生物技术有限公
司；胎牛血清(FBS)，DMEM培养液，PBS缓冲液，0.25%胰酶-EDTA购自美国ThermoFisher公司；SDS-凝胶配制试剂盒、Akt激动剂、RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂和PVDF膜购自上海碧云天生物技术有限公司；单克隆抗体鼠抗人Akt、p-Akt及单克隆山羊抗鼠抗体(辣根过氧化物酶)购自美国CST公司；单克隆抗体鼠抗人肌动蛋白(β-action)购自美国ABcam公司，6孔板，24孔板，96孔板，25 cm2培养瓶，Transwell细胞培养插件，Matrige胶购自美国Corning公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所；倒置显微镜购自日本Nikon公司；微孔板检测系统VersaMax (酶标仪)购自美国MolecμlarDevices公司。
2.2. 实验方法
2.2.1. 细胞培养及药物配置
短款羽绒服怎么搭配好看宫颈癌Hela细胞株在含10% FBS、1%双抗(青霉素+ 链霉素)的DMEM培养液中，置于5% CO2、37℃和95%空气培养箱中孵育。每隔1~2 d传代一次，取对数生长期细胞进行实验。使用DMSO配置缬沙坦储存液，置于−80℃冰箱中保存备用，使用时用DMEM培养液稀释至合适浓度。
2.2.2. CCK-8增殖实验
取对数生长期的Hela细胞，调整每孔细胞数为5 × 103个，接种于96孔板中，待细胞贴壁。稀释缬沙坦，
终浓度分别为0.1、1、10和100 μmol/L，设置对照组(仅加入等体积DMEM培养液)。每组设置6个复孔，分别培养0、24、48 h后，每孔加入10 μLCCK-8试剂，继续孵育2 h。使用酶标仪测定450 nm 处每孔的吸光度(OD)值。
2.2.
3. 细胞划痕实验
取对数生长期Hela细胞，在6孔板中每孔接种5 × 105个Hela细胞，然后置于培养箱中过夜，使用10 μL枪头在细胞中进行划痕，PBS冲洗细胞3次。实验组每孔加入含100 μmol/L缬沙坦的DEME培养液，对照组加入等体积的DMEM培养液，每组设置3个复孔，过夜。取划痕后0 h及24 h为时间点，置于倒置光学显微镜下拍照，实验重复3次。计算划痕愈合率。划痕愈合率(%) = (0 h划痕宽度− 24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度× 100%。
2.2.4. transwell小室侵袭实验
将matrigel胶与无血清DMEM培养液以1:8的比例稀释并混匀，然后在transwell小室上室均匀平铺稀释的matrigel胶60 μL，置于培养箱中待其聚合成凝胶。取Hela细胞，实验组使用加入100 μmol/L缬沙坦的DMEM培养液培养24 h，对照组加入DMEM培养液，调整细胞浓度为1 × 105个/mL，各取100 μL 加
入transwell小室上室中，下室各加入含20% FBS的DMEM培养液600 μL。每组设置3个复孔，置于培养箱中培养24 h。取出小室，使用4%多聚甲醛固定30分钟。PBS清洗2次，使用0.1%结晶紫染色30分钟，PBS清洗3次。风干后，置于倒置光学显微镜下，随机选取5个视野拍照并计数穿过小室的细胞数。每组设置3个复孔，实验重复3次，取平均值。
宗军宁等
2.2.5. 蛋白质印迹法
冬奥运会分别用0、10、100 μmol/L的缬沙坦处理宫颈癌Hela细胞24 h后，收集各组细胞。使用RIPA裂解液冰上裂解细胞1 h，每10 min震荡混匀1次；在4℃条件下15,000 r/min离心20 min，收集上清液，获得总蛋白。采用BCA试剂盒测定总蛋白浓度。100℃沸水煮沸蛋白5 min，使其变性。待冷却后，上样，使用10%SDS-PAGE分离蛋白后进行转膜，将蛋白转移至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，TBST洗膜10 min × 3次。分别使用Akt、p-Akt及β-action一抗，4℃条件下摇床孵育过夜。TBST清洗3次，每次10 min。室温下孵育二抗2 h，充分洗涤后，滴入ECL发光液后置入暗盒中压片，并依次显影、定影。
2.3. 统计学方法
应用SPSS 22.0对实验数据进行统计学分析，结果以(均数± 标准差)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两对比采用LSD-t检验，以p < 0.05认为有统计学意义。
3. 结果
3.1. 缬沙坦对宫颈癌细胞增殖能力的抑制作用
CCK-8检测结果显示，缬沙坦对Hela细胞增殖的有抑制作用，且呈浓度依赖性，结果如图1所示，当处理24 h时，细胞OD值分别为(2.489 ± 0.082)、(2.143 ± 0.097)，48 h时分别为(3.128 ± 0.059)、(2.858 ± 0.113)，与对照组相比p值均< 0.01。
注：vs对照组，**p < 0.01
Figure 1. CCK-8 method to detect the effect of different con-
centrations of valsartan on proliferation of Hela cells
图1. CCK-8法检测不同浓度缬沙坦对Hela细胞增殖作用的
影响
3.2. 缬沙坦对Hela细胞迁移、侵袭能力的抑制作用
在划痕愈合实验中，结果如图2(a)、图2(b)所示，实验组Hela细胞迁移率为(18.13 ± 1.12)%，与对照组迁移率(36.14 ± 1.67)%相比，差别有统计学意义(p < 0.01)，表明缬沙坦具有抑制Hela细胞迁移的能力。
进一步采用Transwell侵袭实验检测缬沙坦对Hela细胞侵袭能力的影响，结果如图2(c)、图2(d)所示，100 μL缬沙坦处理Hela细胞24 h后，对照组穿过小室膜的细胞数为(335 ± 20)个，缬沙坦处理组穿过小室膜的细胞数(267 ± 15)个。与对照组相比，缬沙坦处理组穿过小室膜的细胞数明显减少，差别有
统计学意义(p < 0.01)。上述结果表明，缬沙坦对宫颈癌细胞的迁移及侵袭有明显的抑制作用。
宗军宁 等
(a) (b)
(c) (d)
注：vs 对照组，**p < 0.01
Figure 2. Effect of Valsartan (100 μmol/L) treatment on Hela cell migration and invasion after 24 h
图2. 缬沙坦(100 μmol/L )处理24 h 后对Hela 细胞迁移、侵袭能力的影响(×100)
3.3. 缬沙坦抑制Akt 信号通路的表达
采用Western blot 检测不同浓度缬沙坦(10和100 μmol/L )处理Hela 细胞24 h 后，细胞中p-Akt 的表达情况，结果如图3所示，与对照组蛋白相对表达量(2.62 ± 0.07)相比，实验组呈下降趋势，分别为2.58 ± 0.08、1.88 ± 0.05，但仅100 μmol/L 缬沙坦处理组与对照组相比，结果具有统计学意义(p < 0.05)。
(a) (b)
注：vs 对照组，**p < 0.01
Figure 3. Expression of related proteins after treatment of Hela cells with different concentrations of
valsartan
图3. 不同浓度缬沙坦处理Hela 细胞后相关蛋白的表达
